專利名稱：一種真菌硫氧還蛋白的多肽、編碼序列及制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地說，本發(fā)明涉及真菌楊樹菇(v4groc少^ ^gehto)硫氧還蛋白基因序列。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽的制 備方法，同時還涉及多肽在醫(yī)藥、抗腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
楊樹菇04groc;;&eflegen'to)隸屬于真菌門、擔子菌綱、傘菌目、糞銹傘科、田 蘑屬。又名柱狀田頭恭、楊樹燕、茶薪燕、柳松茸等。富含人體必需的八種氨基 酸，其中賴氨酸高達1.75%，其營養(yǎng)價值超過香菇、金針菇等其他食用菌，同時 又具有獨特的藥用價值，民間常用于抗癌、降壓，治療胃冷、腎炎、水腫等有獨
特療效，有"中華神菇"之美譽，但其中的藥理成分并不明確，本發(fā)明中涉及的楊 樹菇硫氧還蛋白是我們首次發(fā)現(xiàn)的重要藥理成分。
硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase, TrxR)是一種NADffl依賴的包含 FAD結構域的二聚體硒酶，屬于吡啶核苷酸-二硫化物氧化還原酶家族成員。其主 要功能是催化NADPH將硫氧還蛋白(thioredoxin， Trx)上的-S2還原成(-SH)2的反 應，即維持Trx的還原型，而Trx在氧化還原調節(jié)和抗氧化防御中有著重要作用。 TrxR的底物專一性不強，除Trx外許多內生的和外來的化合物，如維生素K3、硫辛 酸、DTNB和四氧嘧啶、磷脂氫過氧化物等，都可被TrxR還原。TrxR參與機體多種 生物學活性，并與人類許多疾病有關，如腫瘤、獲得性免疫缺陷綜合征、自身免 疫性疾病等。
TrxR在腫瘤細胞中表達量是正常組織的10倍。用免疫細胞化學法測定TrxR
在人原發(fā)乳腺癌、甲狀腺癌、前列腺癌、結腸直腸癌及惡性黑色素瘤中的定位與 表達，結果顯示，侵襲力強的腫瘤過度表達TrxR，其增殖力強、凋亡率低、轉移力 高，因此，TrxR在癌及腫瘤的形成中有重要作用，可作為抗癌治療的靶點。本發(fā)明中提供一種真菌來源的硫氧還蛋白，具有抗腫瘤活性，可能作為TrxR 的抑制劑誘導腫瘤細胞凋亡。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的在于提供一種多肽核苷酸序列，該序列能編碼上述楊樹菇 硫氧還蛋白多肽序列。該序列與SEQ ID NO. 1中1-327位的核苷酸序列有至少 70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴謹條件下與SEQ ID NO. 1中 1-327位的核苷酸序列雜交。70%的同源基因可以通過突變試劑盒進行突變，或 者通過插入，缺失等基因操作獲得。較佳地至少80%，更佳地至少90%的核苷 酸序列，最佳地，該序列具有SEQ ID NO. 1中1-327位核苷酸序列編碼具有SEQ IDN0.2所示的氨基酸序列。該序列是首次克隆，根據(jù)該序列可以設計引物，通 過PCR或RT-PCR的方法大量擴增該核苷酸序列，連接于表達載體，生產楊樹 菇硫氧還蛋白。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種真菌硫氧還蛋白的多肽(SEQ ID NO. 2) 所示的氨基酸序列，該多肽具有多種活性抗腫瘤活性，在醫(yī)藥上具有廣泛的應 用價值。
本發(fā)明還涉及一種楊樹菇硫氧還蛋白多肽的制備方法，該方法是構建原核表 達載體，利用親和層析方法純化楊樹菇硫氧還蛋白，該方法簡便，成本低廉。
本發(fā)明還涉及一種真菌硫氧還蛋白活性的多肽(SEQ ID NO. 2)所示的氨基 酸序列在作為制備治療或預防宮頸癌、胃癌、乳腺癌、直腸癌、前列腺癌、肝癌 等多種腫瘤疾病藥物中的應用。它可以抑制多種腫瘤細胞的生長，殺死腫瘤細胞， 對腫瘤細胞的抑制作用優(yōu)于或類似于臨床應用的化療藥物阿霉素效果，該硫氧還 蛋白有開發(fā)成抗腫瘤藥物的潛力。
為實現(xiàn)上述任務，本發(fā)明采用以下技術措施
本發(fā)明的一個目的是提供一種新的核苷酸序列，該序列編碼一種新的楊樹菇 硫氧還蛋白。在本發(fā)明中；真菌楊樹菇硫氧還蛋白的cDNA核苷酸序列是以楊 樹菇總RNA或mRNA為模板，通過RT-PCR方法得到的。具體方法如下楊樹 菇菌種為福建省三明真菌研究所提供的栽培種Ag21 (食用菌學報，1999， 6(3): 1-7)，取楊樹燕的新鮮菌絲或子實體，提取總RNA或mRNA為模板(市售的提
4取RNA和mRNA試劑盒，如Clontech， Promega， Stratagene等公司產品，按照 說明書操作)，合成逆轉錄弓I物5' gac cac gcg tat cga tgt cga ctl6 (a/c/g)3'，進行逆 轉錄得到cDNA第一鏈。根據(jù)楊樹菇硫氧還蛋白cDNA序列，設計引物5' atggttgtcaaagctatcacct 3'為正向引物，以5， gacaagggtggccgcctccttg3，為反向引物， 以上述cDNA第一鏈為模板，進行PCR，獲得約350bp目的片段，將此片段克 隆測序，得到SEQ ID NO. 1的cDNA核苷酸序列。
本發(fā)明所要求保護的與上述cDNA序列至少有70%的同源性的基因可以通 插入，缺失、突變等基因操作獲得。如可以在設計PCR引物時，在SEQ IDNO. 1 提供的核苷酸序列基礎上，可以任意進行插入，缺失和突變的引物合成，用該引 物進行PCR，則可以得到至少有70%同源性的基因。較佳地，所述的序列編碼一 多肽，該多肽具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。較佳地至少80%，更佳地 至少90%的核苷酸序列，最佳地，該序列具有SEQ ID NO. 1中卜327位的核苷 酸序列。根據(jù)SEQIDNO. 1 1-327位的核苷酸序列，設計引物，引物通常為包含 l-20位核苷酸序列，和與307—327位互補的核苷酸序列，通過PCR或RT-PCR 的方法大量擴增該核苷酸序列。
本發(fā)明要求保護的楊樹燕硫氧還蛋白活性的多肽可用如下方法生產。該方法 包括以下具體的操作按照常規(guī)實驗條件，如《分子克隆實驗手冊》(第三版)J.薩姆布魯克等編著，2003，北京科學出版社中所述的條件進行。
一種楊樹菇硫氧還蛋白多肽的制備方法，它包括下列步驟
1) 提取楊樹菇的總RNA或mRNA為模板，通過RT-PCR得到cDNA第一鏈， 以此鏈為PCR模板，擴增得到序列為SEQ ID NO. 1所示的核苷酸全長序 列；
2) 獲得與cDNA至少有70%同源性的基因序列在SEQ ID NO. 1的1-327 核苷酸序列基礎上，根據(jù)需要，以其中的任意一段核苷酸序列(一般為 20-40bp，也可以長達100bp)為PCR引物，有目的的在引物合成時引入 堿基的插入，缺失和突變，用該引物與SEQ ID NO. 1中設計酶切位點的 兩端序列(l一20序列，307—327序列，或307—327互補序列，或或1 一20互補序列)為一對引物，進行PCR擴增可以在原序列中有目的的引 入堿基的插入，缺失和突變，得到與cDNA至少有70X同源性的基因序
5列。
3) 構建重組表達載體步驟2中得到的核苷酸序列和原核表達載體pET28b
(市售，Novagen公司，也可以用市售的其他的各種表達載體)進行酶 切，連接酶切后的cDNA序列和表達載體pET28b,構建重組表達載體 pET28—楊樹恭硫氧還蛋白；
4) 將步驟3中得到的重組表達載體轉化大腸桿菌宿主細胞BL21 (市售， Novagen公司，可以根據(jù)所用的表達載體選擇匹配的宿主細胞)，形成 表達楊樹菇硫氧還蛋白的重組細胞；
5) 將步驟4中得到的重組細胞在37'C培養(yǎng)過夜獲得飽和培養(yǎng)物；將50pL 飽和培養(yǎng)物接種于5mL含氨芐青霉素100嗎/mL的培養(yǎng)基中，于37"C培 養(yǎng)2小時。取lmL培養(yǎng)物轉移至微量離心管中。加異丙基硫代半乳糖 苷IPTG至終濃度為lmmol/L，對培養(yǎng)物進行誘導，誘導8-10小時。
6) 利用Ni2+親和層析法純化蛋白，分離，純化步驟5中在重組細胞中誘導 表達具有所示的氨基酸序列的多肽。該多肽為SEQ ID N0.2所示的氨基 酸序列。
純度檢測可以用SDS-PAGE方法檢測。
本發(fā)明所得到的多肽為SEQ ID NO. 2所示的氮基酸序列，該氨基酸序列 可以抑制宮頸癌、胃癌、乳腺癌、直腸癌、前列腺癌、肝癌腫瘤細胞的生 長，殺死腫瘤細胞?；炯兊脑摿蜓踹€蛋白多肽或其變異形式可以單獨、 或以不同的比例加入其他抗腫瘤藥物形成口服的、靜脈注射或瘤內注射的 抗腫瘤藥物。
在本發(fā)明中，'"分離的'"、"純化的"或"基本純的"DNA指，該DNA或片段已 從天然狀態(tài)下位于其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段己經(jīng)與天然狀態(tài) 下伴隨核酸的組分分開，而且己經(jīng)與細胞中伴隨的蛋白質分開。
在本發(fā)明中，術語"楊樹燕硫氧還蛋白(或多肽)編碼序列"指編碼具有楊 樹菇硫氧還蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 1中1-327位核苷酸序 列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQIDN0.1序列的編碼框l-327位核 苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產生的
序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQIDNO. l中l(wèi)-327位核苷酸序列同源性低至約70%的簡并序列也能編碼出SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。該術語還 包括能在中度嚴謹條件下，更佳地在高度嚴謹條件下能與SEQ ID NO. 1中核苷酸 1-327位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。此外，該術語還包括與SEQ IDNO. 1 中從核苷酸1-327位核苷酸序列的同源性至少70%，較佳地至少80%，更佳地 至少90%的核苷酸序列。
該術語還包括能編碼具有楊樹菇硫氧還蛋白功能蛋白的SEQ ID NO. 1所示的 核苷酸序列中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于) 若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核 苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加數(shù)個(通常以120個 以內，較佳地為30個以內，更佳地為10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。
在本發(fā)明中，"基本純的"蛋白質或多肽是指其占樣品總物質的至少20%， 較佳地至少50%，更佳地至少80%，最佳地至少90% (按干重或濕重計)。純 度可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC方法測量多肽的 純度。
在本發(fā)明中，術語"楊樹菇硫氧還蛋白多肽"指具有楊樹菇硫氧還蛋白活性 的SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列，該術語還包括具有與楊樹菇硫氧還蛋白相同 功能的、SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列的變異形式。這些變異形式包括(但并 不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地 1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個 或數(shù)個(通常為40個以內，較佳地為20個以內，更佳地為10個以內)氨基酸。 例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白 質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改 變蛋白質的功能。該術語還包括楊樹菇硫氧還蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、 在高或低的嚴謹度條件下能與楊樹菇硫氧還蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、 以及利用抗楊樹菇硫氧還蛋白多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了 其他多肽，如包含楊樹菇硫氧還蛋白多肽的可溶性片段。通常，該片段具有楊樹 燕硫氧還蛋白多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸， 較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約
7100個連續(xù)氨基酸。
本發(fā)明還提供楊樹燕硫氧還蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然楊樹菇 硫氧還蛋白多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾 形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變 異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可 以通過定點誘變法或其他分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L一 氨基酸的殘基(如D —氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基 酸(如P、 Y—氨基酸)的類似物。應理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的 代表性的多肽。 '
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式 如乙?；螋然缒切┰诙嚯牡暮铣珊图庸ぶ泻瓦M一步加工步驟中進行糖基 化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳 動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括磷酸化氨基酸殘基(如 磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗 蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
本發(fā)明還包括楊樹菇硫氧還蛋白多肽編碼序列的反義序列。這種反義序列可 以用于抑制細胞內楊樹菇硫氧還蛋白的表達。
本發(fā)明還包括一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有楊樹菇硫氧還蛋 白多肽編碼序列的8-100個，較佳地15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣
品中是否存在編碼楊樹燕硫氧還蛋白的核酸分子。 本發(fā)明還包括檢測楊樹菇硫氧還蛋白核苷酸序列的方法，它包括用上述的探
針與樣品進行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結合，較佳地，該樣品是PCR擴增 后的產物，其中PCR擴增引物對應于楊樹薛硫氧還蛋白多肽的編碼序列，并可位 于該編碼序列的兩側或中間，引物長度一般為20-50個核苷酸。
.另一方面，本發(fā)明還包括對楊樹菇硫氧還蛋白或是其片段編碼的多肽具有 特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，"特異性"是指 抗體能結合于楊樹燕硫氧還蛋白基因產物或片段。較佳地，指那些能與楊樹菇硫 氧還蛋白基因產物或片段結合但不識別和結合與其他非相關抗原分子的抗體。本 發(fā)明中抗體包括那些能夠結合并抑制楊樹菇硫氧還蛋白的分子，也包括那些并不影響楊樹菇硫氧還蛋白的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的楊 樹菇硫氧還蛋白基因產物結合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗 體片段，如Fab'或(Fab) 2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳過程改造的單鏈 Fv分子；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的 抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。例如， 純化的楊樹菇硫氧還蛋白基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以 誘導多克隆抗體的產生。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體，可以利用雜交瘤技 術來制備。本發(fā)明的各類抗體可以利用楊樹菇硫氧還蛋白基因產物的片段或功能 區(qū)，通過常規(guī)免疫技術獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多 肽合成儀合成。 本發(fā)明的優(yōu)點和效果
本發(fā)明中提供的楊樹菇硫氧還蛋白核苷酸序列和蛋白質序列是一種新的硫氧 還蛋白的基因和蛋白質序列，未見報道。因此，本發(fā)明的優(yōu)點是"新"——本發(fā) 明是一種新的，具有抗腫瘤活性的硫氧還蛋白，可以應用在醫(yī)藥領域。
本發(fā)明中涉及的楊樹菇硫氧還蛋白蛋白具有很強的抗腫瘤活性。在相同的濃
度下，對HeLa (宮頸癌細胞)、HepG2 (肝癌細胞)、MCF-7 (乳腺癌細胞)的 抑制效果優(yōu)于臨床使用的化療藥物阿霉素，對Colo 320 (直腸癌細胞)、PC-3 (前 列腺癌細胞)和SGC-7901 (胃癌細胞)的抑制效果與阿霉素相當。對荷S180 骨肉瘤的小鼠進行治療，可以延長小鼠的生存時間，對腫瘤生長的抑制率為34.6 %。因此，該蛋白及其基因在開發(fā)抗腫瘤藥物方面將有很大的應用價值。


圖1為一種pET28-楊樹菇硫氧還蛋白的構建示意圖。圖中TRX為楊樹菇硫氧 還蛋白的基因，pGEM-TRX為TRX的保存質粒。首先設計含有Nco I禾tl Xho I酶 切位點的上下游引物，以質粒pGEM-楊樹菇硫氧還蛋白為模板，進行PCR，得 到兩端含有Nco I禾t] Xho I酶切位點的PCR產物，用Nco I禾tl Xho I酶分別消 化PCR產物和pET28b質粒，根據(jù)回收的量進行連接反應，使TRX插入pET28b
9的多克隆位點，完成pET28—楊樹菇硫氧還蛋白(pET28b-TRX)表達載體的構 建。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡明本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明 本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法， 通常按照常規(guī)實驗條件，《分子克隆實驗手冊》(第三版)J.薩姆布魯克等編著， 2003,北京科學出版社中所述的條件進行，或按照制造廠商所建議的條件。
編碼楊樹燕硫氧還蛋白核苷酸序列的制備方法，楊樹菇硫氧還蛋白多肽制備 方法，及活性實施例，抗體制備實施例，抗腫瘤實施例。
實施例1
楊樹薛硫氧還蛋白的cDNA克隆和測序本實施例中得到一新的cDNA序列， 是前人未報道過的。
1. 引物擴增
以楊樹菇總RNA為模板，用寡核苷酸A: 5， gac cac gcg tat cga tgt cga ctl6 (a/c/g)3'為逆轉錄引物進行逆轉錄，得到cDNA的第一鏈，以寡核苷酸B: 5' atggttgtcaaagctatcacct 3 ，為正向引物，寡核苷酸C: 5， gacaagggtggccgcctccttg 3 ，為 反向引物，進行PCR， PCR條件為95°C起始10min，進入三步循環(huán)(95°C lmin， 53°C lmin， 72°C 2min共30個循環(huán))，最后72°C延伸10 min。 20pL反應體系包 含l嗎cDNA， 0.2mMdNTP， 20pM正向引物和反向引物，2pL 10Xbuffer， l|xL Taq酶和1.5 mM MgCl2。 PCR產物為一約327bp目的片段。
2. 克隆測序 .
根據(jù)pGEM-T easy載體(Promega公司產品)的操作手冊，將該擴增片段連接 到pGEM-Teasy載體上，構建質粒pGEM-TRX (pGEM-楊樹菇硫氧還蛋白)， 進行測序，詳細序列見SEQIDNO.l,其中1-327為編碼氨基酸序列的開放閱讀 框序列。
根據(jù)得到的cDNA序列翻譯出楊樹菇硫氧還蛋白的氨基酸序列，共109個氨 基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID N0.2。
10實施例2
楊樹菇硫氧還蛋白在大腸桿菌中的表達、純化本實施例中可以得到大量表 達、純化的蛋白質樣品。
首先設計含有Nco I和Xho I酶切位點的上下游引物，以質粒pGEM-楊樹菇 硫氧還蛋白為模板，進行PCR，得到兩端含有Nco I和Xho I酶切位點的PCR產 物，用Nco I和Xho I酶分別消化PCR產物和pET28b質粒，回收楊樹菇硫氧還蛋 白片段和目的質粒，根據(jù)回收的量進行連接反應，構建原核表達載體pET28b — 楊樹菇硫氧還蛋白(pET28b-TRX)(圖l)。將原核表達載體轉化大腸桿菌宿主 細胞BL21(市售，Novagen公司，可以根據(jù)所用的表達載體選擇匹配的宿主細胞)， 形成表達楊樹菇硫氧還蛋白的重組細胞。
按照前述的原核表達方法，根據(jù)不同時間誘導表達重組楊樹菇硫氧還蛋白的結 果，誘導表達8-10小時，大量表達。利用Ni柱純化重組楊樹菇硫氧還蛋白，表 達量約為4一8mg/L。
實施例3
楊樹菇硫氧還蛋白抗體的制備該實施例可以獲得楊樹燕硫氧還蛋白的多克 隆抗體，用于檢測楊樹菇硫氧還蛋白。
將天然蛋白和實施例2中獲得的重組蛋白用來免疫動物以產生抗體，具體方 法如下。重組蛋白用層析法進行分離后備用，也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進 行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund's佐劑乳化。用 50-100ug/0.2mL乳化過的蛋白，對小鼠進行皮下注射。14天后，用非完全Fre皿d's 佐劑乳化同樣抗原，對小鼠以50-100ug/0.2mL的劑量進行皮下注射以加強免疫。 每隔14天進行一次加強免疫，至少進行3次。獲得的抗血清的特異反應活性用 它在體外結合楊樹恭硫氧還蛋白基因翻譯產物的能力加以評估(Western方法)。
實施例4
楊樹菇硫氧還蛋白對腫瘤細胞和荷瘤小鼠腫瘤組織的抑制作用本實施例中 楊樹菇硫氧還蛋白抑制檢測的7種腫瘤細胞株，證實楊樹菇硫氧還蛋白具有廣普 抗腫瘤作用；抑制荷S—180肉瘤小鼠的腫瘤組織生長，延長荷瘤小鼠的生存時
11間，證實楊樹菇硫氧還蛋白對荷瘤動物的腫瘤組織有抑制生長作用。
l.楊樹燕硫氧還蛋白在體外對腫瘤細胞株的抑制作用
本實施例檢測了楊樹菇硫氧還蛋白對7種腫瘤細胞株(SW480, HeLa， SGC-7901,MGC80-3,BGC-823,HL-60andS-180)生長的抑制活性。所述的一種 分離的多肽在制備治療或預防宮頸癌藥物中的應用；所述的一種分離的多肽在制 備治療或預防胃癌藥物中的應用；所述的一種分離的多肽在制備治療或預防乳腺 癌藥物中的應用；所述的一種分離的多肽在制備治療或預防直腸癌藥物中的應 用；所述的一種分離的多肽在制備治療或預防前列腺癌藥物中的應用；所述的一 種分離的多肽在制備治療或預防肝癌藥物中的應用。所有的腫瘤細胞株在 RPMI1640培養(yǎng)基(其中包含10%的胎牛血清，100mg/mL鏈霉素和100U/mL的青 霉素)中培養(yǎng)。將不同濃度的楊樹菇硫氧還蛋白(以培養(yǎng)基配制成5， 10， 50， 100ug/mL)加入腫瘤細胞中，溫育24小時后，用MTT方法檢測楊樹菇硫氧還蛋 白對腫瘤細胞生長的抑制作用。檢測結果如表2中所示。楊樹菇硫氧還蛋白對所 檢測的腫瘤細胞株有很好的抑制作用，對HeLa，MCF-7， HepG2細胞的抑制效果 優(yōu)于化療藥物阿霉素，在Cok)320， SGC-7901和PC-3等多種腫瘤細胞中表現(xiàn)出與 化療藥物阿霉素在相同的濃度下具有相似的抑制率。
表2楊樹菇硫氧還蠻白(TRX)在體外對腫瘤細胞的抑制作用
細胞株5ng/mLlOfig/mL50照/mL100pg/mL100嗎/mL
TRXTRXTRXTRX阿霉素
HeLa (宮頸癌)12.1±3.535.6 ±4.245.3 ±5.360.3 ±5.245.2 ±4.5
Colo 320 (直腸癌)20.5 ±5.232.4 ±4.840.2 ±3.954.8 ±5.251.2 ±5.5
SGC-7卯1(胃癌)25.1 ±5.131,2±3.755.2 ±4.666.3 ±4.570.2 ±4.7
PC-3(前列腺癌)15.2 ±5.433.7 ±5.240.6 ±6.152.3 ±4.755.4 ±5.3
MCF-7 (乳腺癌)'24.5±3.636.7 ±4.855.2 ±3.770.5 ±4.860.5 ±5.1
HepG2 (肝癌)18.6 ±4.229.6 ±5.267.6 ±5.479.3 ±4.465.3 ±6.8
2.楊樹菇硫氧還蛋白對荷瘤小鼠腫瘤組織生長的抑制作用
在本實施例中，采用BALB/c小鼠(7周，20克)，在腋窩皮下接種O.lmL小鼠
骨肉瘤細胞S-180 (1.18Xl08CellS/mL)，接種3天后，瘤內注射楊樹菇硫氧還蛋
白(以生理鹽水溶解1.67mg/mL，注射0.06mL) O.lmg/只小鼠，對照注射生理鹽 水。此后，隔天注射。在接種腫瘤20天后處死小鼠。切下腫瘤稱重，計算抑制率。
12抑制率(％) = [(C - r)/C] X 100。/。(C是對照組平均腫瘤重量，T為治療組腫瘤
的平均重量)。結果如表3所示。楊樹菇硫氧還蛋白對處理的小鼠的腫瘤的抑制 率可達36.36%，并且延長了荷瘤小鼠的壽命。
表3楊樹菇硫氧還蛋白對荷S—180瘤小鼠腫瘤的抑制作用
處理死亡率腫瘤抑制率(重量)
0.1mg/2days TRX20%34.6%
0.1mg/2days生理鹽水50%-
.在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被 單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明分上述講授內容之后，本 領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所 附權利要求書所限定的范圍。
13SEQUENCE LISTING
<110>武漢大學
<120> —種真菌硫氧還蛋白的多肽、編碼序列及制備方法和應用 <130> —種真菌硫氧還蛋白的多肽、編碼序列及制備方法和應用 <160> 2
< 170> Patentln version 3.1
<210> 1
<211> 327
<212> DNA <213>楊樹菇
<400> 1
atggttgtca aagctatcac ctcgttcgcc gagttcaaga ccctcatcga cagcggaaag cccatcctga ttgatttctg ggcaacgtgg tgtggaccct gcagggccat ctcgcccatc ttcgaaaagt tgtccgagag cgcagactac acaggcgttg ggttctacaa ggtcgatgtt gacgagcagc ctgagatttc gcaggaggtc ggcattagag cgatgcccac cttcctcttg ttcaaagacg gaaacaagcg taaggatgtc gttggtgctc gcccacaaga gcttgaggcc ctcatcaagg aggcggccac ccttgtc
60 120 180 240 300 327
<210> 2
<211> 109
<212> PRT <213>楊樹菇
<400> 2
Met Val Val Lys Ala lie Thr Ser Phe Ala Glu Phe Lys Thr Leu lie
15 10 15
Asp .Ser Gly Lys Pro lie Leu lie Asp Phe Trp Ala Thr Trp Cys Gly
20 25 30
Pro Cys Arg Ala lie Ser Pro lie Phe Glu Lys Leu Ser Glu Ser Ala
35 .40 45
Asp Tyr Thr Gly Val Gly Phe Tyr Lys Val Asp Val Asp Glu Gin Pro
50 55 . 60
Glu lie Ser Gin Glu Val Gly lie Arg Ala Met Pro Thr Phe Leu Leu 65 70 75 80
Phe Lys Asp Gly Asn Lys Arg Lys Asp Val Val Gly Ala Arg Pro Gin
85 90 95
Glu Leu Glu Ala Leu lie Lys Glu Ala Ala Thr Leu Val 100 .105
1權利要求
1、一種分離的編碼真菌硫氧還蛋白的核苷酸序列，其序列為SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。
2、 一種分離的多肽，其序列為SEQIDNa2所示的氨基酸序列。
3、 權利要求2所述的一種真菌硫氧還蛋白的多肽制備方法，它包括下列步驟A、 提取楊樹菇的總RNA或mRNA為模板，通過RT-PCR得到cDNA第一鏈，以 此鏈為PCR模板，擴增得到序列為SEQ ID NO. l所示的全長序列；B、 酶切步驟A得到的序列和原核表達載體，構建重組表達載體；C、 將步驟B中得到的重組表達載體轉化大腸桿菌宿主細胞，形成表達楊樹 燕硫氧還蛋白的重組細胞；D、 將步驟C中得到的重組細胞在37"C培養(yǎng)過夜獲得飽和培養(yǎng)物，將50pL 飽和培養(yǎng)物接種于5mL含氨芐青霉素100pg/mL的培養(yǎng)基中，于37'C培養(yǎng)2小 時，取lmL培養(yǎng)物轉移至微量離心管中，加異丙基硫代半乳糖苷IPTG至終濃 度為lmmol/L，對培養(yǎng)物進行誘導，誘導10小時；E、 利用Nr親和層析法純化蛋白，分離，純化步驟D中在重組細胞中表達的多肽。
4、 權利要求2所述的一種分離的多肽在制備治療或預防宮頸癌藥物中的應用。
5、 權利要求2所述的一種分離的多肽在制備治療或預防胃癌藥物中的應用。
6、 權利要求2所述的一種分離的多肽在制備治療或預防乳腺癌藥物中的應用。
7、 權利要求2所述的一種分離的多肽在制備治療或預防直腸癌藥物中的應用。
8、 權利要求2所述的一種分離的多肽在制備治療或預防前列腺癌藥物中的 應用。
9、 權利要求2所述的一種分離的多肽在制備治療或預防肝癌藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種真菌硫氧還蛋白的多肽、編碼序列及制備方法和應用。該分離多肽的編碼序列為SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，其步驟是，首先是提取楊樹菇的總RNA為模板，通過RT-PCR得到cDNA第一鏈為模板，通過PCR擴增，得到PCR產物；其次是酶切得到PCR產物和原核表達載體，構建重組表達載體；第三是將得到的重組表達載體轉化大腸桿菌宿主細胞，得到表達楊樹菇硫氧還蛋白的重組細胞；第四是將得到的重組細胞誘導培養(yǎng)過夜獲得飽和培養(yǎng)物；等五是利用Ni²⁺親和層析法純化蛋白，分離，純化在重組細胞中表達的多肽。多肽作為制備治療或預防腫瘤疾病藥中的應用。涉及的蛋白質具有抗腫瘤活性。在開發(fā)抗腫瘤藥物方面有很大的應用價值。
文檔編號A61P35/00GK101497886SQ20091006087
公開日2009年8月5日 申請日期2009年2月27日 優(yōu)先權日2009年2月27日
發(fā)明者劉洪洪, 帥 姜, 慧 孫, 榮 欒, 一 梁, 濤 車, 陳義杰 申請人:武漢大學