專利名稱：重組人錳超氧化物歧化酶的抗腫瘤應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)以及藥物學(xué)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及重組人錳超氧化物 歧化酶的抗腫瘤應(yīng)用。
背景技術(shù)：
超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的金 屬酶，能夠保護需氧細胞免受正常代謝過程中產(chǎn)生的活性氧(Reactive Oxygen Species, R0S)的毒害，其主要催化下列反應(yīng)202_+2H+ —Η202+02，Η202隨后被過氧化氫酶(CATs)和過 氧化物酶清除。SOD家族有多種同功酶，按分子所含金屬輔基的不同，可將其分為銅鋅超氧化物歧 化酶(Cu，Ζη-SOD)、錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、鐵超氧化物歧化酶(Fe-SOD)和胞外超氧 化物歧化酶(Extracellular Superoxide Dismutase, EC-S0D)四類，這四類 SOD 都催化同 一種催化反應(yīng)。由于不同類型的SOD在一級結(jié)構(gòu)上無同源性，它們之間的理化特性及穩(wěn)定 性差別很大，不同種屬不同組織來源的同種SOD也略有差別。SOD是國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界一致公認的氧自由基的天然克星，可以專一清除氧自由基，從 動物血、臟器及某些植物中提取的SOD已廣泛應(yīng)用于保健品、食品添加劑及化妝品等領(lǐng)域。 目前市面上應(yīng)用的SOD大多是從動、植物中提取的Cu，Zn-S0D,Mn-SOD因只存在于哺乳動物 線粒體中，含量很少，根本無法采用提取方法大量獲得，因而也限制了對其進一步的研究。 另外，Mn-SOD盡管與Cu，Zn-S0D等同屬于SOD家族，但它們的性質(zhì)有很多不同，故其應(yīng)用領(lǐng) 域也有所不同。如何大量獲得人源化的Mn-SOD以及研究其在各方面的應(yīng)用是本領(lǐng)域亟待 解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種重組人錳超氧化物歧化酶的抗腫瘤應(yīng)用。在本發(fā)明的一個方面，提供一種錳超氧化物歧化酶的用途，用于制備預(yù)防或治療 腫瘤的藥物。在一個優(yōu)選例中，所述的腫瘤是實體腫瘤或非實體腫瘤。在另一優(yōu)選例中，所述的實體腫瘤選自艾氏腹水瘤(EAC腫瘤)，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，子
宮頸癌，肺癌。在另一優(yōu)選例中，所述的非實體腫瘤是白血病。在另一優(yōu)選例中，所述的錳超氧化物歧化酶是重組人錳超氧化物歧化酶。在本發(fā)明的另一方面，提供一種預(yù)防或治療腫瘤的藥物組合物，所述的藥物組合 物含有有效量的錳超氧化物歧化酶；有效量的阿霉素(ADR)；和藥學(xué)上可接受的載體。
在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物含有1-20重量份的錳超氧化物歧化酶；1-5重量份的阿霉素(ADR)；禾口1-100重量份藥學(xué)上可接受的載體。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物含有2-12重量份的錳超氧化物歧化酶；1-5重量份的阿霉素(ADR)；禾口1-100重量份藥學(xué)上可接受的載體在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物中，錳超氧化物歧化酶與阿霉素按照重量比 為(1-5) 1;優(yōu)選的是(1-3) 1;更優(yōu)選2 1。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物中，錳超氧化物歧化酶和阿霉素之和占組合 物總重量的1_50%。在另一優(yōu)選例中，所述的錳超氧化物歧化酶是重組人錳超氧化物歧化酶。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物中，錳超氧化物歧化酶和阿霉素之和占組合 物總重量的2-40% ；更佳地3-30%。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物的劑型選自注射劑、粉末劑、片劑、混懸液或 乳劑。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的藥物組合物的用途，用于制備預(yù)防或治療腫瘤 的藥物。在本發(fā)明的另一方面，提供一種藥盒，所述的藥盒含有所述的藥物組合物。在一個優(yōu)選例中，所述的藥盒中含有容器和裝于容器中的1-20重量份的錳超氧 化物歧化酶；以及，容器和裝于容器中的1-5重量份的阿霉素。在本發(fā)明的另一方面，提供一種預(yù)防或治療腫瘤的方法，所述的方法包括給予需 要預(yù)防或治療的對象有效量的錳超氧化物歧化酶。在一個優(yōu)選例中，所述方法還包括同時給予需要預(yù)防或治療的對象有效量的阿毒素。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。


圖1顯示了 rhMnSOD處理HL-60細胞48小時的抑制作用(0. 5 X IO4細胞/孔)。圖2顯示了 rhMnSOD處理A549細胞48小時的抑制作用(0. 5 X IO4細胞/孔)。
具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛的研究，首次揭示了錳超氧化物歧化酶(Manganese Superoxide Dismutase, rhMn-SOD)在抗腫瘤方面的應(yīng)用；并且，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)錳超氧化 物歧化酶對于部分腫瘤(艾氏腹水瘤，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，子宮頸癌、肺癌或白血病)的抗腫瘤效 果特別優(yōu)異；并且，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)錳超氧化物歧化酶與阿霉素聯(lián)用可以更有效地起到抗 腫瘤作用。
Mn-SOD如本文所用，術(shù)語“錳超氧化物歧化酶”、"Mn-S0D'\ "MnSOD“可互換使用。如本文所用，術(shù)語“重組人錳超氧化物歧化酶”、“rhMn-SOD”、“重組人Mn-SOD”可 互換使用，都指來源于人的經(jīng)基因工程手段重組表達獲得的錳超氧化物歧化酶。任何來源的Mn-SOD均可用于本發(fā)明。優(yōu)選地，所述的Mn-SOD是人來源的。作為 本發(fā)明的更優(yōu)選方式，所述的Mn-SOD是重組人Mn-SOD。重組Mn-SOD表示通過重組體DNA 方法和其他人工方法制備的重組多肽，它具有與任何天然存在的Mn-SOD相同的或基本上 相同的氨基酸序列。重組人Mn-SOD是一種采用基因工程重組技術(shù)制備的人Mn-SOD，其具有 的蛋白序列與GenBank登錄號PID g338286所示的序列基本上相同，其編碼序列如GenBank 登錄號M36693. 1所示的序列基本上相同。眾所周知，根據(jù)已公開的Mn-SOD序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過PCR擴增等方法 制備Mn-SOD的編碼序列，然后將其插入表達載體，進而轉(zhuǎn)化常見的宿主細胞(如大腸桿 菌)，就可以表達重組Mn-SOD。例如，通過IPTG誘導(dǎo)使得大腸桿菌表達Mn-SOD，然后回收該 Mn-SOD0Mn-SOD 用途本發(fā)明提供了 Mn-SOD的用途，用于制備預(yù)防或治療腫瘤的組合物。為了論證Mn-SOD的上述用途。在動物水平上，本發(fā)明人以荷瘤小鼠作為研究模 型。在用藥rhMn-SOD后，發(fā)現(xiàn)rhMn-SOD可明顯地抑制腫瘤的生長。在細胞水平上，本發(fā)明 人以多種腫瘤細胞(包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞以及子宮頸癌細胞等)作為研究對象，結(jié)果發(fā)現(xiàn) 給予腫瘤細胞rhMn-SOD后，可明顯地抑制腫瘤細胞的生長。在實施例中，本發(fā)明人以EAC 腫瘤模型作為實驗?zāi)Ｐ停涫峭ㄓ玫闹委煂嶓w瘤抗腫瘤藥物篩選模型。本發(fā)明還提供了含有Mn-SOD與阿霉素(ADR)的組合物的用途，用于制備預(yù)防或治 療腫瘤的組合物。本發(fā)明人的研究結(jié)果顯示，Mn-SOD與ADR的聯(lián)合用藥具有顯著的增效作用，其對 腫瘤的抑制效果顯著地優(yōu)于分別單用Mn-SOD或ADR。本發(fā)明所述的腫瘤可選自鼻咽癌、食管癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、大腸癌、神經(jīng)膠質(zhì) 瘤、前列腺癌、肺癌、宮頸癌、白血病、口腔癌、唾液腺腫瘤、鼻腔與鼻旁竇惡性腫瘤、喉癌、耳 部腫瘤、眼部腫瘤、甲狀腺腫瘤、縱隔腫瘤、胸壁、胸膜腫瘤、小腸腫瘤、膽道腫瘤、胰腺與壺 腹周圍腫瘤、腸系膜與腹膜后腫瘤、腎臟腫瘤、腎上腺腫瘤、膀胱腫瘤、前列腺癌、睪丸腫瘤、 陰莖癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢惡性腫瘤、惡性滋養(yǎng)細胞腫瘤、外陰癌與陰道癌、惡性淋巴瘤、多 發(fā)性骨髓瘤、軟組織腫瘤、骨腫瘤、皮膚及附件腫瘤、惡性黑色素瘤、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、小兒腫 瘤。特別優(yōu)選地，所述的腫瘤是艾氏腹水瘤(EAC腫瘤)，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，子宮頸癌，肺 癌，白血病。Mn-SOD對于這些腫瘤具有異常良好的抑制作用。組合物本發(fā)明提供了一種藥物組合物，含有(a)有效量的Mn-SOD ； (b)有效量的ADR ；以 及(c)藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。優(yōu)選地，所述的Mn-SOD是rhMn-SOD。 本發(fā)明中，術(shù)語“含有，，表示各種成分可一起應(yīng)用于本發(fā)明的混合物或組合物中。 因此，術(shù)語“主要由...組成”和“由...組成”包含在術(shù)語“含有”中。
本發(fā)明中，“藥學(xué)上可接受的”成分是適用于人和/或動物而無過度不良副反應(yīng) (如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))即有合理的效益/風(fēng)險比的物質(zhì)。本發(fā)明中，“藥學(xué)上可接受的載體”是用于將本發(fā)明的Mn-SOD或其生理上可接受的 鹽傳送給動物或人的藥學(xué)上或食品上可接受的溶劑、懸浮劑或賦形劑。載體可以是液體或 固體。如本文所用，“重量份”或“重量份數(shù)”可互換使用，所述的重量份可以是任何一個 固定的以毫克、克數(shù)或千克數(shù)表示重量(如lmg、lg、2g、5g、或Ikg等)。例如，一個由1重 量份組分a和9重量份組分b構(gòu)成的組合物，可以是1克組分a+9克組分b，也可以是10克 組分a+90克組分b等構(gòu)成的組合物。在所述組合物，某一組分的百分比含量=(該組分的 重量份數(shù)/所有組分的重量份數(shù)之和)X 100%。因此，由1重量份組分a和9重量份組分 b構(gòu)成的組合物中，組分a的含量為10 %，組分b為90 %。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的藥物組合物中，含有1-20重量份的錳超氧化物歧 化酶；1-5重量份的ADR ；和1-100重量份藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明所述的藥物組合物的劑型可以是多種多樣的，只要是能夠使活性成分有效 地到達哺乳動物體內(nèi)的劑型都是可以的。比如可選自片劑、膠囊、粉末、顆粒、糖漿、溶液、 懸浮液。其中Mn-SOD可以存在于適宜的固體或液體的載體或稀釋液中。從藥物的性質(zhì)以 及易于制備和給藥的立場看，優(yōu)選的藥物組合物是液態(tài)組合物，如注射劑、混懸液或乳劑。本發(fā)明的Mn-SOD及其組合物也可儲存在適宜于注射或滴注的消毒器具中。通常， 在本發(fā)明的藥物組合物中，Mn-SOD作為活性成分占總重量的1-50% (較佳地2_40%，更佳 地3-30% )，其余為藥學(xué)上可接受的載體以及其他添加劑等物質(zhì)。給藥方式和劑型本發(fā)明的藥物組合物可以通過常規(guī)方法制成任何常規(guī)的制劑形式。通常，當(dāng)所述化合物及其組合物用于上述用途時，它們可與一種或多種藥學(xué)上可 接受的載體或賦形劑混合，如溶劑、稀釋劑等，而且可以用如下形式口服給藥片劑、膠囊、 可分散的粉末、顆?；驊腋∫?含有如約0. 05-5%懸浮劑)、糖漿(含有如約10-50%糖)、 和酏劑(含有約20-50%乙醇)，或者以無菌可注射溶液或懸浮液形式(在等滲介質(zhì)中含有 約0. 05-5%懸浮劑)進行非腸胃給藥。例如，這些藥物制劑可含有與載體混合的約1_50%， 通常約為2-40% (重量)的活性成分。所用的活性成分的有效劑量可隨所用的化合物、給藥的模式和待治療的疾病的嚴 重程度而變化。然而，通常當(dāng)本發(fā)明的組合物中的活性組分(Μη-SOD和ADR的組合)每 天以約0. l-100mg/kg動物體重的劑量給予時，能得到令人滿意的效果，較佳地每天以1-3 次分開的劑量給予，或以緩釋形式給藥。對大部分大型哺乳動物而言，每天的總劑量約為 0. 5-500mg，較佳地約為l_200mg。適用于內(nèi)服的劑量形式，包含與固態(tài)或液態(tài)藥學(xué)上可接受 的載體密切混合的約l_200mg的活性化合物?？烧{(diào)節(jié)此劑量方案以提供最佳治療應(yīng)答。例 如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開的劑量，或?qū)┝堪幢壤販p少。所述化合物及其組合物可通過靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或口服等途徑給藥。固態(tài)載體 包括淀粉、乳糖、磷酸二鈣、微晶纖維素、蔗糖和白陶土，而液態(tài)載體包括無菌水、聚乙二 醇、非離子型表面活性劑和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)，只要適合活性成分的特 性和所需的特定給藥方式。在制備藥物組合物中通常使用的佐劑也可有利地被包括，例如調(diào)味劑、色素、防腐劑和抗氧化劑如維生素E、維生素C、BHT和BHA。所述活性化合物及其組合物也可腸胃外或腹腔內(nèi)給藥。也可在適當(dāng)混合有表面活 性劑(如羥丙基纖維素)的水中制備這些活性化合物(作為游離堿或藥學(xué)上可接受的鹽) 的溶液或懸浮液。還可在甘油、液體、聚乙二醇及其在油中的混合物中制備分散液。在常規(guī) 儲存和使用條件下，這些制劑中含有防腐劑以防止微生物的生長。適應(yīng)于注射的藥物形式包括無菌水溶液或分散液和無菌粉(用于臨時制備無菌 注射溶液或分散液)。在所有情況中，這些形式必須是無菌的且必須是流體以易于注射器 排出流體。在制造和儲存條件下必須是穩(wěn)定的，且必須能防止微生物 (如細菌和真菌)的 污染影響。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，其中含有如水、醇(如甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二 醇)、它們的適當(dāng)混合物和植物油。本發(fā)明的藥物組合物還可與其它活性成分或藥物聯(lián)合給藥。本發(fā)明的藥物組合物可置于藥盒中，便于本領(lǐng)域技術(shù)人員或醫(yī)師使用。優(yōu)選地，所 述的藥盒中還有本發(fā)明的藥物組合物的使用說明。也可將Mn-SOD與阿霉素分別裝于獨立的容器中，置于藥盒中。從而有利于靈活地 給藥，例如先給予阿霉素，之后再給予Mn-SOD。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(1)首次發(fā)現(xiàn)了 Mn-SOD在防治腫瘤方面的新用途，其藥理作用強，且沒有毒副作 用，具有極好的藥用前景。(2)首次發(fā)現(xiàn)了 Mn-SOD與ADR聯(lián)合用藥具有增效的抗腫瘤作用，且沒有毒副作用。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克隆實驗室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所 述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例1、rhMn-SOD對于實體瘤的抑瘤作用按全國抗癌藥物篩選規(guī)程及新藥臨床前研究指導(dǎo)原則，選取健康且腫瘤生長旺盛 (無壞死)EAC荷瘤小鼠(由中國藥科大學(xué)動物室提供)拉斷頸椎處死，經(jīng)消毒后置于超凈 臺中，在無菌條件下取出腫瘤組織，剪碎，加入生理鹽水在研磨器中研磨制成細胞懸液，計 數(shù)腫瘤細胞，將瘤細胞懸液調(diào)節(jié)成1 X IO8個/ml備用。取ICR小鼠(由中國藥科大學(xué)動物室提供)60只，按移植性腫瘤研究法，接種EAC 實體型瘤，每只小鼠右前肢腋窩皮下接種0. 2ml。接種后24h稱鼠重，并隨機分為9組，每 組10只，雌雄各半。rhMn-SOD的表達、純化按照本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)表的文章制備(陳車生，程 貽，吳乾一等，重組人錳超氧化物歧化酶高密度發(fā)酵培養(yǎng)條件研究[J]，中國藥科大學(xué)學(xué)報， 2007,38(5) :472;程貽，陳車生，吳乾一等，重組人錳超氧化物歧化酶純化條件研究[J]，食 品與藥品，2007，9 (7) :1)。實驗設(shè)
對照組0· 2ml生理鹽水；
rhMn-SOD 2 個劑量組2mg/kg、4mg/kg rhMn-SOD ；ADR 組:2mg/kg ADR ；ADR聯(lián)合用藥2個劑量組上述rhMn-SOD劑量分別與ADR 2mg/kg聯(lián)用。 ADR用0. 2ml生理鹽水溶解，經(jīng)小鼠尾靜脈給藥，rhMn-SOD用生理鹽水稀釋后腹腔 注射，在聯(lián)合用藥組中，ADR給藥后6h腹腔注射rhMn-SOD。于接種后24h給藥，每天1次， 連續(xù)6次。停藥后第2天處死并稱重荷瘤小鼠，分離瘤塊稱瘤重，計算抑瘤率。抑瘤率=(1-給藥組平均瘤重/空白對照組平均瘤重)X 100%。由表1可知，與對照相比，所有用藥組對EAC腫瘤的生長具有顯著的抑制作用。單 用rhMn-SOD對EAC腫瘤的生長具有顯著的抑制作用，且抑制作用隨rhMn-SOD劑量的增加 而增強。rhMn-SOD與ADR合用有增效作用，與ADR組相比，4mg/kg rhMn-SOD劑量的聯(lián)合用 藥組的增效作用具有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0. 05)。實驗期間所有的動物存活且無明顯行為異 常。rhMn-SOD單用組的小鼠體重變化與對照組無顯著差異，其余用藥組小鼠體重變化與對 照組相比均有明顯差異，ADR聯(lián)合用藥組體重變化與ADR組相比無明顯差異。表IrhMn-SOD單獨使用及與ADR合用對小鼠EAC腫瘤的抑制作用(η = 10)
權(quán)利要求
一種錳超氧化物歧化酶的用途，用于制備預(yù)防或治療腫瘤的藥物。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的腫瘤是實體腫瘤或非實體腫瘤。
3.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述的實體腫瘤選自艾氏腹水瘤，神經(jīng)膠 質(zhì)瘤，子宮頸癌或肺癌。
4.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述的非實體腫瘤是白血病。
5.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的錳超氧化物歧化酶是重組人錳超氧 化物歧化酶。
6.一種預(yù)防或治療腫瘤的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物含有 有效量的錳超氧化物歧化酶；有效量的阿霉素；和 藥學(xué)上可接受的載體。
7.如權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物含有 1-20重量份的錳超氧化物歧化酶；1-5重量份的阿霉素；和1-100重量份藥學(xué)上可接受的載體。
8.如權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物中，錳超氧化物歧 化酶和阿霉素之和占組合物總重量的1_50%。
9.權(quán)利要求6所述的藥物組合物的用途，其特征在于，用于制備預(yù)防或治療腫瘤的藥物。
10.一種藥盒，其特征在于，所述的藥盒含有權(quán)利要求6所述的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及重組人錳超氧化物歧化酶的抗腫瘤應(yīng)用。本發(fā)明還公開了含有重組人錳超氧化物歧化酶與阿霉素的藥物組合物，該藥物組合物具有良好的抗腫瘤效果。本發(fā)明的藥物組合物沒有毒副作用，具有極好的藥用前景。
文檔編號A61K38/44GK101954069SQ20091005500
公開日2011年1月26日 申請日期2009年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月17日
發(fā)明者吳梧桐, 李素霞, 袁勤生, 陳車生 申請人:華東理工大學(xué)