專利名稱：生物礦化用天然多肽材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物礦化用天然多肽材料及其制備方法，特別是涉及一種可用于礦化制 備具有良好生物相容性晶體結(jié)構(gòu)的天然多肽材料，屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
大多數(shù)蜘蛛和鱗翅目昆蟲如家蠶、柞蠶等都能夠產(chǎn)生大量的絲蛋白。這些絲蛋白除了可 以用于紡織原料外，還在醫(yī)藥、日用化工、航空航天等許多領(lǐng)域中得到了開發(fā)和利用。近年 來隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，人們已經(jīng)能夠通過基因改性的方法獲得高性能、高產(chǎn)量的天 然絲蛋白。這些研究成功為今后實現(xiàn)高效的液晶紡絲以及新型生物醫(yī)用材料的開發(fā)打下了基 礎(chǔ)。目前，對于生物礦化用多肽的研究取得了初步的進展，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些人工合成的短鏈多 肽和膠原可成為合成多級結(jié)構(gòu)礦化材料的實用模型(Jeffrey D. Hartgerink等，2001， 294， p1684)，這些研究涉及到分子生物學(xué)和材料科學(xué)及醫(yī)學(xué)等多領(lǐng)域的科學(xué)知識。
蠶絲蛋白主要由絲素和絲膠構(gòu)成。絲膠蛋白因較差的生物相容性及生物致敏性，而必需 去除掉。常采用低濃度堿溶液(如碳酸鈉溶液、氫氧化納溶液等)進行水煮的方法將其與絲 素蛋白分離去除。由于蠶絲素蛋白同時具有優(yōu)良的生物相容性、生物可降解性及易加工性， 使其己經(jīng)廣泛應(yīng)用在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域中，如藥物釋放載體、人工皮膚、固定酶的載體、人 工骨組織及人工關(guān)節(jié)等，其中一些研究成果(如人工皮膚)已經(jīng)進入臨床應(yīng)用階段。在本發(fā) 明中所用的絲蛋白為脫絲膠后得到的昆蟲絲素蛋白或者蜘蛛絲蛋白。
傳統(tǒng)認(rèn)為，ZnO微粒具有無毒和生物安全性而被用于日用化妝品、藥物載體以及醫(yī)用填 充材料(M. Ito， Biomaterials， 1991， 12， p41;以及D. Orstavik， J. K. Hongslo'. Biomaterials, 1985， 6， p129)。但是，已有的研究表明納米或微米ZnO顆粒對許多人體組織或器官具有毒 性。這些毒性是由于ZnO顆粒表面的生物不相容性成分引起的(Y. Osamu， International Journal of Inorganic Materials, 2001， 3,p643;以及P. K. Stoimenov, R. L. Klinger, Ci L. Marchin， K.丄Klabunde, Langmuir， 2002， 18， p6679)，從而限制了 ZnO微粒材料在臨床和日用化妝 品領(lǐng)域的應(yīng)用。最近，人們采用人工多肽室溫礦化以及制備了納米ZnO復(fù)合顆粒。但由于這 種人工多肽制備工藝復(fù)雜、威本高，并且人工多肽鏈比較短而難以使得ZnO顆粒具有良好的 生物相容性。
本發(fā)明通過生物相容性優(yōu)良的昆蟲絲素蛋白和蜘蛛絲蛋白的酸化降解而獲得的多肽產(chǎn)物 作為室溫下生物礦化的模板，以獲得生物相容性良好的多肽復(fù)合產(chǎn)物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種用于制備生物礦化晶體的多肽材料及其制備方法，用具有良好 生物相容性的天然絲多肽材料替代價格昂貴的人工合成的多肽材料，以降低生物礦化晶體的 制備成本，利于這些生物礦化晶體材料在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域的應(yīng)用。
本發(fā)明提出的用于制備生物礦化晶體的多肽材料，其特征在于該材料中含有天然絲蛋 白的多肽分子，所述天然絲蛋白為脫膠絲蛋白或無膠絲蛋白。
在上述礦化用天然絲蛋白多肽材料中，所述材料中的絲蛋白來自昆蟲絲、蜘蛛絲。
在上述礦化用天然絲蛋白多肽材料中，所述昆蟲絲為家蠶絲、野蠶絲、柞蠶絲、天蠶絲、 蓖麻蠶絲、樟蠶絲、樗蠶絲、袋蛾絲、飛蛾絲。
在上述礦化用天然絲蛋白多肽材料中，所述蜘蛛絲為圓蛛絲、金蛛絲、狼蛛絲、虎蛛絲、 跳蛛絲、原蛛絲、中突蛛絲、長腳蛛絲。
,上述礦化用天然絲蛋白多肽材料中，所述絲蛋白為水溶性蛋白多肽。
'在上述礦化用天然絲蛋白多肽材料中，所述多肽材料能夠用于室溫礦化晶體，包括氧化 鋅，氧化鐵、氧化鎵、氧化鈷、氧化鈦、羥基磷灰石、磷酸鈣、碳酸鈣。
本發(fā)明提出一種礦化用絲蛋白多肽的方法，其特征在于所述方法依次包括下列步驟
(1) 把絲蛋白放入15。/。一15^的Na2C03溶液中，在燒杯中煮沸10—30分鐘，直到溶液 中有溶膠狀物質(zhì)絲膠生成；當(dāng)釆用蜘蛛絲蛋白制備多肽材料時，該步驟可以不操作。
(2) 將步驟(1)中脫膠后的絲素或未經(jīng)過步驟(1)的蜘蛛絲用去離子水洗凈，加入濃 度為1 10摩爾/升的鹽酸，在80'C 130'C溫度下酸化水解反應(yīng)5 36小時；
(3) 調(diào)節(jié)步驟(2)中水解溶液的pH值為7，再把這種水解后的多肽溶液置于透析袋內(nèi)， 置于4。C冰箱內(nèi)，每天換水一次到三次；
(4) 把步驟(3)中透析后獲得的透明溶液即是絲蛋白多肽材料，經(jīng)過離心濃縮后在4'C 冰箱內(nèi)放置備用。
本發(fā)明提出一種礦化用絲蛋白多肽的方法，其特征在于所述步驟(2)中的鹽酸可以改
變?yōu)橛?.1 1摩爾/升的NaOH溶液，在80'C下水解1 20小時。
本發(fā)明所制備的絲蛋白多肽材料能夠用于生物礦化復(fù)合材料的制備，并使得制備的復(fù)合 材料具有良好的生物相容性和生物活性。
具體實施例方式
下面結(jié)合3個實施例對本發(fā)明做進一步說明，但本發(fā)明的實施方案不限于此。 本發(fā)明中所用的絲蛋白可以為昆蟲絲或蜘蛛絲，昆蟲絲可以為家蠶、野蠶、柞蠶、天蠶、 蓖麻蠶、樟蠶、樗蠶、袋蛾、飛蛾昆蟲絲等，使用前要將昆蟲絲中的絲膠蛋白脫除，發(fā)明中優(yōu)選家蠶絲。將脫膠的家蠶絲素蛋白溶于濃度為1 10摩爾/升的鹽酸中，在溫度80 120。C 下酸化水解5 36小時，然后將水解的蛋白多肽經(jīng)過脫鹽、濃縮處理。本發(fā)明制備的礦化用 絲蛋白多肽即經(jīng)酸化水解處理后的蛋白多肽材料。
本發(fā)明提出的礦化用絲蛋白多肽材料的制備方法主要包括下列步驟
(1) 把絲蛋白放入10。/o—25y。的Na2C03溶液中，在燒杯中煮沸10 30分鐘，直到溶液 中有溶膠狀物質(zhì)絲膠生成；當(dāng)采用蜘蛛絲蛋白制備多肽材料時，該步驟可以不操作。
(2) 將步驟(1)中脫膠后的絲素或未經(jīng)過步驟(1)的蜘蛛絲用去離子水洗凈，加入濃 度為l摩爾/升 10摩爾/升的鹽酸，在80'C溫度下酸化水解反應(yīng)5 24小時
(3) 調(diào)節(jié)步驟(2)中水解溶液的pH值為7，再把這種水解后的多肽溶液置于透析袋內(nèi)， 置于4'C冰箱內(nèi)，每天換水一次 三次；
(4) 把步驟(3)中透析后得到透明溶液即是礦化用絲蛋白多肽材料，經(jīng)過離心濃縮后
放入4t:冰箱內(nèi)備用。
實施例l
在調(diào)制好的濃度為2wt^的50ml脫膠家蠶絲蛋白溶液中，滴加50ml濃度為7摩爾/升的 鹽酸溶液后，倒入安瓿瓶中，抽真空后用氮氣保護并將瓶密封，放入80。C水中保溫8小時。 水解后的絲素蛋白多肽溶液被調(diào)節(jié)pH值至7，置入透析袋、在去離子水中透析一天。透析后 的絲素蛋白多肽溶液在5000 rpm離心15分鐘除去少量沉淀，取上清液即為礦化用絲蛋白多 肽材料，置于4。C冰箱中保存?zhèn)溆?。所制備的絲素蛋白多肽溶液的濃度為0.1 0.2mg/mL。 實施例2
在調(diào)制好的濃度為3wtW的60ml脫膠家蠶絲蛋白溶液中，滴加60ml濃度為5摩爾/升的 鹽酸溶液后，倒入安瓿瓶中，抽真空后用氮氣保護并將瓶密封，放入90。C水中保溫6小時。 水解后的絲素蛋白多肽溶液被調(diào)節(jié)pH值至7，置入透析袋、在去離子水中透析兩天。透析后 的絲素蛋白多肽溶液在5000 rpm離心15分鐘除去少量沉淀，取上清液即為礦化用絲蛋白多 肽材料，置于4。C冰箱中保存?zhèn)溆?。所制備的絲素蛋白多肽溶液的濃度為0.2^0.4mg/mL。 實施例3
1) 在調(diào)制好的濃度為3wt^的60ml狼蛛絲蛋白液中，滴加60ml濃度為6摩爾/升的鹽酸 溶液后，倒入安瓿瓶中，抽真空后用氮氣保護并將瓶密封，放入90。C水中保溫6小時。
2) 將上述體系溶液調(diào)節(jié)pH值至7，置入透析袋、在去離子水中兩天。透析后的溶液經(jīng) 過除去少量沉淀，取上清液即為礦化用絲蛋白多肽材料，置于4。C冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｋ苽?的絲素蛋白多肽溶液的濃度為0.2~0.4 mg/mL。
權(quán)利要求
1、一種礦化用天然絲蛋白多肽材料，其特征在于這種材料中含有天然絲蛋白的多肽材料，所述天然絲蛋白為脫膠絲蛋白。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的礦化用天然絲蛋白多肽材料，其特征在于所述材料中的絲蛋白來自昆蟲絲、蜘蛛絲。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的礦化用天然絲蛋白多肽材料，其特征在于所述昆蟲絲為家蠶絲、野蠶絲、柞蠶絲、天蠶絲、蓖麻蠶絲、樟蠶絲、樗蠶絲、袋蛾絲、飛蛾絲。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的礦化用天然絲蛋白多肽材料，其特征在于所述蜘蛛絲為圓蛛絲、金蛛絲、狼蛛絲、虎蛛絲、跳蛛絲、原蛛絲、中突蛛絲、長腳蛛絲。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的礦化用天然絲蛋白多肽材料，其特征在于所述天然絲蛋白多肽為水溶性蛋白多肽。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的礦化用天然絲蛋白材料，其特征在于這種多肽材料能夠用于室溫礦化晶體，包括氧化鋅，氧化鐵、氧化鎵、氧化鈷、氧化鈦、羥基磷灰石、磷酸鈣、碳酸鈣。
7、 一種制備如權(quán)利要求1所述的礦化用絲蛋白多肽的方法，其特征在于所述方法依次包括下列步驟(1) 把絲蛋白放入10—25。/。的Na2CO3溶液中，在燒杯中煮沸10—30分鐘，直到溶液中有溶膠狀物質(zhì)絲膠生成；當(dāng)采用蜘蛛絲蛋白制備多肽材料時，該步驟可以不操作；(2) 將步驟(1)中脫膠后的絲素蛋白或未經(jīng)過步驟(1)的蜘蛛絲用去離子水洗凈，加入濃度為1 10摩爾/升的鹽酸，在80 130'C溫度下酸化水解反應(yīng)5—36小時；(3) 調(diào)節(jié)步驟(2)中水解溶液的pH值為7，再把這種水醉后的多肽溶液置于透析袋內(nèi)，置于4'C冰箱內(nèi)，每天換水一次 三次；(4) 把步驟(3)中透析后得的透明溶液即是絲蛋白多肽，經(jīng)過離心濃縮后在fC冰箱內(nèi)放置備用。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的礦化用絲蛋白多肽材料的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中的鹽酸可以改變?yōu)橛?.1— l摩爾/升的NaOH溶液，在8(TC下水解l一5小時。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物礦化用天然多肽材料及其制備方法，特別是涉及一種可用于礦化制備具有良好生物相容性晶體結(jié)構(gòu)的天然多肽材料，屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域。含有天然絲蛋白的多肽材料是來自昆蟲絲的脫膠絲蛋白和蜘蛛絲蛋白，這種多肽材料能夠用于室溫礦化的晶體包括氧化鋅，氧化鐵、氧化鎵、氧化鈷、氧化鈦、羥基磷灰石、磷酸鈣、碳酸鈣。脫膠后的絲素蛋白溶液在水洗以及加酸水解后；再經(jīng)過透析、離心濃縮后獲得礦化用天然多肽材料。它能夠用于礦化制備具有良好生物相容性的復(fù)合材料。
文檔編號A61L27/00GK101628126SQ200910060369
公開日2010年1月20日 申請日期2009年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月18日
發(fā)明者嚴(yán)丹紅, 姚亞東, 尹光福, 康云清, 廖曉明, 黃忠兵 申請人:四川大學(xué)