專利名稱：硫酸糖肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種硫酸糖肽的制備方法。
背景技術(shù)：
硫酸糖肽(sulglycotide)屬于一種經(jīng)硫酸酯化修飾后的多糖肽。其基本制 備過程，是先經(jīng)一系列的蛋白水解作用由豬十二指腸粘蛋白或者胃粘膜提取得到糖肽， 再以硫酸酯基團(tuán)修飾碳鏈后得到的硫酸酯多糖蛋白即硫酸糖肽，分子量約900，000 1，000，000D。因其能具有顯著抑制胃蛋白酶，而不影響胃液量和胃液酸度的功效，目前醫(yī)療 上已將其用于對(duì)胃、十二指腸潰瘍和胃炎的治療，是用于胃及胃粘膜潰瘍治療的有力的胃 保護(hù)劑?，F(xiàn)有的研究報(bào)道顯示，作為一種細(xì)胞保護(hù)因子，硫酸糖肽在治療潰瘍中表現(xiàn)出來的 有益作用包括刺激碳酸氫鹽的分泌，阻止胃粘膜層的腐蝕，護(hù)胃粘膜生長因子免受幽門螺 旋桿菌的降解，以及促進(jìn)內(nèi)源前列腺素分泌水平的增加。此外，硫酸糖肽像其他胃保護(hù)劑一 樣可以提升粘膜生長因子的功效，同時(shí)影響調(diào)控細(xì)胞循環(huán)過程并與細(xì)胞增殖相關(guān)的細(xì)胞循 環(huán)調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)，其還可以減輕阿司匹林等刺激性較強(qiáng)的藥物對(duì)胃粘膜的傷害。硫酸糖肽作為一種經(jīng)硫酸酯化而得到的多糖肽物質(zhì)，其制備研究的重點(diǎn)在于硫酸 酯化的方法。但目前對(duì)于糖肽的硫酸酯化研究很少，而對(duì)多糖的硫酸酯化研究則較多。經(jīng)硫 酸酯化后的多糖為硫酸酯多糖或稱多糖硫酸酯，其結(jié)構(gòu)是硫酸根與糖羥基化學(xué)結(jié)合成鍵， 其中與糖1位羥基成鍵的稱為硫酸糖苷鍵。目前對(duì)硫酸酯多糖的研究，涉及了包括從動(dòng)、 植物中提取的各種硫酸多糖、肝素、天然中性多糖的硫酸衍生物及人工合成、半合成的各種 硫酸多糖，如硫酸葡聚糖、硫酸戊聚糖、硫酸木聚糖、硫酸香菇多糖、巖藻依聚糖、卡拉膠硫 酸軟骨素等。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道的用于對(duì)多糖類化合物進(jìn)行硫酸酯化反應(yīng)，多以硫酸、發(fā) 煙硫酸、硫磺酸或者三氧化硫、氯磺酸等作為提供硫酸根的磺化試劑，通過如氯磺酸_吡啶 法、濃硫酸法、三氧化硫-吡啶法以及氯磺酸甲酰胺法等不同類型的方法進(jìn)行。其中以氯磺 酸_吡啶法操作簡便易行，重現(xiàn)性好，收率高，故文獻(xiàn)多采用此種方法。糖蛋白屬于一類復(fù)合糖或綴合蛋白質(zhì)，在蛋白酶的作用下，糖蛋白可水解為糖肽， 糖肽(plycopeptide)是糖和肽共價(jià)鍵合的物質(zhì)。由豬十二指腸或胃粘膜提取得到的糖肽 中，一般含有40 50%己糖胺，27 31%己糖，4 6%氨基酸衍生物，13 18%氨基酸， 以及大量游離的硫、磷、脲酸等，沸點(diǎn)為100 200°C。目前對(duì)硫酸糖肽的制備，多是借鑒對(duì) 多糖的硫酸酯化方法，以糖肽原料與相應(yīng)的磺化試劑進(jìn)行硫酸酯化反應(yīng)。例如，借鑒用于硫 酸酯多糖制備的氯磺酸_吡啶方法，通常是在-40 0°C的低溫條件下進(jìn)行酯化反應(yīng)，得到 糖肽的硫化物，再用堿成鹽后得到最終產(chǎn)品。該產(chǎn)品酯化反應(yīng)的關(guān)鍵在于硫化程度，一般 情況下多采用4 8小時(shí)的長時(shí)間反應(yīng)。其中，目前常用方法可如氯磺酸-吡啶法、氯磺 酸-二甲基甲酰胺法、哌啶-N-磺酸-二甲亞砜法、三氧化硫-吡啶法等用于人工合成硫酸 酯化多糖的方法，基本原理都是使糖肽結(jié)構(gòu)中的多糖與相應(yīng)的硫酸酯化試劑在一定的條件 下反應(yīng)，使得單糖殘基上的某些羥基接上硫酸基團(tuán)。其中以糖肽與氯磺酸在無水吡啶中進(jìn) 行酯化反應(yīng)的效果為更好。反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)品不溶于吡啶，可采用過濾手段得到產(chǎn)品，而其中的雜質(zhì)的去除則通過透析或者采用離子交換樹脂處理其水溶液，最后用氫氧化鈉成鹽，并 可通過以丙酮、甲醇等適當(dāng)溶劑沉淀的后續(xù)處理，得到最終產(chǎn)品并提高其硫化程度。已有研究報(bào)道，硫酸糖肽的藥效作用主要緣于其中的亞硫基，而硫酸糖肽中的S 就是以亞硫基的形式存在的，因此硫酸糖肽中硫的含量即等同于亞硫酰基的含量，含量 越高，即硫酸糖肽的硫酸酯化程度越高，產(chǎn)品的藥效越強(qiáng)(Mirelli E et. "preliminary clinical research on a new anti-ulcer drug，，，《Clin Ter》1979 May 31 ；89 (4) 365-71)。但以上述的氯磺酸_吡啶法為例，目前對(duì)糖肽與氯磺酸在無水吡啶中進(jìn)行酯化反 應(yīng)的操作，都采用的是將糖肽原料與氯磺酸及溶劑吡啶一并直接混合的方式進(jìn)行反應(yīng)。由 于氯磺酸與吡啶的反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生大量的熱，為避免因局部溫度過高糖肽而使原料受到破壞， 通常需將反應(yīng)溫度控制在十分苛刻的-15°C -40°C低溫條件下進(jìn)行。但另一方面，作為反 應(yīng)溶劑的吡啶在此低溫條件下也為固態(tài)，難以起到使反應(yīng)原料充分分散和接觸的作用，因 而收進(jìn)影響了硫酸糖肽產(chǎn)品的收率及其硫含量的提高，例如，目前方法制備得到的硫酸糖 肽如果不經(jīng)過后續(xù)繁雜的處理，其硫含量一般只有3 4%左右。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述情況，本發(fā)明將提供一種硫酸糖肽的制備方法，使其可以在無需苛刻的 低溫反應(yīng)條件和繁雜的后續(xù)處理?xiàng)l件下，得到具有更好硫酸酯化效果的硫酸糖肽產(chǎn)品。本發(fā)明的硫酸糖肽制備方法，采用的是以糖肽成分為原料和以氯磺酸為磺化劑， 經(jīng)酯化反應(yīng)后生成得到。其中，先在不高于室溫、特別是不高于6°C的條件下將氯磺酸加 入吡啶充分混合反應(yīng)制備得到酯化試劑，然后再將糖肽成分與該酯化試劑混合進(jìn)行酯化反 應(yīng)。所說的糖肽成分為原料，可以為直接由豬十二指腸或者胃粘膜提取得到的糖肽，優(yōu)點(diǎn) 是其中的酯化有效成分含量較高。也可以采用由市售的腸多糖產(chǎn)品為原料，因其中可能添 加有一定比例的醫(yī)藥產(chǎn)品中允許使用的常用輔料，因此酯化的有效成分含量可能會(huì)相對(duì)較 低。由于氯磺酸與吡啶的反應(yīng)是一個(gè)大量釋放熱的反應(yīng)，因此在上述第一步的酯化試 劑制備時(shí)，降低溫度不僅有利于反應(yīng)的順利進(jìn)行，也有利于對(duì)反應(yīng)的控制和提高操作的安 全性。雖然盡量降低溫度是更可取的，但試驗(yàn)結(jié)果顯示，將反應(yīng)溫度控制在不高于室溫，特 別是不高于6°C的條件下，對(duì)多方面綜合因素都是較為有利的。本發(fā)明上述制備方法中所說的由糖肽成分與已制備得到的酯化試劑進(jìn)行的酯化 反應(yīng)同樣可以在50°c 80°C條件下進(jìn)行，并且以70°C為佳。本發(fā)明上述糖肽與酯化試劑的酯化反應(yīng)，可以在吡啶或甲酰胺類溶劑等已有反應(yīng) 介質(zhì)中進(jìn)行。試驗(yàn)結(jié)果顯示，其中采用甲酰胺類溶劑為佳，如甲酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、 N，N_乙基甲酰胺等不同的甲酰胺類溶劑，其中特別優(yōu)選的反應(yīng)介質(zhì)溶劑是以甲酰胺。一般 情況下，可以采用先將糖肽成分溶于甲酰胺類溶劑中后，再與酯化試劑混合進(jìn)行酯化反應(yīng)。 由于硫酸糖肽制備過程中的硫酸酯化反應(yīng)能否進(jìn)行得充分，取決于糖肽原料與酯化試劑間 的充分分散和接觸，大量的試驗(yàn)結(jié)果表明，甲酰胺類化合物是化學(xué)和熱穩(wěn)定性較好的優(yōu)良 有機(jī)溶劑，通過其使反應(yīng)物的充分分散、溶解和對(duì)酯化試劑的絡(luò)合，可以顯著提高酯化反應(yīng) 速度和有利于酯化反應(yīng)的充分進(jìn)行。
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上述的酯化反應(yīng)完成后，可以按目前已有方式進(jìn)行除雜、純化等后續(xù)處理，例如， 酯化反應(yīng)完成后，冷卻并加入堿中和成鹽，向其水溶液中加入水溶性有機(jī)溶劑使產(chǎn)物充分 沉淀并收集，以除去水溶性雜質(zhì)。對(duì)水溶性雜質(zhì)的去除可通過對(duì)產(chǎn)物的水溶液進(jìn)行透析、離 子交換樹脂處理、超濾等方式進(jìn)行。根據(jù)需要，這一水溶解-有機(jī)溶劑沉淀方式的除雜質(zhì)純 化處理操作可以多次重復(fù)，以使產(chǎn)品純化和提高其硫化程度。用于使產(chǎn)物由其水溶液中沉 淀析出的所說水溶性有機(jī)溶劑，可以選擇使用如C1-3的醇、丙酮、DMF、THF、DMS0等常用的 有機(jī)溶劑。加入所說有機(jī)溶劑前還可在不高于100°C條件下對(duì)水溶液進(jìn)行適當(dāng)濃縮試驗(yàn)顯 示，其中酯化反應(yīng)完成后，冷卻并加堿中和成鹽時(shí)優(yōu)選在PH6-8的中性條件下進(jìn)行，所用的 堿尤以常用且不會(huì)引入過多的雜質(zhì)成分的NaOH最為優(yōu)選。用有機(jī)溶劑進(jìn)行純化沉淀時(shí)的 優(yōu)選溶劑是乙醇。為能提高產(chǎn)品質(zhì)量并保證收率，純化處理時(shí)所用的溶解水量，一般以能使 產(chǎn)物充分溶解為度即可。由于本發(fā)明上述制備方法將現(xiàn)有方法中的全部原料一次同時(shí)投料混合進(jìn)行的反 應(yīng)，改變?yōu)橄拗苽漉セ噭┖笤倥c糖肽進(jìn)行酯化反應(yīng)的分步方式進(jìn)行，從而避免了因氯磺 酸與吡啶反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的大量反應(yīng)熱可能對(duì)糖肽原料造成的破壞，并使酯化反應(yīng)不再需要過 于苛刻的低溫條件，可以在溫和條件下順利進(jìn)行和完成，工藝更為簡單和易于工業(yè)化生產(chǎn)， 特別是同時(shí)采用以甲酰胺類溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)，更有利于得到硫酸酯化效果更為理想的產(chǎn) 品。例如，由本發(fā)明方法制備得到的硫酸糖肽在未經(jīng)后續(xù)提純處理時(shí)的硫含量即可約為 12 14%，遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)方法所得產(chǎn)品中的硫含量僅為3 4%的水平。以下通過實(shí)施例的具體實(shí)施方式
再對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但 不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。在不脫離本發(fā)明上述技術(shù)思想 情況下，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段做出的各種替換或變更，均應(yīng)包括在本發(fā)明 的范圍內(nèi)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11、酯化試劑的制備將附有冷凝管、分液漏斗和攪拌裝置的三頸燒瓶置于冰鹽浴中，加入70ml無水吡 啶并充分?jǐn)嚢桀A(yù)冷，在控制溫度不高于6°C條件下，用分液漏斗緩慢滴加14ml氯磺酸，得到 淡黃色的酯化試劑2、酯化反應(yīng)將3.5g市購的腸多糖(糖肽)產(chǎn)品原料用160ml無水甲酰胺充分?jǐn)嚢枞芙夂?，?入到上述的酯化試劑中，并迅速將反應(yīng)裝置移入65°C 75°C恒溫水浴中，充分?jǐn)嚢璺磻?yīng)約 5小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液移至冰鹽浴中冷卻，用4mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH至 約為7。3、后處理向上述反應(yīng)液中加入約3倍體積的工業(yè)乙醇充分?jǐn)嚢璺稚⒑?，?jīng)3000rpm離心 5min得到沉淀。將沉淀以適量蒸餾水完全溶解后，按常規(guī)方式以流水透析24h (也可用超濾 或以離子交換樹脂處理)，去除水溶性雜志。除雜后的透析液于40°C 50°C下旋蒸減壓濃 縮后(以無沉淀析出為度)，再次加入約3倍體積乙醇使產(chǎn)物充分沉淀，經(jīng)lOOOOrpm離心得
5到沉淀，于40°C干燥箱中干燥24h后，得到最終產(chǎn)品。產(chǎn)品收率30 40%。4、產(chǎn)品硫含量測(cè)定精確秤取500mg硫酸糖肽產(chǎn)物粗品置50ml圓底玻璃燒瓶，加入6N鹽酸10ml，冷 凝回流三個(gè)小時(shí)，少量新沸蒸餾水沖洗回流冷凝管內(nèi)壁，合并洗液，定性濾紙過濾溶液，用 100ml新沸蒸餾水分四次清洗圓底燒瓶，洗液一并過濾，再以新沸蒸餾水沖洗濾紙至中性。 95°C加熱濾液，并加入50ml的0. 1N氯化鋇，振蕩，定量濾紙過濾溶液，再將濾紙及沉淀一同 放入已知皮重的坩堝上，灼燒直至恒重。稱重后用下列公式計(jì)算硫含量S(% ) = (M/m) X0. 1373X 100式中M 點(diǎn)燃的硫酸鋇的重量；m 硫酸糖肽的數(shù)量；0. 1373 硫原子量與硫酸鋇的分子量之比。以上述方法測(cè)定，按本發(fā)明上述方式多次試驗(yàn)所得產(chǎn)品中的硫含量為13 14%。實(shí)施例21、酯化試劑的制備將100mL無水吡啶加入附有冷凝管、滴液漏斗和攪拌裝置的 500mL三頸圓底燒瓶中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，用冰鹽浴冷卻至低于0°C并維持在此條件下，用滴 液漏斗緩慢滴入25mL氯磺酸，反應(yīng)過程始終磁力攪拌，得到淡黃色固體酯化試劑。2、酯化反應(yīng) 稱取3. 5g酯化原料于160ml無水吡啶(或DMF等)，充分?jǐn)嚢枞芙庾鳛轷セ稀?將酯化原料加入到制備好的酯化試劑中，并迅速將反應(yīng)裝置移入75°C 80°C的超級(jí)恒溫 水浴鍋中，不斷攪拌反應(yīng)7 8h。反應(yīng)結(jié)束后，再度移至冰鹽浴中冷卻，然后用4mol/L的 NaOH(或K0H)溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH至中性。3.后處理向上述反應(yīng)液中加入約3倍體積丙酮(或DMF)，充分?jǐn)嚢韬?，?000rpm離心5min 得到沉淀。超濾后直接凍干得到最終產(chǎn)品，或也超濾后濃縮至5 10ml體積后，再加入乙 醇(或丙酮、DMF等)充分?jǐn)嚢韬?，用lOOOOrpm離心得到沉淀后，于40°C干燥箱中干燥24h， 烘干后經(jīng)研磨得到最終產(chǎn)品。多次試驗(yàn)結(jié)果所得產(chǎn)品中的硫含量12 13%。
權(quán)利要求
硫酸糖肽的制備方法，以糖肽成分為原料與磺化劑經(jīng)酯化反應(yīng)生成，其特征是以氯磺酸為磺化劑，先在不高于室溫的條件下將氯磺酸加入吡啶充分混合反應(yīng)制備得到酯化試劑，然后再將糖肽成分與該酯化試劑混合進(jìn)行酯化反應(yīng)。
2.如權(quán)利要求1所述的硫酸糖肽的制備方法，其特征是所說的酯化試劑在溫度不高于 6°C的條件下制備得到。
3.如權(quán)利要求1所述的硫酸糖肽的制備方法，其特征是所說的糖肽成分與酯化試劑的 酯化反應(yīng)在50°C 80°C條件下進(jìn)行。
4.如權(quán)利要求3所述的硫酸糖肽的制備方法，其特征是所說的糖肽成分與酯化試劑的 酯化反應(yīng)溫度為70°C。
5.如權(quán)利要求1至4之一所述的硫酸糖肽的制備方法，其特征是所說的糖肽成分與酯 化試劑的酯化反應(yīng)在甲酰胺類溶劑中進(jìn)行。
6.如權(quán)利要求5所述的硫酸糖肽的制備方法，其特征是將所說的甲酰胺類溶劑為甲酰胺。
7.如權(quán)利要求5所述的硫酸糖肽的制備方法，其特征是將所說的糖肽成分先溶于甲酰 胺類溶劑中，再與酯化試劑混合進(jìn)行酯化反應(yīng)。
8.如權(quán)利要求1至4之一所述的硫酸糖肽的制備方法，其特征是所說的酯化反應(yīng)完成 后，冷卻并加入堿中和成鹽后，加入水溶性有機(jī)溶劑使產(chǎn)物充分沉淀并收集，收集的沉淀以 水溶解后除去水溶性雜質(zhì)，在不高于100°C條件下濃縮后，重復(fù)以水溶性有機(jī)溶劑進(jìn)行沉淀 的純化操作，得到純化產(chǎn)物。
9.如權(quán)利要求8所述的硫酸糖肽的制備方法，其特征是將所說的酯化反應(yīng)完成后用堿 中和成鹽時(shí)的pH為6-8。
10.如權(quán)利要求8所述的硫酸糖肽的制備方法，其特征是對(duì)所收集的產(chǎn)物沉淀物以水 溶解后除去水溶性雜質(zhì)采用超濾或者透析方法。
全文摘要
硫酸糖肽的制備方法，以糖肽成分為原料與磺化劑經(jīng)酯化反應(yīng)生成，其中以氯磺酸為磺化劑，先在將氯磺酸與吡啶混合反應(yīng)制備得到酯化試劑，然后再將糖肽成分與該酯化試劑混合進(jìn)行酯化反應(yīng)。該方法可以在無需苛刻的低溫反應(yīng)條件和繁雜的后續(xù)處理?xiàng)l件下，得到具有更好硫酸酯化效果的產(chǎn)品。
文檔編號(hào)A61P1/04GK101851285SQ200910058830
公開日2010年10月6日 申請(qǐng)日期2009年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月3日
發(fā)明者何啟富, 余蓉, 張革, 楊繼虞, 溫馨蔚, 皮桃英, 陳博 申請(qǐng)人:四川省德陽市生化制品有限公司