專利名稱：治療頸椎后縱韌帶骨化癥的藥物的制作方法
治療頸椎后縱韌帶骨化癥的藥物
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是關(guān)于治療頸椎后縱韌帶骨化癥的藥 物。
背景技術(shù)：
頸椎后縱韌帶骨化癥(OPLL)是指因頸椎的后縱韌帶發(fā)生骨化，從而壓迫脊髓和 神經(jīng)根，產(chǎn)生肢體的感覺和運(yùn)動(dòng)障礙及內(nèi)臟植物神經(jīng)功能紊亂的疾患。該疾病的治療包括 保守治療和手術(shù)治療。目前缺乏治療頸椎后縱韌帶骨化癥的有效藥物。研究已證實(shí)OPLL是多基因多因素疾病，但各因素的具體作用機(jī)制尚不明確。流行 病學(xué)調(diào)查顯示，II型糖尿病是OPLL發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但關(guān)于其中機(jī)制的研究很少。I型 膠原是骨組織中特異性的膠原，那么高糖是否和韌帶組織骨化有關(guān)目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種治療頸椎后縱韌帶骨化癥的藥 物。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是降低高血糖的藥物在制備治療頸椎后縱韌帶骨化癥疾病藥物中的應(yīng)用。所述的降低高血糖的藥物是通過阻止ROS、p38MAPK、PKC途徑治療頸椎后縱韌帶
骨化癥疾病。本發(fā)明采用體外培養(yǎng)大鼠頸椎后縱韌帶細(xì)胞，先用含BMP-2(500ng/ml)的培養(yǎng)基 培養(yǎng)細(xì)胞(4天)，再用含或不含高糖(25mM)的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞(4天)。使用ELISA、熒光定 量PCR、蛋白免疫印跡技術(shù)、熒光染色等方法，觀察它們對細(xì)胞早期成骨基因ALP、COLlaU OP、RUNX2的表達(dá)、PINP合成、ALP活性的影響，和對細(xì)胞ROS的產(chǎn)生、p38MAPK、PKC、ERK信 號通路的影響。結(jié)果高糖可以誘導(dǎo)大鼠脊柱韌帶細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，繼而激活PKC途徑并 促進(jìn)COLlal的表達(dá)和PINP合成，高糖還抑制了細(xì)胞p38MAPK途徑，但并不影響細(xì)胞增殖和 其它成骨基因的表達(dá)；BMP-2可以通過抑制韌帶細(xì)胞p38途徑促進(jìn)ALP、0P、RUNX2的表達(dá)并 提高ALP活性，還可以通過激活PKC途徑誘導(dǎo)COLlal的表達(dá)和PINP合成；高糖和BMP-2合 并刺激細(xì)胞，高糖可以促進(jìn)BMP-2對細(xì)胞早期成骨基因ALP、COLlal、OP、RUNX2的誘導(dǎo)，其 機(jī)制和細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，及其下游p38途徑的抑制、PKC途徑的激活有關(guān)。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明提供了降低高血糖的藥物在制備治療頸椎后縱韌帶骨化 癥疾病藥物中的應(yīng)用。由于本發(fā)明證實(shí)高糖促BMP-2誘導(dǎo)韌帶細(xì)胞早期成骨基因的信號傳 導(dǎo)途徑，從而將信號傳導(dǎo)途徑與頸椎后縱韌帶骨化癥患者的藥物治療聯(lián)系起來，可以發(fā)明 作用于這些信號傳導(dǎo)途徑的藥物來治療頸椎后縱韌帶骨化癥患者，為頸椎后縱韌帶骨化癥 患者的藥物研發(fā)和篩選(1、雙胍類降糖藥2、胰島素增敏劑3、糖苷酶抑制劑4、磺脲類降糖 藥5、非磺尿類促胰島素分泌劑這五大類口服降糖藥)提供理論依據(jù)。
圖IA 相差顯微鏡下觀察不同條件培養(yǎng)下的大鼠脊柱韌帶細(xì)胞形態(tài)(培養(yǎng)8天)， 對照組細(xì)胞，4倍光鏡。圖IB 相差顯微鏡下觀察不同條件培養(yǎng)下的大鼠脊柱韌帶細(xì)胞形態(tài)(培養(yǎng)8天)， 高糖組細(xì)胞，4倍光鏡。圖IC 相差顯微鏡下觀察不同條件培養(yǎng)下的大鼠脊柱韌帶細(xì)胞形態(tài)(培養(yǎng)8天)， BMP-2組細(xì)胞，4倍光鏡。圖ID 相差顯微鏡下觀察不同條件培養(yǎng)下的大鼠脊柱韌帶細(xì)胞形態(tài)(培養(yǎng)8天)， BMP-2合并高糖組細(xì)胞，4倍光鏡。圖IE 相差顯微鏡下觀察不同條件培養(yǎng)下的大鼠脊柱韌帶細(xì)胞形態(tài)(培養(yǎng)8天)， BMP-2合并高糖組細(xì)胞，10倍光鏡。圖2A 高糖對細(xì)胞早期成骨和BMP-2細(xì)胞骨誘導(dǎo)作用的影響。圖中數(shù)值用平均 數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示。(CTR 對照組；HIGH 高糖組；BMP BMP-2組；BMP+HIGH :BMP_2+高糖組； BMP+osmotic BMP-2+高糖滲透壓對照)，熒光定量PCR觀察細(xì)胞ALP、COLlal、OP、RUNX2的 mRNA相對表達(dá)量。圖 2B:ALP 活性。圖 2C :ELISA 測定 PINP 分泌(*p < 0. 05，和 CTR 相比較;#p < 0. 05 ；N. S.，差別不
顯著)。圖2D 葡萄糖劑量梯度研究，觀察ALP活性，圖2E :PINP分泌(CTR 對照組；4. 5 含500ng/ml BMP-2的DMEM，不另添加葡萄糖； 10-35 :BMP-2+ 高糖組，分別含 10_35mM 葡萄糖)(*p < 0. 05，和 CTR 相比較·’#ρ < 0. 05，和 4. 5組相比較)。圖2F 各刺激因素培養(yǎng)4天后的細(xì)胞計(jì)數(shù)圖2G =MTT顯示細(xì)胞活性(*ρ < 0. 05，和CTR相比較；N. S.，差別不顯著)。圖2Η 熒光定量PCR觀察滲透壓對照組細(xì)胞ALP、COLlal、OP、RUNX2的mRNA相對
表達(dá)量。圖3A 熒光顯微鏡下觀察不同條件培養(yǎng)下大鼠脊柱韌帶細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生(培養(yǎng) 8天)，熒光顯微鏡下顯示細(xì)胞內(nèi)ROS (DCF綠色熒光)，細(xì)胞核復(fù)染(DAPI藍(lán)色熒光)，對照 組，10倍光鏡。圖3E 高糖組，10倍光鏡。圖3G :BMP-2合并高糖組，10倍光鏡。圖4A =ROS對高糖促BMP-2細(xì)胞骨誘導(dǎo)作用的影響。在換用各刺激因素培養(yǎng)的同 時(shí)，加入 0. 5mM H202 或 0. ImM NAC。(CTR 對照組；HIGH 高糖組；BMP BMP-2 組；BMP+HIGH BMP-2+ 高糖組；NO 不添加 H202 或 NAC ；PLUS NAC 添加 NAC ；PLUS H202 添加 H202)，熒光 定量PCR觀察細(xì)胞ALP的mRNA相對表達(dá)，圖中數(shù)值用平均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示。圖4B 熒光定量PCR觀察細(xì)胞COLlal的mRNA相對表達(dá)。圖4C 熒光定量PCR觀察細(xì)胞OP的mRNA相對表達(dá)。圖4D 熒光定量PCR觀察細(xì)胞RUNX2的mRNA相對表達(dá)。圖5A :p38MAPK、PKC、ERK1/2信號通路對高糖促BMP-2細(xì)胞骨誘導(dǎo)作用的影響。正常培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞4天后，在換用各刺激因素培養(yǎng)之前1小時(shí)加入p38MAPK、PKC、ERKl/2 信號通路的特異性抑制劑(NO 不添加抑制劑或激動(dòng)劑；GF :5000nM GF109203X ；PD :5000nM PD98059 ；SB :10000nMSB203580)，熒光定量PCR觀察細(xì)胞 ALP 的 mRNA相對表達(dá)(*p < 0. 05, 和相同培養(yǎng)條件下的NO相比較)。圖中數(shù)值用平均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示。圖5B 熒光定量PCR觀察細(xì)胞COLlal的mRNA相對表達(dá)。圖5C 熒光定量PCR觀察細(xì)胞OP的mRNA相對表達(dá)。圖5D 熒光定量PCR觀察細(xì)胞RUNX2的mRNA相對表達(dá)。圖 5E 添加 p38MAPK、PKC 信號通路的特異性激動(dòng)劑(PMA =IOOOOnMPMA ；P79350 50000nM Ρ79350)，觀察 ALP 活性。圖5F 觀察PINP分泌。圖6Α 高糖對細(xì)胞p38MAPK、PKC信號通路的影響。換用各刺激因素培養(yǎng)30分 鐘后，取細(xì)胞蛋白裂解液，Western blot分析添加各刺激因素對p38磷酸化的影響(*p < 0. 05，和 CTR 相比較;#p < 0. 05)。圖6B =Western blot分析添加高糖至BMP-2后不同時(shí)間(5_45分鐘)細(xì)胞p38磷 酸化的情況(*Ρ < 0. 05，各時(shí)間點(diǎn)相互比較)。圖6C =Western blot分析添加各刺激因素對PKC磷酸化的影響(*p < 0. 05，和CTR 相比較；#P < 0. 05)。圖6D =Western blot分析添加高糖至BMP-2后不同時(shí)間(5-45分鐘)細(xì)胞PKC 磷酸化的情況(*P < 0. 05，各時(shí)間點(diǎn)相互比較)。(CTR 對照組；HIGH :25mM葡萄糖；BMP 500ng/ml BMP-2 ；BMP+HIGH :500ng/ml BMP_2+25mM 葡萄糖)圖中數(shù)值用平均數(shù) 士 標(biāo)準(zhǔn)差表不。圖7A :R0S對P38、PKC信號傳導(dǎo)通路的影響。高糖合并BMP-2組內(nèi)加入0. ImM NAC, 30分鐘后取細(xì)胞蛋白裂解液，Western blot分析添加NAC對p38磷酸化的影響(*p < 0. 05， 禾口 BMP+HIGH相比較)。圖 7B =Western blot 分析添加 NAC 對 PKC 磷酸化的影響(*p < 0. 05，和 BMP+HIGH 相比較)。圖中數(shù)值用平均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示。圖8 高糖促BMP-2誘導(dǎo)韌帶細(xì)胞早期成骨基因的信號傳導(dǎo)途徑。
具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作詳細(xì)說明。實(shí)施例細(xì)胞培養(yǎng)上海交通大學(xué)動(dòng)物研究委員會(huì)批準(zhǔn)本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)計(jì)劃，本研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與上 海交通大學(xué)動(dòng)物研究大綱相符合。取3月齡的雄性Sprague-Dawley大鼠采用靜脈注射 戊巴比妥鈉(150mg/kg)致死。在無菌條件下取其頸椎(頸2-頸7)的后縱韌帶，去掉韌 帶與骨的連接部分。所取組織用PBS沖洗三遍，用無菌剪剪成約lmm2的組織塊鋪于有少 量DMEM及10%的FBS (Sigma)、0.2mM抗壞血酸的35mm培養(yǎng)皿(Corning)內(nèi)，并置于培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)(5% CO2, 370C )。等待細(xì)胞由組織塊爬出并生長至匯合后，用0. 25%胰酶和ImM EDTA(Sigma)消化細(xì)胞并傳代至60mm培養(yǎng)皿。第2 5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。傳代細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)前先在相差顯微鏡下觀察并確認(rèn)其有同原代細(xì)胞相似的細(xì)胞形態(tài)。將實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞以IO5/孔密度接種于12孔培養(yǎng)板內(nèi)，12小時(shí)后換0. 5% FBS的DMEM 靜止細(xì)胞(含0. 2mM抗壞血酸)。12小時(shí)后更換新鮮的10% FBS的DMEM(含0. 2mM抗壞 血酸)，添加或不添加500ng/ml BMP-2,培養(yǎng)四天(第二天換相同培養(yǎng)基一次)。吸盡原培 養(yǎng)基，然后PBS沖洗，再換為含有以下添加物(終濃度)的新鮮10% FBS的DMEM (含0. 2mM 抗壞血酸，ICT7M地塞米松)培養(yǎng)四天(l)10、15、20、25、30、35mM D-葡萄糖；(2) 5. 6mM D-葡萄糖加19. 4mM甘露醇(25mM D-葡萄糖滲透壓對照)；(3) 0. 5mM H2O2或0. ImM NAC (N-acetylcysteine) (Sigma) ； (4) 5000nM PKC 抑制劑 GF109203X 或 5000nM ERK1/2 抑 制劑 PD98059 或 IOOOOnM p38MAPK 抑制劑 SB203580 或 IOOOOnM PKC 激動(dòng)劑 PMA 或 50000nM p38 MAPK 激動(dòng)劑 P79350 (Gibical 或 Cell Signaling Technology)，以上信號傳導(dǎo)通路抑 制劑或激動(dòng)劑在葡萄糖、H2O2或NAC添加前1小時(shí)添加。對照組細(xì)胞整個(gè)培養(yǎng)過程只用正 常培養(yǎng)基(10% FBS的DMEM，含0. 2mM抗壞血酸，葡萄糖濃度為4. 5mM)且不添加任何其它 因素。最后收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清和細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)測試。細(xì)胞增殖測定按上述方式培養(yǎng)(添加或不添加500ng/ml BMP-2)細(xì)胞四天后，將細(xì)胞以IO3/孔 種植于96孔培養(yǎng)板，含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基同步化細(xì)胞，然后換為含或不含25mM葡萄糖的培 養(yǎng)基(不含血清)繼續(xù)培養(yǎng)4天，再進(jìn)行細(xì)胞增殖測定。首先采用細(xì)胞直接計(jì)數(shù)法，計(jì)數(shù)前 先用胎盤蘭染色，再用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)不含染料的細(xì)胞數(shù)。另外，用MTT法測定細(xì)胞的生 長活性，具體步驟參考MTT試劑盒說明(Roche)在相應(yīng)的細(xì)胞孔內(nèi)加入終濃度為lmg/ml 的MTT，37°C孵育4小時(shí)后孔內(nèi)出現(xiàn)結(jié)晶，再加入0. 15ml 二甲基亞砜充分溶解結(jié)晶，立即在 酶標(biāo)儀上測定570nm的吸光度。每組樣本設(shè)12個(gè)復(fù)孔，取測量結(jié)果的平均值，用平均數(shù)士 標(biāo)準(zhǔn)差表示。酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)收集按上述方式培養(yǎng)的細(xì)胞(培養(yǎng)8天)培養(yǎng)液上清(含中間的換液)用ELISA 試劑盒(Takara)測定細(xì)胞分泌的I型膠原氨基端肽(PINP)。其OD值用細(xì)胞總蛋白的量 校正(單位ng PINP/ng細(xì)胞總蛋白)，每個(gè)樣本設(shè)6個(gè)復(fù)孔，測量結(jié)果取平均值，用均數(shù)士 標(biāo)準(zhǔn)差表示。堿性磷酸酶活性測定(ALP)取上述方式培養(yǎng)8天的細(xì)胞，用0.9% NaCl(含Triton X-100)溶解細(xì)胞， 并離心取上清液用于ALP活性測定。1個(gè)單位酶活性等于30分鐘產(chǎn)生lnmol P-硝基酚。 Bradford法測定蛋白含量，以校正各自樣本的ALP活性單位，即單位是U/gprotein。每組 樣本設(shè)6個(gè)復(fù)孔，取測量結(jié)果的平均值，用平均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示?；钚匝?ROS)檢測取上述方式培養(yǎng)8天的細(xì)胞，用活性氧檢測試劑盒(Sigma)檢測細(xì)胞內(nèi)的活 性氧。按說明操作如下去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入Iml 1 1000用無血清培養(yǎng)液稀釋的 DCFH-DA (終濃度為ΙΟΟΟΟηΜ)，避光，37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。用無血清細(xì)胞培養(yǎng) 液洗滌細(xì)胞三次，再用4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(4，6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride,DAPI)復(fù)染細(xì)胞核，立即在熒光顯微鏡下觀察，并用熒光分光光度計(jì)測定 熒光強(qiáng)度。DCFH被ROS氧化為DCF，熒光光譜同F(xiàn)ITC，488nm激發(fā)波長，525nm發(fā)射波長，顯綠色熒光；DAPI激發(fā)波長360nm，發(fā)射波長490nm，顯藍(lán)色熒光。陽性對照采用試劑盒提供 的試劑Rosup(l 1000，刺激20分鐘)。熒光定量PCR (real time PCR)用熒光定量PCR測定細(xì)胞內(nèi)ALP、COLlaU OP、Runx2、GAPDH的基因表達(dá)。細(xì)胞總 RNA的抽提使用異硫氰酸胍/苯酚法。提取的總RNA純度和完整性分別通過分光光度計(jì)和 瓊脂糖凝膠電泳鑒定?？俁NA中mRNA的反轉(zhuǎn)錄使用PrimeScript RT-PCR Kit (Takara)。 雙鏈DNA的擴(kuò)增使用SYBR Premix Ex Taq (Takara)。引物根據(jù)GenBank的基因序列使用 Oligo 4. O (National Biosciences, Inc.)設(shè)計(jì)如下=COLlal :5，-CTCAGCCCTCTGTGCCT-3，， 5 ‘ -AACCTTCGCTTCCATACTC-3' ；ALP 5‘ -GGCT CTG CCGTTGTTT C-3 ‘， 5’ -GGGTTGGGTTGAGGGACT-3’ ；0P :5’ -CAGTATCCCGATGCCACA-3’，5’ -TCCTGGAAGCCAATGTG-3’ ； Runx2 5' -TAAATACGCAGCAGACCG-3 ‘ , 5' -CAGCACCCTCCATCACTT-3 ‘ ；GAPDH 5，-GCAAGTTCAACGGCACAG-3，，5，-GCCAGTAGACTCCACGACAT-3，。并由上海生物工程公司合 成。擴(kuò)增反應(yīng)在LightCycler (Roche Diagnostics)中進(jìn)行，反應(yīng)步驟95°C，10秒，1次循 環(huán)；95°C，5秒，60°C，20秒，共20次循環(huán)；然后溶解曲線分析。各基因mRNA相對表達(dá)量采用 2-ΔΔετ計(jì)算法，用各樣本的GAPDH的表達(dá)作內(nèi)源性看家基因，用以標(biāo)準(zhǔn)化樣本。六次獨(dú)立實(shí) 驗(yàn)的測量結(jié)果取平均值，用平均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示。免疫蛋白印跡分析(Western blotting analysis)采用免疫蛋白印跡分析測定細(xì)胞PKC、ERK、p38蛋白磷酸化。用裂解液(50mMTris， pH7. 4，150mM氯化鈉，ImM EDTA, 1 % Triton X-100，10 %甘油)裂解細(xì)胞提取總蛋白， IOOOOg離心10分鐘，取上清液。Bradford法測定蛋白含量。取50yg細(xì)胞總蛋白于 SDS-PAGE中電泳，然后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。按1 1000濃度稀釋PKC抗體、磷酸化PKC 抗體(pan) (zeta Thr410) (190D10)、p38 抗體(Thrl80/Tyrl82)、磷酸化 p38 抗體(Thrl80/ Tyrl82) (3D7) (Cell Signaling Technology)孵育硝酸纖維素膜1小時(shí)，4°C過夜。再用辣 根過氧化酶標(biāo)記的抗兔二抗或抗小鼠二抗(1 1000稀釋)孵育硝酸纖維素膜，室溫2小 時(shí)。ECL(Pierce)發(fā)光自顯影，用ImageMaster VDS成像分析系統(tǒng)行條帶光密度檢測。取六 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的測量結(jié)果取平均值，用平均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示。各組之間比較用單因素方差分析(one-way AN0VA) (Newman-Keuls檢驗(yàn))，不同刺激條件為單因素，或用Kruskal Wallis檢驗(yàn)。所有統(tǒng) 計(jì)學(xué)分析用SPSS 11. 5軟件，P < 0. 05為差異有顯著性。結(jié)果細(xì)胞形態(tài)觀察正常培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞4天后，換為各條件培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4天，然后在相差顯微鏡 下觀察細(xì)胞形態(tài)。對照組大鼠頸椎后縱韌帶細(xì)胞和添加25mM葡萄糖后細(xì)胞形態(tài)多為典型 的成纖維細(xì)胞樣(紡錘樣或梭形)(圖1A、圖1B)，添加500ng/ml BMP-2或BMP-2合并25mM 葡萄糖后細(xì)胞形態(tài)多為三角形或多角形，呈聚集性生長(圖1C、圖1D、圖1E)。高糖對細(xì)胞早期成骨生化指標(biāo)和BMP-2細(xì)胞骨誘導(dǎo)作用的影響和對照組相比較，高糖培養(yǎng)的細(xì)胞的I型膠原的表達(dá)、合成增加(圖2A、C)，但并 未發(fā)現(xiàn)有早期成骨基因ALP、C0Llal、0P、RunX2的表達(dá)(圖2A)。而BMP-2培養(yǎng)組細(xì)胞的早期成骨基因ALP、COLlaU OP、Runx2的表達(dá)以及ALP活性和PINP分泌有明顯增加(圖2A、 B、C)。其中高糖組和BMP-2組細(xì)胞I型膠原的表達(dá)、合成無明顯差別(圖2A、C)。當(dāng)換為 BMP-2合并葡萄糖培養(yǎng)時(shí)，和BMP-2單獨(dú)培養(yǎng)相比較，細(xì)胞早期成骨基因ALP、COLlal、0P、 Runx2的表達(dá)和ALP活性、PINP分泌都有明顯的提高(圖2A、B、C)，其中ALP表達(dá)約增加 85%,C0Llal54%,0P 83%,Runx2 75%, ALP 活性 73%，PINP 分泌 37% ；并且和對照組比， BMP-2合并葡萄糖對COLlal表達(dá)(715% ) ,PINP分泌(700% )的促進(jìn)要明顯強(qiáng)于BMP-2組 (216% )或葡萄糖組(200% )(圖2A、C)。以上結(jié)果說明添加高濃度(25mM)葡萄糖只影響 細(xì)胞的I型膠原的表達(dá)、合成，不影響其它早期成骨基因的表達(dá)，但對BMP-2對脊柱韌帶細(xì) 胞早期成骨基因的誘導(dǎo)有明顯的促進(jìn)作用。預(yù)試驗(yàn)顯示大于50mM的高糖刺激會(huì)由于過高的滲透壓使細(xì)胞破裂(資料未顯 示)，而DMEM (Sigma)培養(yǎng)基含葡萄糖4. 5mM，所以我們在BMP-2組添加10 35mM葡萄糖作 劑量梯度研究。結(jié)果顯示，同BMP-2組比較，在含BMP-2的培養(yǎng)基中添加15mM葡萄糖即可 明顯促進(jìn)細(xì)胞ALP活性(增加14%)，添加25mM葡萄糖時(shí)促進(jìn)作用達(dá)到高峰(73%)，添加 30或35mM時(shí)促進(jìn)作用有所下降(66%，56% )(圖2D)；對于細(xì)胞PINP分泌，在含BMP-2的 培養(yǎng)基中添加10 35mM葡萄糖時(shí)，促進(jìn)PINP分泌的作用高峰出現(xiàn)在30mM時(shí)(增加47% ) (圖2E)。以上結(jié)果說明在一定濃度內(nèi)(10 35mM)的葡萄糖會(huì)促進(jìn)BMP-2對脊柱韌帶細(xì) 胞早期成骨基因的誘導(dǎo)作用，這種促進(jìn)作用隨濃度增高而增加。因?yàn)樘砑?5mM葡萄糖對 BMP-2的成骨誘導(dǎo)作用促進(jìn)明顯，為方便研究我們在后續(xù)試驗(yàn)中都選用25mM葡萄糖作為高 濃度葡萄糖。同時(shí)我們又觀察了高糖對細(xì)胞增殖的影響，根據(jù)細(xì)胞直接計(jì)數(shù)和細(xì)胞增殖活性結(jié) 果顯示，高糖并不影響細(xì)胞增殖，也不影響B(tài)MP-2的促細(xì)胞增殖作用(圖2F、G)。這說明高 糖的促BMP-2細(xì)胞骨誘導(dǎo)作用同細(xì)胞數(shù)量無關(guān)，它是加強(qiáng)了單個(gè)細(xì)胞的成骨分化而不是增 加了有成骨分化趨勢的細(xì)胞的數(shù)量。以往研究表明高糖常會(huì)通過滲透壓作用影響細(xì)胞，所 以我們用滲透壓對照作對比，觀察發(fā)現(xiàn)同25mM葡萄糖等滲的培養(yǎng)基并不影響B(tài)MP-2的骨誘 導(dǎo)作用(圖2H)，說明高糖的促BMP-2細(xì)胞骨誘導(dǎo)作用同滲透壓無關(guān)。ROS在高糖促BMP-2細(xì)胞骨誘導(dǎo)作用中的機(jī)制高濃度葡萄糖常會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生R0S，所以我們觀察了高糖對脊柱韌帶細(xì)胞ROS 產(chǎn)生的影響。根據(jù)熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)正常培養(yǎng)基和500ng/ml BMP-2幾乎不誘導(dǎo)細(xì)胞 產(chǎn)生R0S(圖3A，圖4A)，而25mM葡萄糖明顯引起細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生(圖3E，圖4A)；同樣 BMP-2合并高糖組細(xì)胞內(nèi)也有明顯的ROS產(chǎn)生(圖3G，圖4A)，和高糖組細(xì)胞相比ROS的強(qiáng) 度無明顯差別(圖4A)。這說明高濃度葡萄糖可以刺激韌帶細(xì)胞產(chǎn)生R0S，BMP-2合并高糖 組ROS的產(chǎn)生和高糖有關(guān)，而和BMP-2無關(guān)。接下來我們探討高糖誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS是否和高糖促BMP-2細(xì)胞骨誘導(dǎo)作 用有關(guān)。在換用各刺激因素培養(yǎng)的同時(shí)，我們加入了 ROS激發(fā)劑0.5mM H2O2或ROS抑制劑 0. ImM NAC0根據(jù)文獻(xiàn)上述劑量的H202、NAC既可以有效地模擬或抑制25mM葡萄糖激發(fā)細(xì)胞 產(chǎn)生的R0S，又不會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。然后我們觀察添加或不添加這些H202、NAC對細(xì)胞成 骨早期基因表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加NAC后顯著抑制了高糖合并BMP-2組細(xì)胞ALP、0P、 RUNX2和COLlal表達(dá)(圖4B、C、D、E)，也顯著抑制了高糖組細(xì)胞COLlal的表達(dá)(圖4C)， 而對BMP-2組細(xì)胞基因表達(dá)無影響。這說明ROS在高糖促進(jìn)細(xì)胞I型膠原和促進(jìn)BMP-2的細(xì)胞骨誘導(dǎo)作用中起重要作用，而和單獨(dú)BMP-2的細(xì)胞骨誘導(dǎo)作用無關(guān)。添加H2O2后，明顯促進(jìn)了 BMP-2組細(xì)胞ALP、OP、RUNX2和COLlal的表達(dá)(圖4B、 C、D、E)，這說明H2O2可以模擬高糖促BMP-2的細(xì)胞骨誘導(dǎo)作用。結(jié)果還顯示H2O2促進(jìn)了對 照組COLlal表達(dá)(圖4C)，說明H2O2也可以模擬高糖促細(xì)胞I型膠原合成的作用。另外我 們還注意到，添加H2O2后仍能明顯提高BMP-2合并高糖組細(xì)胞的ALP、OP、RUNX2和COLlal 的表達(dá)(圖4B、C、D)，這一現(xiàn)象提示H2O2對高糖的促BMP骨誘導(dǎo)作用有協(xié)同促進(jìn)作用，也就 是說H2O2和高糖可能通過同一途徑增強(qiáng)了 BMP對韌帶細(xì)胞的骨誘導(dǎo)作用。綜合添加ROS激 發(fā)劑、抑制劑的研究結(jié)果顯示，高糖是通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)源性ROS而促進(jìn)細(xì)胞I型膠原合成、 促BMP-2的細(xì)胞骨誘導(dǎo)作用。p38、PKC信號傳導(dǎo)通路在高糖促BMP-2細(xì)胞骨誘導(dǎo)作用中的機(jī)制為進(jìn)一步探討高糖促BMP-2細(xì)胞骨誘導(dǎo)的機(jī)制，我們選擇了和高糖關(guān)系密切的信 號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路P38MAPK、PKC、ERK1/2進(jìn)行研究。在換用各刺激因素培養(yǎng)之前1小時(shí)分別加 入 5000nM PKC 抑制劑 GF109203X、5000nM ERK1/2 抑制劑 PD98059、IOOOOnM p38MAPK 抑制 劑SB203580，觀察它們對細(xì)胞成骨早期基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，SB203580顯著促進(jìn)了 BMP-2組或高糖合并BMP-2培養(yǎng)組細(xì)胞ALP、OP、RUNX2的表達(dá)(圖5A、C、D)，提示p38MAPK 通路的抑制在BMP-2單獨(dú)誘導(dǎo)或高糖促BMP-2誘導(dǎo)細(xì)胞的ALP、OP、RUNX2基因表達(dá)中有重 要作用；而GF109203X則顯著抑制了高糖組、BMP-2組和高糖合并BMP-2組細(xì)胞COLlal的表 達(dá)(圖5B)，提示PKC通路的激活在高糖或BMP-2單獨(dú)誘導(dǎo)、高糖促BMP-2誘導(dǎo)細(xì)胞COLlal 的表達(dá)中都起著重要作用。而PD98059對各組細(xì)胞的上述基因表達(dá)無明顯影響(圖5A、B、 C、D)，說明ERK1/2途徑可能沒有參與到高糖和BMP-2誘導(dǎo)脊柱韌帶細(xì)胞早期成骨基因表達(dá) 機(jī)制中。我們接著通過免疫印跡技術(shù)觀察了各刺激組細(xì)胞內(nèi)p38MAPK、PKC蛋白的磷酸化 情況。發(fā)現(xiàn)BMP-2組和高糖組細(xì)胞p38的磷酸化都被顯著抑制了，而高糖合并BMP-2組p38 的磷酸化抑制更加明顯(圖6A)，說明高糖和BMP-2都能抑制p38途徑，而當(dāng)兩者共同作用 時(shí)則協(xié)同強(qiáng)化了對P38途徑的抑制。因?yàn)锽MP-2通過抑制p38促進(jìn)ALP、OP、RUNX2表達(dá)， 所以當(dāng)兩者共同作用時(shí)高糖對P38的協(xié)同抑制明顯的促進(jìn)了 BMP-2對ALP、OP、RUNX2基因 的誘導(dǎo)。同時(shí)我們對高糖合并BMP-2組不同時(shí)間點(diǎn)(添加高糖至BMP-2后5、15、30、45分 鐘)細(xì)胞P38蛋白磷酸化的抑制作了觀察，發(fā)現(xiàn)其抑制隨時(shí)間逐漸增強(qiáng)(圖6B)。對于PKC 途徑，我們發(fā)現(xiàn)BMP-2組、高糖組和高糖合并BMP-2組PKC的磷酸化都明顯增強(qiáng)，其中高糖 合并BMP-2組PKC磷酸化最顯著(圖6C)，這說明高糖、BMP-2都通過激活PKC促進(jìn)COLlal 表達(dá)，而當(dāng)兩者共同作用時(shí)疊加了對PKC的活化作用，從而增強(qiáng)了 BMP-2誘導(dǎo)細(xì)胞COLlal 的表達(dá)。對不同時(shí)間點(diǎn)(添加高糖至BMP-2后5、15、30、45分鐘)的細(xì)胞蛋白提取液作蛋 白印跡發(fā)現(xiàn)，PKC磷酸化隨時(shí)間逐漸增強(qiáng)，刺激后30分鐘時(shí)磷酸化最明顯(圖6D)。我們又用p38MAPK激動(dòng)劑P79350和PKC激動(dòng)劑PMA進(jìn)一步驗(yàn)證p38、PKC途徑在 高糖促BMP-2細(xì)胞骨誘導(dǎo)機(jī)制中的作用。在換用各刺激因素培養(yǎng)之前1小時(shí)加入PMA或 P79350，觀察它們對細(xì)胞成骨早期基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，P79350顯著抑制了 BMP-2 組、高糖合并BMP-2組細(xì)胞ALP活性(圖5E)，從而進(jìn)一步證明了 p38途徑的抑制是BMP-2 細(xì)胞骨誘導(dǎo)作用中的關(guān)鍵機(jī)制，而高糖正是通過加強(qiáng)對此途徑的抑制才促進(jìn)了 BMP-2的骨 誘導(dǎo)作用；而PMA顯著促進(jìn)了所有培養(yǎng)組細(xì)胞的PINP分泌(圖5F)，這一結(jié)果進(jìn)一步說明PKC途徑的激活是脊柱韌帶細(xì)胞I型膠原分泌的關(guān)鍵機(jī)制，高糖正是通過誘導(dǎo)PKC的活化才 促進(jìn)了 BMP-2對細(xì)胞I型膠原分泌。ROS對P38、PKC信號傳導(dǎo)通路的影響在研究了 ROS、P38、PKC在高糖促BMP-2細(xì)胞骨誘導(dǎo)機(jī)制中的作用后，我們又初步 探討了 ROS、P38、PKC之間的關(guān)系。免疫印跡結(jié)果顯示，添加NAC可以逆轉(zhuǎn)高糖合并BMP-2 組細(xì)胞P38磷酸化的抑制(圖7A)，可以抑制高糖合并BMP-2組細(xì)胞PKC的磷酸化(圖7B)。 據(jù)此我們可以推斷高糖誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的ROS激活了其下游的PKC途徑而抑制了 p38途徑， 從而促進(jìn)了 BMP-2的促細(xì)胞早期成骨基因的表達(dá)。根據(jù)本試驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)高糖可以誘導(dǎo)大鼠脊柱韌帶細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，繼而激 活PKC途徑以促進(jìn)COLlal的表達(dá)和I型膠原合成，高糖還抑制了細(xì)胞p38MAPK途徑，但并 不影響細(xì)胞增殖和其它成骨基因的表達(dá)；BMP-2可以通過抑制韌帶細(xì)胞p38途徑促進(jìn)ALP、 0P、RUNX2的表達(dá)，還可以通過激活PKC途徑誘導(dǎo)COLlal的表達(dá)；我們還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)高糖可 以通過細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，及其下游P38途徑的抑制、PKC途徑的激活，促進(jìn)BMP-2對細(xì) 胞早期成骨基因ALP、COLlaUOP, RUNX2的誘導(dǎo)(見圖8)。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為 本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
降低高血糖的藥物在制備治療頸椎后縱韌帶骨化癥疾病藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的降低高血糖的藥物是通過阻止 ROS、p38MAPK、PKC途徑治療頸椎后縱韌帶骨化癥疾病。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明提供了降低高血糖的藥物在制備治療頸椎后縱韌帶骨化癥疾病藥物中的應(yīng)用。由于本發(fā)明證實(shí)高糖促BMP-2誘導(dǎo)韌帶細(xì)胞早期成骨基因的信號傳導(dǎo)途徑，從而將信號傳導(dǎo)途徑與頸椎后縱韌帶骨化癥患者的藥物治療聯(lián)系起來，可以發(fā)明作用于這些信號傳導(dǎo)途徑的藥物來治療頸椎后縱韌帶骨化癥患者，為頸椎后縱韌帶骨化癥患者的藥物研發(fā)和篩選提供理論依據(jù)。
文檔編號A61P19/00GK101884790SQ20091005137
公開日2010年11月17日 申請日期2009年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月15日
發(fā)明者戴力揚(yáng), 李海 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院