專利名稱：4-[(3-{[(2-萘氧代)乙?；鵠亞肼}正丁酰)胺]苯甲酰胺的藥物應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種具有抗HIV活性的小分子化合物在制備抗艾 滋病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人類免疫缺陷病毒(hiv)是一類特殊的逆轉(zhuǎn)錄病毒。它具有高度的變異性，能特 異地感染并殺傷主要免疫細(xì)胞群，能誘生增強(qiáng)性抗體。近年來，由于對hiv感染的發(fā)病原因 有了更多的了解，人們研制了新的更有效的藥物，如蛋白酶抑制劑(Pi)和非核苷類逆轉(zhuǎn)錄 酶抑制劑(nnrti)。常用的抗hiv藥物作用機(jī)制及應(yīng)用簡述如下。一、蛋白酶抑制劑蛋白酶抑制劑pi的作用機(jī)制蛋白酶對于gag，gagpol多聚蛋白和翻譯后加工、 形成病毒核心的結(jié)構(gòu)蛋白以及其他基本的酶類，都是十分必要的。hiv病毒進(jìn)入血液后，病 毒表面的包膜蛋白gpl20和cd+4t淋巴細(xì)胞表面的cd4受體結(jié)合，在gp41透膜蛋白的作用 下，侵入細(xì)胞并脫殼。Pi通過結(jié)合到病毒的蛋白酶上，使病毒蛋白的長鏈不能裂開，病毒便 不能發(fā)育成熟以至不再具有感染能力。Pi的臨床應(yīng)用現(xiàn)在應(yīng)用于臨床的Pi主要有沙奎 那韋、茚地那韋、利托那韋、奈非那韋、安普那韋、替普那韋。還有一種新藥bms232632正在 進(jìn)行臨床試驗，它是具有二芳香取代基的氮雜二肽藥物。二、核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑nrti的作用機(jī)制此類藥是臨床應(yīng)用種類最多的一類，大 約有9種，包括azt，3tc、去羥肌苷(didanosine，ddi)、扎西他濱(zalcitabine，ddc)、司他 夫定(stavudine，d4t)、阿巴卡韋(abacavir)、阿迪佛韋(adefovirdipivoail，pmea)、替諾 佛韋(tenofovir, pmpa)及氟代拉米夫定(ftc)等。azt、ddc、ddi、d4t、3tc 及 ftc 均為雙 脫氧核苷(ddns)，它們對hiv-Ι復(fù)制的抑制是通過模擬核酸以阻止病毒dna雙鏈的復(fù)制，對 病毒而言，它們?nèi)狈Ρ匾幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)而不能連接后面的核酸。azt和d4t是病毒核酸天然底 物脫氧胸苷dt的類似物；ddc，3tc和ftc是脫氧胞苷dc的類似物；ddi在吸收及磷酸化前 轉(zhuǎn)換成雙脫氧胸苷dda，因此可視為脫氧腺苷da類似物，這些雙脫氧核苷三磷酸鹽是hiv-1 逆轉(zhuǎn)錄酶競爭抑制劑。pmea.pmpa為無環(huán)的核苷酸鹽化合物，它們也是通過未成熟病毒dna 鏈的終結(jié)來抑制病毒復(fù)制。此外，pmea還有免疫調(diào)節(jié)活性，如激活自然殺傷細(xì)胞(nk)和誘 生干擾素的作用。阿巴卡韋通過獨特的細(xì)胞途徑磷酸化為羥基環(huán)化三磷酸鳥苷，后者可終 止病毒dna復(fù)制。三、非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑rmrti的作用機(jī)制此類藥物主要有奈韋拉平 (nevirapine)、地拉韋啶(delavirdine)和依法韋司(efavirens)。它們與核苷類似物不 同，是作用于酶本身，它們能結(jié)合到病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的活性點，通過抑制酶，阻止病毒復(fù)制到 dna。在其活化過程中不涉及細(xì)胞內(nèi)的磷酸化過程，因而能更有效、更迅速地發(fā)揮抗病毒作用，其有效指數(shù)可達(dá)1000以上。nnrti的臨床應(yīng)用此類藥因誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥株的速度很快，具有交叉耐藥性，不單 一治療，應(yīng)與其他的抗逆轉(zhuǎn)錄酶病毒藥聯(lián)合使用，治療hiv-Ι感染。在聯(lián)合用藥和短期使 時rmrti在下列情況下具有較好的效果阻止母嬰傳播；接觸者的預(yù)防；急性hiv感染的治療。四、其他藥物高效抗逆轉(zhuǎn)錄酶病毒治療(haart)能抑制hiv感染者的hiv病毒的復(fù)制，以及恢 復(fù)其免疫功能，但hiv-Ι病毒還是能存在于循環(huán)系統(tǒng)和剩余的cd4t細(xì)胞中。近年的研究證 明在haart中聯(lián)用免疫治療能加強(qiáng)t細(xì)胞的反應(yīng)。在某些病例中，停止使用常規(guī)的抗hiv 感染藥后，仍保持對hiv進(jìn)行免疫控制。而免疫治療的目標(biāo)是消除被hiv感染的寄生組織。 基于免疫的治療措施包括同種異體或同基因骨髓移植、淋巴細(xì)胞輸注、治療疫苗與細(xì)胞因 子輸注等幾種措施的聯(lián)合應(yīng)用。早期治療除短暫的遲發(fā)型超敏反應(yīng)增強(qiáng)外，并未發(fā)現(xiàn)其他 對臨床有益的證據(jù)，但在haart時代，基于免疫的多種治療措施可望改變疾病的進(jìn)程?，F(xiàn)在，在細(xì)胞因子治療中，研究最多的是白細(xì)胞介素2 (il-2)，它可活化t細(xì)胞分 泌，調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞增殖和成熟。在治療疫苗中，研究最廣的是疫苗remime，它是缺損膜蛋白的滅活全病毒疫苗，目 的在于刺激免疫系統(tǒng)殺傷hiv感染的細(xì)胞。聯(lián)合用藥比單一用藥療效更明顯，這是公認(rèn)的。目前用得最多的是多藥聯(lián)用的雞 尾酒療法，典型的抗aids方案現(xiàn)在至少有3個藥組成一至兩種pi或一種rmrti，與兩種 核苷類似物聯(lián)合應(yīng)用。從cd4淋巴細(xì)胞計數(shù)的提高與抑制病毒復(fù)制兩方面看，三重治療優(yōu) 于雙重治療?？筯iv感染藥的研究、臨床應(yīng)用取得的進(jìn)展，對aids的控制和治療具有重大 意義，但是即使是使用最有效的治療方案，其治療愈只占治療人數(shù)的20% 50%，療效不 佳。另外，病毒耐藥性與耐藥病毒變異的情況越來越多，因此需進(jìn)一步研究新藥及探討更好 的治療方案。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供具有抗HIV活性的小分子化合物在制備抗艾滋病藥物中的應(yīng)用。具體涉及4-[(3-{[(2-萘氧代)乙?；鵠亞胼}正丁酰)胺]苯甲酰胺在制備抗 艾滋病藥物中的應(yīng)用。該抗艾滋病藥物可以為針劑或者片劑。即可以將有效治療量的4- [ (3- {[ (2-萘氧 代)乙?；鵠亞胼}正丁酰)胺]苯甲酰胺與合適的學(xué)上可接受的載體聯(lián)用。本發(fā)明還提供了一種抑制艾滋病毒的方法，即將4-[(3-{[(2_萘氧代)乙?；鵠 亞胼}正丁酰)胺]苯甲酰胺加入含有艾滋病病毒的溶液中。上述方法中，加入的4-[(3-{[(2_萘氧代)乙酰基]亞胼}正丁酰)胺]苯甲酰 胺終濃度不小于72.8 μ M。本發(fā)明提供了 一種具有抗HIV活性的小分子化合物，4- [ (3- {[ (2-naphthyloxy) acetyl]hydrazono}butanoyl)amino]benzamide(4-[(3_{[(2-萘氧代)乙酉先基]亞胼}正 丁酰)胺]苯甲酰胺)。簡稱為FD2。
其結(jié)構(gòu)式為 本發(fā)明還包括對上述結(jié)構(gòu)式所代表的化合物進(jìn)行常規(guī)替代所得到的化合物?；衔锏南嚓P(guān)信息如下化合物Id :AG_205/11132151，分子式C23H22N404，分子量418.45。鑒于抑制CypA活性的物質(zhì)可能干擾HIV-I病毒的復(fù)制，本發(fā)明針對CypA的活性 位點設(shè)計了若干小分子抑制劑。由于是針對細(xì)胞靶點設(shè)計的藥物，而細(xì)胞靶點相對于病毒 靶點來說突變速率相對較慢，因此不易形成耐藥性，適合AIDS患者終身用藥的需求。首先，本發(fā)明對CypA小分子抑制劑進(jìn)行了虛擬篩選。Cyclophilin A(CypA，PPIA)基因在人類基因組數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)被登錄，其錄入號為 NM_021130。在PDB蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中，檢索到了人類CypA蛋白的X光衍射晶體結(jié)構(gòu)(PDB 代碼1CWA)。這個結(jié)構(gòu)是CypA與其天然抑制劑環(huán)孢菌素A(CsA)的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)。從這 個結(jié)構(gòu)中，確定了 CypA的活性位點，并且確定了活性位點中，能夠被CsA所抑制的若干關(guān)鍵 氨基酸位點。根據(jù)這些結(jié)構(gòu)信息，我們與中國科學(xué)院上海藥物所合作，針對CypA活性位點， 對若干小分子數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了篩選。用于篩選的小分子數(shù)據(jù)庫主要包括SPECS和CNPD。最 后，篩選出了本發(fā)明的FD2。整個計算過程是在中科院上海藥物所64CPU-SGI 0RIGN3800計 算機(jī)和上海超算中心392CPU-神威I超級計算機(jī)上進(jìn)行的。其次，本發(fā)明利用BIAcore分子互作儀驗證虛擬篩選結(jié)果BIAcore分子互作儀是基于表面等離子共振技術(shù)來實現(xiàn)跟蹤生物分子間的相互作 用，無需任何標(biāo)記物，因此最大限度的保證了實驗結(jié)果的真實性。實驗時，將目的生物分子 (CypA蛋白)固定在傳感芯片表面，然后將小分子化合物溶于溶劑并且流過芯片表面。監(jiān)測 器能實時跟蹤檢測溶液中的分子與芯片表面目的生物分子結(jié)合、解離整個過程的變化。通 過BIAcore的結(jié)合數(shù)據(jù)，我們最終確定了 12個能夠與CypA發(fā)生結(jié)合的小分子化合物，并且 計算出了這些小分子化合物與CypA結(jié)合的平衡-解離常數(shù)KD。再次，本發(fā)明利用酶活實驗證明小分子化合物對CypA酶活抑制的能力，從而尋找 出CypA的抑制劑。測定CyP活性的方法很多，但以α _胰凝乳蛋白酶活性測定法 (α-chymotrypsin-coupled enzymic assay)最常用。其原理是含脯氨酸的寡肽底物，如 N-琥拍酰-Ala-Ala-Pro-Phe 對硝基苯胺(N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Ph印-nitroanilide) 在溶液中其順式、反式結(jié)構(gòu)處于平衡，CyP能催化該底物發(fā)生順反異構(gòu)作用，即催化脯氨酸 由順式變?yōu)榉词?；?dāng)其處于反式結(jié)構(gòu)時，C端p-nitroanilide被α-胰凝乳蛋白酶裂解，釋
5放出色素基團(tuán)對硝基苯胺，在390nm連續(xù)測定吸光值的變化即可得知CyP的PPIase活性。我們以不加小分子抑制劑的反應(yīng)作為對照反應(yīng)，測定各個小分子配體在不同濃度 下對酶活反應(yīng)的抑制率，從而計算出各個小分子配體的IC5tl值(μΜ)。結(jié)果顯示，本發(fā)明的 FD2的IC5tl值小于100，也說明本發(fā)明的FD2具有抑制CyP的PPIase活性的作用。最后，本發(fā)明還測定了 CypA小分子抑制劑對HIV-I病毒復(fù)制的影響?；衔锟笻IV-I病毒增值測試簡單的說，就是利用雙抗夾心法測定每個孔內(nèi)P24 蛋白產(chǎn)生的量。以空白對照孔的光吸收值為參照，計算各個化合物抑制HIV-I病毒p24蛋 白的抑制率。結(jié)果顯示，F(xiàn)D2具有抑制HIV-I病毒復(fù)制的能力，可以作為新的抗艾滋病藥物 進(jìn)行開發(fā)。利用FD2抑制HIV-I病毒，溶液中加入的4-[(3-{[(2_萘氧代)乙?；鵠亞胼} 正丁酰)胺]苯甲酰胺終濃度不小于72.8 μ M。本發(fā)明的小分子化合物可以采用各種常規(guī)的制備方法制備。本發(fā)明FD2及其抑制劑、拮抗劑等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時，可提供不同 的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其 中PH通常約為5-8，較佳地ρΗ約為6-8，盡管ρΗ值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的 病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限 于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。以本發(fā)明的FD2為例，可以將其與合適的藥學(xué)上可接受的載體聯(lián)用。這類藥物組 合物含有治療有效量的蛋白質(zhì)和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限 于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本 發(fā)明的FD2可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過 常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物 組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量， 例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的FD2還可與其他治 療劑一起使用。本發(fā)明中，用FD2制備的抗艾滋病藥物可以是針劑或者片劑。當(dāng)本發(fā)明的FD2被 用作藥物時，可將治療有效劑量的該化合物施用于哺乳動物，其中該治療有效劑量通常至 少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量 是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人 健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。艾滋病(AIDS)是一種由艾滋病病毒，即人體免疫缺陷病毒 (humanimmunodeficiencyvirus,簡稱HIV)侵入人體后破壞人體免疫功能，使人體發(fā)生多 種不可治愈的感染和腫瘤，最后導(dǎo)致被感染者死亡的一種嚴(yán)重傳染病。被稱為“當(dāng)代瘟疫” 和“超級癌癥”的艾滋病已引起世界衛(wèi)生組織(WHO)及各國政府的高度重視，無論是人員和 經(jīng)費(fèi)的投入均放在首位，我國已將其列入乙類法定傳染病，并為國境衛(wèi)生監(jiān)測傳染病之一。 然而，到目前為止，尚無可以治愈該病的有效藥物。本發(fā)明的小分子化合物FD2具有抑制 HIV-I病毒復(fù)制的能力，而且是針對細(xì)胞靶點設(shè)計的藥物，不易形成耐藥性，適合AIDS患者 終身用藥的需求。因此，本發(fā)明的FD2可以作為新的抗艾滋病藥物進(jìn)行開發(fā)，為治療和治愈 艾滋病提供了 一種新的途徑和手段。
具體實施例方式實施例化合物抗HIV-I病毒增值測試MT-2細(xì)胞種于96孔板中，每孔IO4個。培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的RPMI 1640培 養(yǎng)基。HIV-I病毒以100個50%組織感染當(dāng)量來感染細(xì)胞，同時加入不同濃度梯度的化合 物培養(yǎng)過夜(以不加化合物的孔為空白對照)。次日，更換不含小分子化合物的新鮮培養(yǎng) 基。第四天，取IOOuL培養(yǎng)液上清，加入5%體積的Triton-XlOO處理后得到病毒裂解液，然 后用ELISA方法測定p24蛋白含量(p24是HIV-I的外殼蛋白，可以作為衡量病毒粒子數(shù)量 的指標(biāo))。簡單的說，就是利用雙抗夾心法測定每個孔內(nèi)P24蛋白產(chǎn)生的量。將抗HIV免 疫球蛋白包板過夜(PH 9. 6碳酸緩沖液，4°C )，然后加入含4%脫脂奶粉的PBS封閉；加入 IOOuL病毒裂解液后于37°C孵育1個小時，用預(yù)冷PBS沖洗若干次；加入辣根過氧化物酶標(biāo) 記的抗P24單克隆抗體，用TMB顯色一刻鐘；然后加入IN的硫酸溶液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上 讀取450nm時的光吸收值。以空白對照孔的光吸收值為參照，計算各個化合物抑制HIV-I病毒p24蛋白的抑 制率。。抑制率％= [I-(E-N)/(P-N)] X 100%。E代表化合物存在時p24+細(xì)胞數(shù)量，P和N 分別代表陽性對照(不加化合物)和陰性對照(既不加病毒也不加化合物)。結(jié)果FD2抑制HIV-I病毒p24蛋白的抑制率的平均值達(dá)到23%。
權(quán)利要求
4 [(3 {[(2 萘氧代)乙酰基]亞肼}正丁酰)胺]苯甲酰胺在制備抗艾滋病藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，該抗艾滋病藥物為針劑或者片劑。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的抗艾滋病藥物含有有效治療量的 4_[(3-{[(2-萘氧代)乙?；鵠亞胼}正丁酰)胺]苯甲酰胺與合適的藥學(xué)上可接受的載 體。
4.一種抑制艾滋病毒的方法，其特征在于，將4-[(3-{[(2_萘氧代)乙?；鵠亞胼}正 丁酰)胺]苯甲酰胺加入含有艾滋病病毒的溶液中。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，加入4-[(3-{[(2_萘氧代)乙?；鵠亞胼} 正丁酰)胺]苯甲酰胺終濃度不小于72. 8 μ Μ。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種具有抗HIV活性的小分子化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。被稱為“當(dāng)代瘟疫”和“超級癌癥”的艾滋病已引起世界衛(wèi)生組織(WHO)及各國政府的高度重視，然而，到目前為止，尚無可以治愈該病的有效藥物。本發(fā)明提供了4-[(3-{[(2-萘氧代)乙酰基]亞肼}正丁酰)胺]苯甲酰胺在制備抗艾滋病藥物中的應(yīng)用，該化合物具有抑制HIV-1病毒復(fù)制的能力，而且是針對細(xì)胞靶點設(shè)計的藥物，不易形成耐藥性，適合AIDS患者終身用藥的需求。
文檔編號A61K31/167GK101889995SQ20091005167
公開日2010年11月24日 申請日期2009年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月21日
發(fā)明者余龍, 張明君, 陳帥 申請人:復(fù)旦大學(xué)