專利名稱：人ZCCHC13基因的shRNA及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人ZCCHC13基因，特別是涉及一種人ZCCHC13基因的 shRNA (shorthairpin RNA，短發(fā)夾狀 RNA)及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，因其惡性度高、病情進(jìn)展快，病人早期一般沒有 什么不適，一旦出現(xiàn)癥狀就診，往往已屬中晚期，故治療難度大、療效差。CT(Cancer-teStiS，腫瘤-睪丸)抗原，又稱腫瘤共享抗原，一般在正常組織中不 表達(dá)，但在人生殖細(xì)胞系正常表達(dá)，在多種不同類型的腫瘤中也均有表達(dá)，包括黑色素瘤， 膀胱癌，肺癌，肝癌等，這些具有免疫原性的蛋白正在被積極發(fā)展為腫瘤治療疫苗的靶點(diǎn)。 目前為止已有多達(dá)80多個(gè)CT抗原家族被鑒定。CT抗原在腫瘤形成中的作用也正在受到進(jìn) 一步評(píng)估，精子發(fā)生過程中的部分基因表達(dá)程序在腫瘤發(fā)生時(shí)重新開放，可能有助于惡性 腫瘤的表型特征_永生化，侵襲性，免疫逃逸，基因組低甲基化和轉(zhuǎn)移能力。CT抗原根據(jù)編碼它們基因的染色體定位可分為X染色體連鎖CT抗原(X-CT)和常 染色體(non-x CT)即非X染色體連鎖抗原。在正常睪丸中X染色體連鎖的CT抗原通常在 精原細(xì)胞中表達(dá)，而精原細(xì)胞是在睪丸中保持不斷增殖的一類生殖干細(xì)胞。由于生殖干細(xì) 胞、發(fā)生于胚胎滋養(yǎng)層的細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞有著許多共有的特征，在已知癌基因和抑癌基因 無突變的情況下，原本已沉默的生殖細(xì)胞系特異性表達(dá)基因在腫瘤干細(xì)胞中被激活后可以 調(diào)節(jié)腫瘤的惡性表型。值得強(qiáng)調(diào)的是，據(jù)估計(jì)X染色體上約有10%的基因?qū)儆赬染色體連 鎖CT基因。因此，選取X染色體連鎖的CT基因?yàn)閷?duì)象研究其在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī) 制。人ZCCHC13基因(Genbank No. NM_203303)是CT抗原家族的成員之一，具有CCHC 型鋅指結(jié)構(gòu)域。關(guān)于ZCCHC13基因與肝癌發(fā)生的關(guān)系尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一種人ZCCHC13基因的shRNA。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供一種人ZCCHC13基因的shRNA在制備抑制肝 癌細(xì)胞生長的藥物中的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的一種人ZCCHC13基因的shRNA，包括由編碼SEQID NO. 3所示序列和編碼SEQ ID NO. 4所示序列構(gòu)成的ZCCHC13-shl4，及編碼SEQ IDN0. 5所 示序列和編碼SEQ ID NO. 6所示序列構(gòu)成的ZCCHC13-shl6。另外，本發(fā)明提供一種人ZCCHC13基因的shRNA在制備抑制肝癌細(xì)胞生長的藥物 中的應(yīng)用。本發(fā)明的人ZCCHC13基因的ShRNA能顯著抑制人ZCCHC13基因表達(dá)，使肝癌細(xì)胞 的存活率顯著低于對(duì)照組的細(xì)胞，因此，本發(fā)明的shRNA可應(yīng)用于在制備抑制肝癌細(xì)胞生 長的藥物中，為治療肝癌新藥的開發(fā)提供新的途徑。


下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明圖1是定量PCR鑒定各pSUPER載體的RNA干擾靶基因的效果圖；圖2是各pSUPER載體與pcDNA3. 1共轉(zhuǎn)染PLC/PRF/5、Focus后，重新接種培養(yǎng)，經(jīng) 新霉素篩選后，去除培養(yǎng)液，IXPBS漂洗兩遍后結(jié)晶紫染色后照片。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具 體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建 議的條件。實(shí)施例1一 .shRNA 設(shè)計(jì)原則shRNA設(shè)計(jì)原則與SiRNA設(shè)計(jì)原則相比有其特殊性。源于shRNA的siRNA相對(duì)于 外源導(dǎo)入的siRNA在細(xì)胞內(nèi)的有效濃度要低。shRNA末端設(shè)計(jì)以及雙鏈的熱穩(wěn)定性是以DNA 設(shè)計(jì)為基礎(chǔ)，而siRNA是以mRNA為基礎(chǔ)。1)從轉(zhuǎn)錄本(mRNA)的AUG起始密碼開始，尋找“AA或者NA” 二連序列，并記下其 3’端的19個(gè)堿基序列，作為潛在的干擾靶位點(diǎn)。正義鏈和反義鏈都采用這19個(gè)堿基(不 包括AA或者NA重復(fù))來設(shè)計(jì)；2)避免在起始密碼子或無義區(qū)域附近選擇目的序列；3)靶序列的GC含量應(yīng)為30 % 60 %左右；4)盡量避免針對(duì)5’和3’端的非編碼區(qū)(untranslated regions, UTRs)設(shè)計(jì)靶 序列，原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù) 合物可能會(huì)影響siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合mRNA從而影響干擾的效果；5)將挑選的序列在公共數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比較以確保目的序列與其它基因沒有同源 性；6)將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，排除那些和其他編碼序列/ EST同源的序列；7)選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成。通常一個(gè)基因需要設(shè)計(jì)多個(gè)靶序列，以找到最 有效的干擾序列；8)陰性對(duì)照。本實(shí)施例中設(shè)計(jì)的shRNA序列，具體見表1。表權(quán)利要求
一種人ZCCHC13基因的shRNA，其特征在于包括由編碼SEQ ID NO.3所示序列和編碼SEQ ID NO.4所示序列構(gòu)成的ZCCHC13 sh14，及編碼SEQ ID NO.5所示序列和編碼SEQ ID NO.6所示序列構(gòu)成的ZCCHC13 sh16。
2.如權(quán)利要求1所述的人ZCCHC13基因的shRNA在制備抑制肝癌細(xì)胞生長的藥物中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的人ZCCHC13基因的shRNA是 ZCCHC 13-sh 14 和 ZCCHC 13_sh 16 這兩種 shRNA。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人ZCCHC13基因的shRNA及應(yīng)用，該人ZCCHC13基因的shRNA，包括由編碼SEQ ID NO.3所示序列和編碼SEQ ID NO.4所示序列構(gòu)成的ZCCHC13-sh14，及編碼SEQ ID NO.5所示序列和編碼SEQ ID NO.6所示序列構(gòu)成的ZCCHC13-sh16。該人ZCCHC13基因的shRNA可應(yīng)用于制備抑制肝癌細(xì)胞生長的藥物中，為治療肝癌新藥的開發(fā)提供新的途徑。
文檔編號(hào)A61P1/16GK101993873SQ200910057788
公開日2011年3月30日 申請(qǐng)日期2009年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月27日
發(fā)明者鄧慶, 韓澤廣, 黃健 申請(qǐng)人:上海人類基因組研究中心