專利名稱：一種具有β-內(nèi)酰胺酶抑制活性的多肽及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，特別涉及一種具有β -內(nèi)酰胺酶抑制活性的多肽及其 制備方法和應(yīng)用，包括該多肽的編碼基因及其重組表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化子。
背景技術(shù)：
β -內(nèi)酰胺類抗生素(青霉素和頭孢菌素)在臨床上用于治療多種細(xì)菌感染疾 病，但隨著抗生素的廣泛應(yīng)用以及某種程度上的濫用，耐藥菌在不斷地產(chǎn)生，它們對(duì)許多 β “內(nèi)酰胺抗生素耐藥，從而使這類藥物對(duì)耐藥菌感染的疾病無效。微生物來源的β “內(nèi)酰 胺酶的抑制劑棒酸(Clavulanic acid)及其β -內(nèi)酰胺砜類化合物舒巴坦(Sulbactam)和 他佐巴坦(Tazobactam)，均在七十年代至八十年代被發(fā)現(xiàn)并證實(shí)是有效的β -內(nèi)酰胺酶的 抑制劑，且作為“自殺者”與內(nèi)酰胺抗生素合并用藥，可達(dá)到抑制內(nèi)酰胺酶活力、增 強(qiáng)β-內(nèi)酰胺抗生素療效的目的。然而，這些小分子化合物對(duì)一些細(xì)菌產(chǎn)生的由染色體介 導(dǎo)的I型β-內(nèi)酰胺酶的抑制作用都很小。近來人們從帶棒鏈霉菌(Str印tomyces clavuligerus)中分離到β -內(nèi)酰胺酶抑 制蛋白(β -lactamase inhibitory protein，BLIP)，可以特異性的抑制β -內(nèi)酰胺酶的活 性，隨后又有BLIP-I、BLIP-II被發(fā)現(xiàn)。但是β -內(nèi)酰胺酶抑制蛋白BLIP，分子量比較大， 有165個(gè)氨基酸組成，并不適合開發(fā)成為臨床使用的藥物。BLIP與β-內(nèi)酰胺酶的結(jié)合具 有幾個(gè)關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)。本申請(qǐng)人的專利ZL200410084577. 1中根據(jù)關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)并合 成了隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)，從中篩選到24肽SIPIS04-01，體外作用表明具有抑制β -內(nèi)酰胺酶 的活性，適合用于作為基因工程表達(dá)藥物，但是該24肽SIPIS04-01的抑制β -內(nèi)酰胺酶的 活性并不高。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對(duì)現(xiàn)有的具有β -內(nèi)酰胺酶抑制活性的多 肽存在的活性低的不足，提供一種新的具有內(nèi)酰胺酶抑制活性的多肽及其制備方法和 應(yīng)用，同時(shí)提供該多肽的編碼序列及其重組表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化子。本發(fā)明人經(jīng)過仔細(xì)研究發(fā)現(xiàn)，隨著BLIP與β -內(nèi)酰胺酶結(jié)合關(guān)系的研究的深入， 包括結(jié)構(gòu)生物學(xué)以及熱力學(xué)，影響二者結(jié)合的“熱點(diǎn)”(hotspot)關(guān)鍵氨基酸不斷被發(fā)現(xiàn)。 據(jù)此，本發(fā)明人通過反復(fù)的試驗(yàn)，將之前得到的24肽SIPIS04-01的編碼基因，根據(jù)大腸桿 菌密碼子偏愛性進(jìn)行改造，然后通過關(guān)鍵位點(diǎn)的氨基酸替換，并延長(zhǎng)其N端，終于制備了新 的具有更強(qiáng)內(nèi)酰胺酶抑制活性的小肽，從而完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之一是一種具有β -內(nèi)酰胺 酶抑制活性的多肽，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID Ν0. 6所示，其中，第25位的“Xaa”表
示非極性氨基酸殘基。本發(fā)明中，所述的非極性氨基酸殘基包括Ile，Met，Gly，Ala，Val，Pro, Leu, Trp,或Phe，較佳的是丙氨酸(Gly)殘基或甘氨酸(Ala)殘基。當(dāng)所述的非極性氨基酸殘基是丙氨 酸殘基或甘氨酸殘基時(shí)，本發(fā)明所述的多肽的氨基酸序列較佳的如序列表中SEQ ID NO. 2 或 SEQ ID NO. 4 所示。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之二是一種DNA序列，其編碼具有 β -內(nèi)酰胺酶抑制活性的多肽，是下列之一1)其核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO. 5所示，其中，第73 75位的“nbn”表示
編碼非極性氨基酸殘基的密碼子序列；2)其編碼如序列表中SEQ ID NO. 6所示的氨基酸序列的多肽，其中，第25位的 "Xaa"表示非極性氨基酸殘基。本發(fā)明中，所述的非極性氨基酸殘基包括lie, Met, Gly，Ala, Val, Pro, Leu, Trp, 或Phe，較佳的是丙氨酸(Gly)殘基或甘氨酸(Ala)殘基。當(dāng)所述的非極性氨基酸殘基是丙 氨酸殘基或甘氨酸殘基時(shí)，本發(fā)明的編碼具有β "內(nèi)酰胺酶抑制活性的多肽的DNA序列，較 佳的是下列之一 1)其核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO. 1或SEQ ID N0. 3所示；2)其編 碼如序列表中SEQ ID N0. 2或SEQ ID N0. 4所示的氨基酸序列的多肽。本發(fā)明還提供一種重組載體，其含有任一項(xiàng)如上所述的DNA分子。較佳的，所述的 重組載體的載體骨架是質(zhì)粒pET32a。本發(fā)明還提供一種轉(zhuǎn)化體，其含有如上所述的重組載體。較佳的，所述的轉(zhuǎn)化體的 宿主細(xì)胞是大腸桿菌(Escherichia coli，Ε. coli)，如 Ε. coli BL21(DE3)。本發(fā)明還提供一種制備具有內(nèi)酰胺酶抑制活性的多肽的方法，包括以下步 驟培養(yǎng)如上所述的轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得具有內(nèi)酰胺酶抑制活性的多肽。本發(fā)明中，所述的具有內(nèi)酰胺酶抑制活性的多肽可用于制備治療或預(yù)防細(xì)菌 感染疾病的藥物。本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明提供了一種內(nèi)酰胺酶抑制 多肽及其制備方法，該多肽比現(xiàn)有的內(nèi)酰胺酶抑制多肽活性高得多，對(duì)臨床耐藥菌肺 炎克雷伯氏菌具有明顯的抑制作用，用來與內(nèi)酰胺類抗生素合用來治療細(xì)菌感染將具 有更明顯的效果。該多肽可以采用基因工程方法制備，非常適合開發(fā)成為臨床使用的藥物， 可以滿足生物醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)展的需要，具有良好的醫(yī)藥前景。


以下結(jié)合

本發(fā)明的特征和有益效果。圖 1 是 SIPIS04-01 與 SIPIS04-01-N 的比對(duì)。其中，1 是原始序列 SIPIS04-01，2 為優(yōu)化序列SIPIS04-01-N。圖2是小肽融合蛋白表達(dá)載體ΡΕΤ132的構(gòu)建流程示意圖。 圖3是合成氨基酸替換小肽基因的PCR產(chǎn)物電泳圖。1，2，3，4分別代表氨基酸Α， G，C，R替換后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖4是氨基酸替換前后小肽序列比較圖。圖5是氨基酸替換A，G，C，R的表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖，以A顯示載體的構(gòu)建過程。圖6是36肽SIPIS04-01N-Y50A-36的編碼基因以及對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。
圖7是帶His-tag的SIPIS04-01N-Y50A-36融合蛋白洗脫組分的SDS/PAGE電泳 圖。1為分子量標(biāo)記，2為融合蛋白。圖8是表達(dá)陽性多肽融合蛋白SIPI04-01-N和SIPI04-01N-Y50A經(jīng)腸激酶切割后 的SDS/PAGE電泳圖。1、融合蛋白SIPI04-01N-Y50A ；2、融合蛋白SIPI04-01N-Y50A經(jīng)腸激 酶消化后得到的片段；3、融合蛋白SIPI04-01-N ；4、融合蛋白SIPI04-01-N經(jīng)腸激酶消化得 到的片段5、蛋白分子量標(biāo)記。圖9是超濾后流出液的tricine-SDS-PAGE電泳。1是分子量標(biāo)記，2是超濾后的 目標(biāo)小肽。圖10是純化的目的小肽SIPIS04-01N-Y50A-36的HPLC圖。圖11是不同濃度的小肽SIPIS04-01N-Y50A-36對(duì)臨床耐藥肺炎克雷伯氏菌的抑 制活性。
具體實(shí)施例方式下面用實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實(shí)施例中未注 明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例中所述 的“室溫”是指進(jìn)行試驗(yàn)的操作間的溫度，一般為25°C。實(shí)施例1小肽SIPIS04-01-N表達(dá)載體的構(gòu)建將專利申請(qǐng)200410084577. 1序列表中的第二條核苷酸序列，即24肽的編碼基因 序列命名為SIPIS04-01，具體見圖1中的1所示。在SIPIS04-01核苷酸序列的基礎(chǔ)上，以 大腸桿菌密碼子偏愛性為指導(dǎo)原則，在不改變其氨基酸序列前提下，對(duì)基因序列進(jìn)行改造， 得到大腸桿菌密碼子偏愛的編碼該24肽，然后在其5’-末端加上了酶切位點(diǎn)及一個(gè)甲硫氨 酸起始密碼子的核苷酸序列，命名為SIPIS04-01-N，具體見圖1中的2所示。SIPIS04-01-N 編碼28肽。通過化學(xué)合成目的基因SIPIS04-01-N，并在基因兩側(cè)引入EcoRI，Sail酶切位點(diǎn) 插入到質(zhì)粒pET-32a(+)，構(gòu)建得到小肽融合蛋白重組表達(dá)載體，命名為pET132，構(gòu)建流程 圖見圖2。實(shí)施例2SIPIS04-01-N氨基酸替換試驗(yàn)載體構(gòu)建將在SIPIS04-01-N編碼的28肽中的3個(gè)氨基酸作了以下點(diǎn)突變，研究突變后肽 的性能。首先是將在SIPIS04-01-N編碼的28肽中對(duì)應(yīng)第3位和第20位的氨基酸進(jìn)行了替 換，將第3位S替換成F，將第20位由V替換成Y。這兩個(gè)位點(diǎn)根據(jù)文獻(xiàn)(Zhang Z,et al. J Biol Chem，2004，279(41) :42860_42866.)是關(guān)鍵的氨基酸位點(diǎn)。還將在 SIPIS04-01-N 編 碼的28肽中處于第17位的氨基酸進(jìn)行下文四種不同氨基酸的替換，由原來的Y替換成A， 6，(或1 。該位點(diǎn)被認(rèn)為(Strynadka NC, et al. Nature, 1994,368(6472) :657_660.)位于 蛋白相互作用的界面和兩個(gè)loop環(huán)上，在BLIP與TEM等Class A型β -內(nèi)酰胺酶結(jié)合過 程中扮演的重要角色。對(duì)此位點(diǎn)的上述4個(gè)點(diǎn)突變可以比較此位點(diǎn)上不同類型的氨基酸殘 基(非極性R基，不帶電荷極性R基，帶正電荷R基)對(duì)BLIP與β-內(nèi)酰胺酶結(jié)合能力的 影響。上述在SIPIS04-01-N編碼的28肽中對(duì)應(yīng)的第3、第20和17位的氨基酸在文獻(xiàn)報(bào)道 的165個(gè)氨基酸組成的β -內(nèi)酰胺酶抑制蛋白BLIP中對(duì)應(yīng)的位置是第36、53和50位的氨 基酸。
為了實(shí)現(xiàn)上述點(diǎn)突變，設(shè)計(jì)合成了如表1中的引物。
表 1.氨基酸替換試驗(yàn)引物序列
引物名稱序列Pl-AR5'-TTTACCATTCACTGTTCTGTTACCGCAGCTGGC-3'P2-Y50A5'-ACCGTGGTAGCAGTAAGCATCGCCAGCTGCGGTAACA-3'P2-Y50G5'-ACCGTGGTAGCAGTAACCATCGCCAGCTGCGGTAACA-3'P2-Y50C5'-ACCGTGGTAGCAGTAACAATCGCCAGCTGCGGTAACA-3'P2-Y50R5'-ACCGTGGTAGCAGTATCGATCGCCAGCTGCGGTAACA-3'P3-AR5'-GTAGA4JJCATGTTCCGCTTTACCATTCACTGTTCT-3'P4-AR 5，-ATAGrCGL4CTAGAAGGAAGTACCGTTCGCACCGTGGTAGCAGTA-3'表中黑色斜體處為酶切位點(diǎn)。分別將上述引物加入PCR反應(yīng)體系中，PCR反應(yīng)體系見表2。PCR產(chǎn)物電泳圖見圖 3。4條引物經(jīng)過互為模板的PCR反應(yīng)，得到的產(chǎn)物編碼27肽，它是在SIPIS04-01-N基礎(chǔ)上 替換了 3個(gè)氨基酸，即第3位，第17位和第20位，同時(shí)去除了第2位的Ala，這樣氨基酸替 換小肽比28肽SIPIS04-01-N少了一個(gè)氨基酸。這樣就得到編碼4條新的27肽的DNA序 列。其中引物P2-Y50A擴(kuò)增的基因命名為SIPIS04-01N-Y50A，引物P2-Y50G擴(kuò)增的基因命 名為 SIPIS04-01N-Y50G，引物P2-Y50C擴(kuò)增的基因命名為 SIPIS04-01N-Y50C，引物P2-Y50R 擴(kuò)增的基因命名為SIPIS04-01N-Y50R。表2. PCR反應(yīng)體系
組份貯藏液濃度反應(yīng)體系加入量(μ )4條弓丨物(PI、P3、P4各 ΙΟμιηοΙ/L0.8和選自P2中的一種)dNTP各 2.5mmol/L1.6100mmol/L Tris-ClIOx緩沖液500 mmol/L KCl2.015 mmol/L MgCl2Taq酶5υ/μ10.5ddH20補(bǔ)足至總體積為20μ1PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，退火30s溫度一般為引物Tm值減 50C _10°C，72°C延伸，時(shí)間控制在lmin/kb，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后，72°C再延伸lOmin，最后4°C
保存待用。將4條PCR產(chǎn)物回收后，分別用EcoRI，SalI雙酶切電泳回收，同質(zhì)粒pET32a (+)的EcoRI，Sal I雙酶切大片段連接，形成重組表達(dá)質(zhì)粒，分別命名為pYG567，pYG568，pYG569 和 pYG570。其中 pYG567 含有 SIPIS04-01N-Y50A 基因，pYG568 含有 SIPIS04-01N-Y50G 基 因，pYG569 含有 SIPIS04-01N-Y50C 基因和 pYG570 含有 SIPIS04-01N-Y50R 基因。以 pYG567 重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建為例，示意圖見圖5。pET-32a(+)為一種常用的大腸桿菌表達(dá)載體質(zhì)粒， 帶有His-Tag蛋白標(biāo)簽以及腸激酶酶切位點(diǎn)，由Novagen公司購(gòu)得。隨后分別將pYG567-570轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α (購(gòu)自上海生工)。實(shí)施例3編碼多肽的DNA序列測(cè)定將實(shí)施例2制備的大腸桿菌DH5 α轉(zhuǎn)化子中pYG567_570測(cè)序，以通用引物S-Tag 作為測(cè)序引物，由上海英俊生物技術(shù)有限公司測(cè)定。PYG567-570的測(cè)序結(jié)果與理論完全一 致。其中PYG567測(cè)序結(jié)果及其編碼的氨基酸序列如圖6。PYG567-570四個(gè)氨基酸殘基替 換小肽編碼基因的測(cè)序結(jié)果所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列與原始SIPIS04-01-N的氨基酸序列的比 對(duì)見圖4。實(shí)施例436肽SIPIS04-01N-Y50A-36的誘導(dǎo)表達(dá)以及分離純化將pYG567-570轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，取Iml上述大腸桿菌BL21 (DE3)的轉(zhuǎn) 化子培養(yǎng)液，加入到裝有IOOml LB培養(yǎng)基(含ΙΟΟμ g/mlAmp)的250ml搖瓶，37 °C培養(yǎng) 到0D_ = 0. 6時(shí)(約45min)，取Iml樣品作為誘導(dǎo)前對(duì)照，升溫至42°C熱激培養(yǎng)誘導(dǎo) 3h，收集菌體。將誘導(dǎo)后的培養(yǎng)物離心(8000gX10min)獲得菌體，用5ml NTA-O重懸，置 于冰浴中超聲波破壁5min(500W，工作5s，間歇5s)。細(xì)胞破壁液于13，200r/min 4°C離 心20min(Eppendorf5415R小型冷凍高速離心機(jī))，取上清置于燒杯(25ml)中。加入Iml Ni-NTA樹脂混懸液(含50% (ν/ν)樹脂，保存于20% (ν/ν)乙醇溶液中)，置于冰上(或 在4°C冰箱中)用脫色搖床120r/min振蕩lh。裝入層析柱，移去層析柱底端的帽子，上清 液通過NTA柱，收集流出液用于電泳分析。加IOml NTA-20洗滌層析柱，洗去未結(jié)合的雜蛋 白。然后用2ml NTA-200洗脫目的蛋白，分4次洗脫，每次0.5ml，即得到多肽的融合蛋白 (見圖7)。融合蛋白經(jīng)過透析之后再被重組腸激酶(rEK，購(gòu)自上海智源生化公司)消化(如 圖8)。融合蛋白用腸激酶切后，酶切液中含有3個(gè)蛋白，分別是腸激酶，融合蛋白以及本發(fā) 明的目的小肽。酶切液裝入截留分子量為10，OOODa的離心超濾管(由MILLIP0RE公司購(gòu) 得)中，7500gX10min，收集流出液體。由于腸激酶和融合蛋白的分子量均超過10KD，所以 超濾后流出液中僅含有分子量小于10，OOODa的蛋白，即目的小肽。腸激酶的識(shí)別序列為DDDDK，在賴氨酸的C端切割多肽。質(zhì)粒pET_32a(+)中含有 編碼腸激酶酶切位點(diǎn)的序列，在此位點(diǎn)與重組插入序列之間還有一些核苷酸。重組質(zhì)粒表 達(dá)后，重組插入序列的表達(dá)產(chǎn)物的前面還融合了一段蛋白。在用腸激酶消化該融合蛋白時(shí)， 目的蛋白會(huì)比重組插入序列的表達(dá)產(chǎn)物多帶上質(zhì)粒pET-32a(+)自身所有的9個(gè)氨基酸，這 樣最后得到的肽長(zhǎng)度就是36肽。這樣得到的4條36肽，如實(shí)施例2 —樣分別根據(jù)突變氨基 酸命名，如第17位由Y突變?yōu)锳的命名為SIPIS04-01N-Y50A-36小肽，推測(cè)分子量是3900 道爾頓。將超濾流出液中含有的目的小肽進(jìn)行tr i cine-SDS-PAGE，見圖9，可見小肽分子量 約1. 42KD。對(duì)此小肽進(jìn)行了 HPLC分析，有單一的出峰圖譜。其中小肽SIPIS04-01N-Y50A-36 的HPLC分析見圖10。
實(shí)施例5多肽對(duì)于肺炎克雷伯氏菌的體內(nèi)抑制作用將肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumonias (購(gòu)自ATCC公司，700603)接種在含 Amp的LB培養(yǎng)基中37°C振搖過夜，次日以(ν/ν)的比例轉(zhuǎn)接后培養(yǎng)至OD值為0. 5左 右。稀釋至濃度為IO8細(xì)胞/ml后，分兩組平行試驗(yàn)，一組加入Amp (終濃度50μ g/ml)，另一 組加入Amp (終濃度50 μ g/ml)和上述純化回收的小肽(終濃度約為2. 23 μ mol/L)，37°C， 230rpm震蕩培養(yǎng)2小時(shí)后離心。菌體適當(dāng)稀釋涂布含Amp抗生素的LB平板，37°C培養(yǎng)16 小時(shí)，計(jì)數(shù)存活的菌落數(shù)，考察在小肽SIPIS04-01N-Y50A存在下，肺炎克雷柏氏菌對(duì)Amp的 耐受性。同時(shí)采用原始小肽SIPIS04-01作為對(duì)照?？瞻讓?duì)照則用水代替小肽進(jìn)行上述試 驗(yàn)。菌落數(shù)統(tǒng)計(jì)見表3和圖11，顯示在稀釋度為10_5和10_6稀釋度下，平板上長(zhǎng)出適 合統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)。表明SIPIS04-01-N-Y50A-36相對(duì)于原始小肽SIPIS04-01對(duì)于β內(nèi)酰 胺酶的抑制活性提高了 80%。可見腸激酶消化所得的36肽(SIPIS04-01-N-Y50A-36)比原 始的24肽(SIPIS04-01)具有更好的β -內(nèi)酰胺酶抑制活性。表3.菌落統(tǒng)計(jì)結(jié)果
菌落數(shù)1(Γ510_Ε
空白對(duì)照291. 336
SIPI-04-0116017
SIPIS04-01N-Y50A-3651. 32 實(shí)施例6多肽在體外對(duì)β -內(nèi)酰胺酶的抑制活性利用Dixon雙倒數(shù)作圖法求抑制常數(shù)Ki。分別測(cè)定兩種底物Amp濃度(低底物 濃度(SL)25ymol/L，高濃度底物(Sh)為50 μ mol/L)下，不同小肽濃度(0. 5，1. 0，2. 0，4. 0， 8. 0，16. 0 μ mol/L)對(duì)適當(dāng)稀釋50 μ 1 SHV型β內(nèi)酰胺酶酶液(按如下文獻(xiàn)制備楊濤，胡 又佳，謝麗萍等.來自肺炎克雷伯氏菌的SHV型β-內(nèi)酰胺酶基因的克隆、表達(dá)與純化[J]. 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2008，39 (5) 335-339.)在200 μ 1體系中的抑制常數(shù)，分別比較原始小 肽 SIPIS04-01N 以及氨基酸替換后的小肽 SIPIS04-01N-Y50A-36.SIPIS04-01N-Y50G-36 三 組實(shí)驗(yàn)，測(cè)得的結(jié)果如表4。計(jì)算得到的抑制常數(shù)如表5所示。抑制常數(shù)越小，抑制活性越 高，從表5可以看出，Υ50替換成A后，小肽對(duì)SHV型β內(nèi)酰胺酶的抑制作用提高了 0.8倍。同法比較了 小肽 SIPIS04-01-N 和 36 肽 SIPIS04-01-N-Y50A-36、 SIPIS04-01N-Y50G-36對(duì)于TEM-I型β內(nèi)酰胺酶(按如下文獻(xiàn)制備孫偉等.中國(guó)醫(yī)藥工 業(yè)雜志，2004，35 (2)，16-19)的抑制作用，發(fā)現(xiàn)Υ50替換成A后，抑制活性提高了 2. 5倍，見 表6。表4.小肽對(duì)SHV型β內(nèi)酰胺酶的抑制常數(shù)測(cè)試實(shí)驗(yàn)
權(quán)利要求
一種具有β 內(nèi)酰胺酶抑制活性的多肽，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.6所示，其中，第25位的“Xaa”表示非極性氨基酸殘基。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的非極性氨基酸殘基是丙氨酸殘基或 甘氨酸殘基。
3.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的多肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 2 或 SEQ ID NO. 4 所示。
4.一種DNA分子，其編碼具有內(nèi)酰胺酶抑制活性的多肽，其特征在于，是下列之1)其核苷酸序列是序列表中SEQID NO. 5所示，其中，第73 75位的“nbn”表示編碼 非極性氨基酸殘基的密碼子序列；2)其編碼如序列表中SEQID NO. 6所示的氨基酸序列的多肽，其中，第25位的“Xaa” 表示非極性氨基酸殘基。
5.如權(quán)利要求4所述的DNA分子，其特征在于，所述的非極性氨基酸殘基是丙氨酸殘基 或甘氨酸殘基。
6.如權(quán)利要求4所述的DNA分子，其特征在于，所述的DNA分子是下列之一1)其核苷酸序列是序列表中SEQID NO. 1或SEQ ID NO. 3所示；2)其編碼如序列表中SEQID NO. 2或SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列的多肽。
7.—種重組載體，其特征在于，其含有如權(quán)利要求4 6任一項(xiàng)所述的DNA分子。
8.如權(quán)利要求7所述的重組載體，其特征在于，所述的重組載體的載體骨架是質(zhì)粒 pET32a0
9.一種轉(zhuǎn)化體，其特征在于，其含有如權(quán)利要求7所述的重組載體。
10.如權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)化體的宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
11.一種制備具有內(nèi)酰胺酶抑制活性的多肽的方法，其特征在于，包括以下步驟 培養(yǎng)如權(quán)利要求9或10所述的轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得具有β -內(nèi)酰胺酶抑制活性的多肽。
12.如權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述的具有β-內(nèi)酰胺酶抑制活性的多肽在制備治療或 預(yù)防細(xì)菌感染疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有β-內(nèi)酰胺酶抑制活性的多肽及其制備方法和應(yīng)用。該多肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.6所示，其中，第25位的“Xaa”表示非極性氨基酸殘基。該多肽包括36個(gè)氨基酸殘基，比現(xiàn)有的β-內(nèi)酰胺酶抑制多肽活性更高，對(duì)臨床耐藥菌肺炎克雷伯氏菌有抑制作用，可以用來與β-內(nèi)酰胺類抗生素合用來治療細(xì)菌感染。該多肽可以采用基因工程方法制備，適合開發(fā)成為臨床使用的藥物，可以滿足生物醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)展的需要，具有良好的醫(yī)藥前景。本發(fā)明還公開了該多肽的編碼基因及其重組表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化子。
文檔編號(hào)A61K38/16GK101935341SQ200910054340
公開日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2009年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月3日
發(fā)明者朱寶泉, 朱春寶, 胡又佳, 許明飛, 謝麗萍 申請(qǐng)人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院