專利名稱：：黃連素在治療或預(yù)防流感病毒藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體涉及黃連素在治療或預(yù)防流感病毒藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：流感病毒是引起流行性感冒的病原，分為甲(influenzaAvirus)、乙(influenzaBvirus)、丙(influenzaCvirus)三型，其中以甲型流感對(duì)人類威脅最大。人流感病毒主要是HI、H2和H3亞型，而目前危害嚴(yán)重的高致病性禽流感病毒多為H5、H7和H9亞型，即H5m、H7N7、H9N2等，其中以H5m亞型病死率高。因此本發(fā)明主要以H5m、H3N2兩種A型流感病毒為研究對(duì)象對(duì)黃連素的抗病毒活性進(jìn)行了探討。流感病毒屬正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，具有包膜的8個(gè)片段，共編碼11種蛋白質(zhì)的單鏈負(fù)RNA病毒。與其他RNA病毒不同的是，流感病毒所有RNA(mRNA.cRNA.vRNA)的合成均在被感染細(xì)胞的核內(nèi)完成。mRNA在核內(nèi)合成后轉(zhuǎn)移到胞漿，合成病毒的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白；而后開始裝配流感病毒，完成后以出芽方式釋放出子代病毒顆粒，進(jìn)一步侵入新的宿主細(xì)胞。在流感病毒的各個(gè)基因中，NP基因最為保守。NP具有型特異性，還是一種多功能蛋白質(zhì)，除了形成病毒的核衣殼外，還可通過RNP來穩(wěn)定vRNA，使之免受RNA酶作用。多年來研究認(rèn)為，PBl是病毒RNA聚合酶的催化亞基，負(fù)責(zé)病毒RNA的復(fù)制以及轉(zhuǎn)錄；PB2是負(fù)責(zé)以一種稱為“Snatch”的方式奪取宿主mRNA的CAP帽子結(jié)構(gòu)用于病毒mRNA轉(zhuǎn)錄。流感病毒能否在人體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行有效的復(fù)制，主要與病毒復(fù)制酶(PB1、PB2和PA)基因有關(guān)。目前，流感仍屬未能有效控制的急性上呼吸道傳染病。由于流感病毒的抗原變異能力強(qiáng)，加之個(gè)體免疫力的不同，疫苗的保護(hù)率并不高，且疫苗只對(duì)已知的流感病毒亞型有預(yù)防作用，而對(duì)于由抗原性漂移或抗原性轉(zhuǎn)換所產(chǎn)生的新型流感病毒無效。當(dāng)前FDA批準(zhǔn)用于防治流感的藥物有金剛烷胺(Amantadine)、金剛乙胺(Rimantadine)和扎那米韋(Zanamivir)，但分別存在易引起流感病毒耐藥株的出現(xiàn)和服用不方便的問題。中醫(yī)藥治療藥物包括清開靈口服液、雙黃連注射液、藿香正氣丸、參脈注射液等清熱解毒、增強(qiáng)人體免疫力的中成藥，這些藥物具有綜合療效好、毒副作用低等優(yōu)勢(shì)。因此，抗流感病毒藥物的研究方興未艾。中草藥是天然寶庫，以其內(nèi)在科學(xué)性和實(shí)踐的有效性，正日益受到世界各國醫(yī)藥學(xué)工作者的關(guān)注。中藥不僅具有耐藥性低、副作用和不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，而且還有抑制病毒復(fù)制、調(diào)節(jié)免疫功能、改善血液循環(huán)、解熱鎮(zhèn)痛、及抗菌消炎等綜合功效，其在防治流感病毒方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和廣闊的發(fā)展前景。因此，近年來，國內(nèi)外均開展了抗流感病毒中草藥的研究，取得了較好的結(jié)果。黃連為毛茛科植物黃連CoptischinensisFranch.、三角葉黃連CoptisdeltoideaC.Y.ChengetHsiao或云連CoptisteetaWall.的干燥根莖。具有清熱燥濕，瀉火解毒等功效。用于濕熱痞滿、嘔吐吞酸、瀉痢、黃疸、高熱神昏、心火亢盛、心煩不寐、血熱吐衄、目赤、牙痛、消渴、癰腫疔瘡；外治濕疹、濕瘡、耳道流膿。黃連素是一種重要的生物堿，是我國應(yīng)用很久的中藥?？蓮狞S連、黃柏、三顆針等植物中提取。它具有顯著的抑菌作用。近期文獻(xiàn)報(bào)道生物堿類化合物具有抗流感病毒的功效，黃連素為黃連的主要有效成分，目前還未有其抗流感病毒作用的報(bào)道，因此本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了黃連素具有良好的抗流感病毒活性，表明其具有很好的開發(fā)利用前景。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供黃連素在治療或預(yù)防流感病毒藥物中的應(yīng)用，從而為臨床上流感病毒性疾病的治療提供一種安全有效毒副作用小的天然藥物。為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案黃連素在細(xì)胞和分子水平上對(duì)流感病毒的抑制作用，表明該藥物具有開發(fā)成抗流感病毒的有效藥物而應(yīng)用于臨床。通過血凝效價(jià)試驗(yàn)(HA)與Real-Time熒光定量PCR試驗(yàn)，對(duì)前期篩選的有效藥物的給藥劑量及有效性做出分析。同時(shí)采用體外細(xì)胞模型——MDCK細(xì)胞，從直接殺病毒、抑制病毒的吸附與入侵、抑制病毒的復(fù)制、影響病毒出膜等方面研究藥物的抗病毒機(jī)制。研究結(jié)果表明黃連素在細(xì)胞水平上對(duì)流感病毒具有良好的抗病毒作用，表明該藥物可以作為臨床上潛在的抗病毒藥物進(jìn)一步開發(fā)。本發(fā)明公開了一種黃連素在作為制備治療或預(yù)防流感病毒藥物中的應(yīng)用，從細(xì)胞和分子層面對(duì)黃連素抗流感病毒作用進(jìn)行了評(píng)價(jià)，為其進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用奠定了良好的基石出。由于黃連素具有一定的抗感染和炎癥作用，同時(shí)在臨床上用于腸炎性疾病有很好的應(yīng)用基礎(chǔ)，而病毒所引起的傳染性疾病發(fā)生過程中常伴隨有炎癥反應(yīng)，故該藥物在治療病毒性疾病的同時(shí)對(duì)病毒所引起的炎癥等癥狀均有較好的緩解和輔助治療作用。目前黃連素在臨床上主要以片劑用于腸炎性疾病，結(jié)合現(xiàn)代常用藥物制劑手段，可將其制成薄膜包衣片、膠囊劑、顆粒劑、分散劑，口服。在治療流感病毒感染及其并發(fā)癥的藥物中可加入該藥成分或在治療過程中聯(lián)合用藥使用該藥。相對(duì)于目前的其他抗流感病毒藥物而言，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果1、該藥物是一種純天然藥物，具有毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)。2、對(duì)甲、乙、丙型流感病毒均有效。3、既有治療作用，也有預(yù)防作用。4、可口服給藥，使用方便。5、為非核苷類化合物，兼有抗炎作用，故能提高治療過程中的耐受性，提高治療質(zhì)量和給藥依從性，減輕治療痛苦。A、黃連素的獲得黃連素(化學(xué)名為鹽酸小檗堿，C20H18ClNO4.2H20)，主要從毛茛科植物黃連CoptischinensisFranch.、三角葉黃連CoptisdeltoideaC.Y.ChengetHsiao或云連CoptisteetaWall.的干燥根莖中中分離獲得，采用《中藥植物化學(xué)》中生物堿的提取分離純化手段和技術(shù)路線，其純度經(jīng)HPLC檢測(cè)有98%以上。B、黃連素的功效研究簡(jiǎn)述黃連素主要來源于藥用植物黃連，該植物是傳統(tǒng)中醫(yī)藥中一味很重要的清熱解毒良藥。黃連素在臨床中一直作為非處方藥用于治療腹瀉，但是現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)黃連素具有顯著的抗心力衰竭、抗心律失常、降低膽固醇、抑制血管平滑肌增殖、改善胰島素抵抗、抗血小板、抗炎等作用，因而在心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面將可能有廣泛、重要的應(yīng)用前景，日益受到重視。黃連素是一種重要的生物堿，是我國應(yīng)用很久的中藥?？蓮狞S連、黃柏、三顆針等植物中提取。它具有顯著的抑菌作用，常用來治療細(xì)菌性胃腸炎、痢疾等消化道疾病。臨床主要用于治療細(xì)菌性痢疾和腸胃炎，它無抗藥性和副作用。而關(guān)于其在流感病毒性疾病治療方面還未見報(bào)道和應(yīng)用。故本發(fā)明是對(duì)其新藥用價(jià)值的發(fā)現(xiàn)，對(duì)流感病毒性疾病的治療提供了一種新的有效藥物。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果1、黃連素在較大濃度范圍內(nèi)沒有細(xì)胞毒性。采用H5m來感染MDCK細(xì)胞或者A549等流感病毒易感染細(xì)胞，在病毒細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)后，加入不同濃度的黃連素，檢查黃連素加入前后感染流感病毒細(xì)胞的OD值，計(jì)算細(xì)胞的存活率，表1黃連素對(duì)MDCK細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果濃度OD570(mean±SD)500ug/ml0.891±0.013100ug/ml0.974±0.03620ug/ml0.891±0.0344ug/ml0·859±0.0550.8ug/ml0.986±0.0510.16ug/ml0.814±0.038normal0.76233±0.063由表1可以看出黃連素在比較大的濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞沒有毒性，表明藥物的安全性較好。2、黃連素能夠提高細(xì)胞對(duì)病毒感染的預(yù)防作用采用血凝效價(jià)實(shí)驗(yàn)(HA)檢測(cè)藥物對(duì)病毒的抑制率和藥物的作用模式，進(jìn)行藥物的作用機(jī)制初步探討，從藥物對(duì)病毒的吸附和入侵、病毒在細(xì)胞體內(nèi)的復(fù)制、藥物對(duì)病毒的殺傷作用、藥物影響細(xì)胞抗流感病毒感染等角度進(jìn)行了作用特點(diǎn)的初步探討表2不同給藥方式對(duì)流感病毒復(fù)制的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>結(jié)果顯示黃連素和病毒共同孵育之后加入到細(xì)胞之中的抑制病毒作用效果與病毒感染細(xì)胞后再加入藥物的作用結(jié)果類似，表明黃連素不能直接殺傷病毒，但是能夠抑制病毒的復(fù)制。藥物加入到細(xì)胞之后再將病毒加入到細(xì)胞之中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其抑制病毒的作用效果與其他給藥方式也沒有明顯差異性，說明藥物能夠提高細(xì)胞對(duì)病毒的抵抗作用，但是并不能阻止病毒的入侵。3、黃連素能夠抑制病毒感染所導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)采用PGE2檢測(cè)試劑盒，分別在36、48h時(shí)收集病毒感染后的A549細(xì)胞上清液，按照試劑盒測(cè)定方法測(cè)定細(xì)胞上清中的PGE2含量。表3藥物對(duì)流感病毒感染A549細(xì)胞上清液中PGE2的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>結(jié)果顯示病毒感染細(xì)胞48小時(shí)后炎癥反應(yīng)比較明顯，黃連素在使用48小時(shí)后明顯降低PGE2的含量，表明藥物能夠較低病毒感染過程中所導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，起到保護(hù)機(jī)體的功能。圖1藥物細(xì)胞毒性試驗(yàn)，不同濃度藥物加入到細(xì)胞中培養(yǎng)24h后，采用MTT觀察藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。圖2黃連素在100μg/ml濃度時(shí)加入到MDCK細(xì)胞中培養(yǎng)24h后，電子顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。A沒有藥物處理組；B加入黃連素處理組。圖3不同濃度藥物加入到病毒感染細(xì)胞之后培養(yǎng)48h時(shí)，采用MTT測(cè)定細(xì)胞存活率情況。圖4血凝效價(jià)試驗(yàn)(48h)不同濃度藥物對(duì)病毒增殖的抑制作用。圖5不同的藥物加入到感染病毒的MDCK細(xì)胞中，通過HA試驗(yàn)來檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞上清中的病毒滴度。圖6采用噬斑法(plaquereduceassay)的方法檢測(cè)黃連素對(duì)流感病毒的抑制作用。(狗腎傳代單層細(xì)胞感染A型流感病毒，經(jīng)過1小時(shí)吸附，除去細(xì)胞上清液，并加入2ml含藥培養(yǎng)基(藥物濃度為lOOug/ml)，培養(yǎng)24小時(shí)后，取細(xì)胞上清液，收集150ul細(xì)胞上清液加入到另一長(zhǎng)滿單層MDCK細(xì)胞的6孔板中，在37°C作用1小時(shí)后，然后在感染的細(xì)胞中覆蓋含0.5%瓊脂的固體培養(yǎng)基。孵化后3天在37°C，10%福爾馬林膜固定，染色，結(jié)晶紫染色。藍(lán)染色表明細(xì)胞沒有受到病毒影響；未染色而出現(xiàn)空斑的結(jié)果表明細(xì)胞受到流感病毒的侵蝕。圖7.加入不同藥物的感染H5W的MDCK細(xì)胞，進(jìn)行免疫熒光試驗(yàn)。A.未感染病毒的陰性對(duì)照；B.感染病毒的細(xì)胞對(duì)照；C.為感染病毒后加入黃連素的實(shí)驗(yàn)組；D.為感染病毒后加入金剛烷胺的實(shí)驗(yàn)組。圖8采用real-timePCR檢測(cè)藥物對(duì)流感病毒復(fù)制過程病毒載量的影響。A.NP特異性片段mRNA(*p<0.05；**p<0.01)；B.NP特異性片段cRNA(*p<0.05；**p)；C.NP特異性片段vRNA(*p<0.05；**p<0.01)。圖9.1不同給藥方式時(shí)藥物對(duì)流感病毒的抑制作用。在藥物作用24小時(shí)收集細(xì)胞上清液，采用HA檢測(cè)病毒滴度。數(shù)據(jù)為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(每個(gè)濃度3個(gè)平行)。與模型組比較，*p<0.05(病毒滴度的差異超過2倍可視為有顯著性差異)，結(jié)果藥物并不能影響病毒的吸附與入侵。圖9.2不同給藥方式時(shí)藥物對(duì)流感病毒的抑制作用。在藥物作用36小時(shí)收集細(xì)胞上清液，采用HA檢測(cè)病毒滴度。數(shù)據(jù)為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(每個(gè)濃度3個(gè)平行)。與模型組比較，*p<0.05(病毒滴度的差異超過2倍可視為有顯著性差異)，結(jié)果藥物并不能影響病毒的吸附與入侵。圖9.3不同給藥方式時(shí)藥物對(duì)流感病毒的抑制作用。在藥物作用48小時(shí)后收集細(xì)胞上清液，采用HA檢測(cè)病毒滴度。數(shù)據(jù)為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(每個(gè)濃度3個(gè)平行)。與模型組比較，*p<0.05(病毒滴度的差異超過2倍可視為有顯著性差異)，結(jié)果藥物并不能影響病毒的吸附與入侵。圖10.1哺乳動(dòng)物雙雜交試驗(yàn)檢測(cè)測(cè)定NP和黃連素之間的相互作用實(shí)驗(yàn)。在HeLa細(xì)胞中，分別轉(zhuǎn)染報(bào)告質(zhì)粒pG5Luc和測(cè)試質(zhì)粒pvP16核蛋白(NP)攜帶NP基因，然后在6h后分別添加藥物。NP和藥物相互作用的熒光素酶活性測(cè)定。質(zhì)粒pVP16(VP16)為陰性對(duì)照和本底控制對(duì)照。數(shù)據(jù)為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(3個(gè)平行樣)。與陽性對(duì)照比較，*p<0.05；**p<0.01表示有顯著性差異。圖10.2哺乳動(dòng)物雙雜交試驗(yàn)檢測(cè)黃連素是否抑制NP與NP之間的相互作用。圖10.3動(dòng)物雙雜交試驗(yàn)檢測(cè)黃連素素是否抑制NP、PB2蛋白間的相互作用圖10.4乳動(dòng)物雙雜交試驗(yàn)檢測(cè)黃連圖11為一種族什圖是否抑制NP、PBl蛋白間的相互作用圖12為工藝流程圖。具體實(shí)施例方式一種黃連素在治療或預(yù)防流感病毒藥物中的應(yīng)用，其應(yīng)用過程是目前常采用的四甲基偶氮唑鹽(MTT)法，檢測(cè)藥物對(duì)流感病毒感染后MDCK細(xì)胞存活率的差異性進(jìn)行藥物篩選。另外也有一些針對(duì)流感病毒復(fù)制的關(guān)鍵酶進(jìn)行的藥物體外篩選，但是相比而言，采用細(xì)胞培養(yǎng)篩選的方法會(huì)更簡(jiǎn)單，并可以系統(tǒng)探討藥物的有效濃度和治療指數(shù)，為后期機(jī)理研究提供更多基礎(chǔ)。工藝流程圖請(qǐng)見圖12。實(shí)施例1黃連素抗流感病毒活性的評(píng)價(jià)1、材料細(xì)胞、病毒和質(zhì)粒MDCK細(xì)胞由中國科學(xué)院山東醫(yī)學(xué)微生物研究所提供，A549細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、病毒H5m或H3N2購于中國典型微生物保藏中心；pVP-16-NP、pM-PBUpM_PB2、pVP_16_NP、pG5Luc質(zhì)粒由武漢大學(xué)病毒學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)病毒學(xué)研究課題組吳建國教授指導(dǎo)完成，pG5Luc為帶有綠色熒光GFP的報(bào)告基因載體，質(zhì)粒pVP_16_NP、pM-PBUpM_PB2、pVP-16-NP分別是流感病毒的不同蛋白連接到載體pVP和pM上，相關(guān)詳細(xì)信息可見本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)發(fā)表的論文——Mukhtar，Μ.M.，Li，S.，Li，W.，Wan,Τ.，Mu,Y.，Wei，W.，Kang,L.,Rasool,S.Τ.,Xiao,Y.,Zhu,Y.,andWu,J.(2009).Single-chainintracellularantibodiesinhibitinfluenzavirusreplicationbydisruptinginteractionofproteinsinvolvedinviralreplicationandtranscription.IntJBiochemCellBiol41(3)，554-60.)2、工具酶LA-taq,LC_taq，M-MLVReverseTranscriptase,M-MLVRT5XBuffer,RNAexhibit購自寶生物(TaKara)公司；3、其他試劑DMEM粉劑購自Gibco公司；Sofast轉(zhuǎn)染試劑，購自上海太陽馬公司；測(cè)熒光儀^=TurnerBioSystemsTD-20/20-HiSi十(TurnerDesigns,Sunnyvale,CA)；TRIzol試劑購自Gibco公司；黃連素(Berberine)均為自制，HPLC檢測(cè)純度為98%以上。藥物毒性檢測(cè)試驗(yàn)首先對(duì)不同藥物濃度對(duì)MDCK細(xì)胞毒性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。1、消化T25瓶中MDCK細(xì)胞，加適量細(xì)胞培養(yǎng)基，吹打細(xì)胞10_15次。2、將細(xì)胞鋪到96孔板中，放置于培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h待用。3、將培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞取出，倒去原有培養(yǎng)液，換用2%FBS的維持培養(yǎng)基稀釋的梯度藥物，培養(yǎng)24h待用。4、然后加入不同濃度的藥物，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，棄培養(yǎng)液上清，于培養(yǎng)板加入5mg/mLMTT液50μL/孔(以不含血清的DMEM培養(yǎng)基配制成)，置C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。5、培養(yǎng)2_3h后，棄MTT上清，PBS洗3次，每孔加溶解液(DMS0乙醇體積比為11)100μL，振蕩5-10分鐘。6、待結(jié)晶完全溶解，置酶標(biāo)測(cè)定儀上，測(cè)定570nm(490nm)波長(zhǎng)處的光密度OD值。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>7、找出藥物對(duì)細(xì)胞的最大無毒濃度范圍。結(jié)果顯示藥物在0.16ug/ml——500ug/ml的范圍對(duì)該細(xì)胞沒有明顯細(xì)胞毒性(圖1.)，在顯微鏡下觀察細(xì)胞也沒有病變發(fā)生(圖2.)，因此說明藥物有比較安全的適用范圍。黃連素抗H5W病毒的篩選試驗(yàn)A、HA檢測(cè)藥物是否具有抗流感病毒作用1、用胰酶將生長(zhǎng)良好的MDCK細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞懸液，按1X105/mL濃度分加于48孔板，每孔0.2mL。2、置37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。將培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞取出，倒去原有培養(yǎng)液，換上無血清無抗性的培養(yǎng)基，加1M.0.I的病毒液，于37°C孵育1-2小時(shí)。3、倒出病毒液，換用換用2%FBS的維持培養(yǎng)基稀釋的梯度藥物。設(shè)空白對(duì)照、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)組藥物有六個(gè)梯度。4、置37°C、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，36h后收集各實(shí)驗(yàn)孔病毒上清進(jìn)行血凝實(shí)驗(yàn)。5、選用96孔血凝實(shí)驗(yàn)板，除第一孔外，每孔加入75μL的PBS。6、第一孔加入75μL待測(cè)病毒懸液，然后等比稀釋，至第12孔時(shí)棄去75μL。7、每孔加入雞紅細(xì)胞懸液75μL，輕彈實(shí)驗(yàn)板，使紅細(xì)胞與病毒充分混合，室溫(20-25°C以下相同)靜置30min、45min、60min時(shí)，觀察血凝現(xiàn)象并記錄結(jié)果。8、以靜置45min時(shí)的血凝現(xiàn)象為最終結(jié)果。以出現(xiàn)“++”(即紅細(xì)胞在孔底形成一個(gè)環(huán)狀，四周有小凝集塊)的流感病毒最高稀釋度為血凝終點(diǎn)，該稀釋度的倒數(shù)即為流感病毒的血凝滴度。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)生理鹽水對(duì)照(排除血細(xì)胞自身的非特異性凝集)和病毒對(duì)照。9、處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，得出試驗(yàn)組各藥物抗病毒的最佳濃度。10、按上述試驗(yàn)結(jié)果，取各藥物抗病毒的最佳濃度進(jìn)行試驗(yàn)。11、重復(fù)上述1-9的步驟，此時(shí)，只加入抗病毒藥物的最佳濃度(無需做梯度試驗(yàn))，分別于24h、36h、48h取上清做病毒的時(shí)間相關(guān)性試驗(yàn)。在上述基礎(chǔ)上，考察了不同劑量的給藥是否對(duì)流感病毒表現(xiàn)出不同的作用，結(jié)果顯示黃連素作用于流感病毒時(shí)也沒有明顯的劑量依耐性關(guān)系(圖3.)，可能原因是藥物使用安全濃度范圍內(nèi)，藥物已經(jīng)在較低劑量時(shí)已經(jīng)達(dá)到了較好的抑制病毒復(fù)制作用，而隨著藥物濃度的增加，其作用效果并不會(huì)發(fā)生明顯變化，也提示該藥物在治療時(shí)劑量可以適當(dāng)調(diào)整。同時(shí)檢測(cè)了藥物處理病毒感染后的細(xì)胞上清液中的病毒滴度，結(jié)果同樣表明不同藥物的作用效果比較近似(圖4)，雖然沒有劑量依賴性關(guān)系，但也說明藥物的細(xì)胞毒性較低，藥物能夠在較低濃度和較大濃度范圍內(nèi)發(fā)揮抗病毒作用。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用黃連素和金剛烷胺的細(xì)胞給藥濃度均為lOOug/ml，探討了不同作用時(shí)間后病毒感染細(xì)胞上清液中病毒滴度，以病毒稀釋倍數(shù)來計(jì)數(shù)，結(jié)果圖5所示，不同作用時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示病毒滴度隨著病毒感染時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增加，在48h達(dá)到最高值，而黃連素和陽性對(duì)照藥物金剛烷胺在24h時(shí)就表現(xiàn)出良好的抑制病毒效果，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其抑制病毒的作用也在增強(qiáng)，表明藥物能夠抑制病毒的復(fù)制，并能維持作用時(shí)間。B、噬斑法檢測(cè)黃連素是否具有抗流感病毒的作用實(shí)驗(yàn)過程病毒感染細(xì)胞Ih后，然后分別加入不同藥物，在藥物作用24h后，分別收集細(xì)胞上清液150ul，加入到已經(jīng)長(zhǎng)滿單層細(xì)胞的六孔板，在病毒上清液吸附Ih之后，按照傳統(tǒng)噬斑法加入0.5%瓊脂糖，然后繼續(xù)培養(yǎng)72h，0.4%的甲醛固定后，采用結(jié)晶紫染色，觀察藥物作用后噬斑情況。結(jié)果顯示黃連素具有比較好的抗病毒復(fù)制作用，病毒感染的細(xì)胞中加入黃連素其細(xì)胞比較完整，幾乎看不到病毒蝕斑，其作用效果類似于陽性對(duì)照藥金剛烷胺(圖6)。C、免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)病毒感染細(xì)胞1、免疫熒光染色操作1、固定液的準(zhǔn)備用4%多聚甲醛作為固定液，或根據(jù)特定的一抗或樣品用有效成分為乙醇、甲醇或其它類型的固定液。2、洗滌液的準(zhǔn)備10XTBS的配制稱取24.2gTris(Tris堿)，80gNaCl；用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.6，定容至一升。TBS配制把10XTBS按照19的比例用水稀釋至IX即為TBS。TBSTx的配制在TBS中加入TritonX-100使最終濃度為0.1%，混勻，即為TBSTx。3、封閉液的準(zhǔn)備配制含5%BSA的TBSTx作為封閉液含5%BSA的TBSTx的配制在100毫升TBSTx中加入5克BSA，溶解并混勻，即為含5%BSA的TBSTx。4、一抗稀釋液的準(zhǔn)備使用上述封閉液，即含5%BSA的TBSTx，作為一抗稀釋液。一抗的稀釋一抗為鼠抗人H5WHA單克隆抗體。按照一抗說明書中推薦的用于免疫熒光染色的稀釋比例用一抗稀釋液稀釋一抗。5、熒光標(biāo)記二抗的稀釋把熒光標(biāo)記的二抗，按照11000的比例用本試劑盒提供的免疫熒光染色二抗稀釋液進(jìn)行稀釋。根據(jù)熒光的強(qiáng)弱，稀釋的比例可以適當(dāng)提高或降低。在熒光顯微鏡下，其結(jié)果如圖7所示。陰性對(duì)照組在激發(fā)光下不產(chǎn)生熒光；在視野中病毒感染未加任何藥物處理對(duì)照組在綠色激發(fā)熒光下產(chǎn)生非常多的紅色熒光，表明細(xì)胞中表達(dá)的HA蛋白量很大，證明被流感病毒感染的MDCK細(xì)胞很多；加入藥物UA與多肽165的實(shí)驗(yàn)組熒光結(jié)果與病毒感染對(duì)照組相似，說明這兩種藥物沒有明顯的抗病毒作用；加入藥物黃連素的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，被激發(fā)出的熒光少且熒光較弱，可見被感染H5W病毒、并表達(dá)HA蛋白的細(xì)胞較少，說明黃連素具有很顯著的抗病毒作用；陽性對(duì)照組金剛烷胺的熒光效果與黃連素相近。D、Real-TimeRT-PCR檢測(cè)黃連素對(duì)病毒復(fù)制的影響為了檢測(cè)藥物對(duì)病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的影響，通過實(shí)時(shí)熒光定量試驗(yàn)檢測(cè)了A型流感病毒三種不同形式的病毒RNA(mRNA、cRNA、vRNA)。不同藥物加入感染H5W病毒的MDCK細(xì)胞，4小時(shí)后收樣提取RNA。用不同的引物將病毒的mRNA、cRNA、vRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再通過熒光定量試驗(yàn)，檢測(cè)病毒mRNA、cRNA、vRNA的量。引物設(shè)計(jì)1、RT-PCR引物mRNA5，_ττττττττττττττττττ_3，NP-cRNA5’-AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCTTTAATTGTCAT-3’NP-vRNA5’-CTCACCGAGTGACATCAACATCATG-3’2、Real-TimePCR引物NPsense5，-GGATTTGGCGTCAAGCGAACA-3，antisense5’-GTCCCTACCCCCTTTACTGC-3’r-actin:sense5，-TCTGTCAGGGTTGGAAAGTC-3，antisense5，-AAATGCAAACCGCTTCCAAC-3，病毒RNA的提取1、用6孔板培養(yǎng)MDCK細(xì)胞，加入病毒1.5h后分別加入最佳濃度的藥物，設(shè)空白對(duì)照、陽性對(duì)照與陰性對(duì)照；2、4h后每孔加入ImlTrizol勻漿；3、移入1.5ml新離心管；4、冰上孵育5分鐘；5、離心12，000rpm4°C5分鐘取上清液移入1.5ml新離心管；6、加0.2ml氯仿，震蕩，冰上孵育5分鐘；7、12，OOOrpm4°C離心10分鐘取上層液移入1.5ml新離心管；8、加0.5ml異丙醇，震蕩，冰上孵育5分鐘；9、12，000rpm4°C離心5分鐘棄去上清液；10、加入Iml75%乙醇，震蕩；11、離心7，500rpm4°C5分鐘棄去上清液；12、室溫下使之變透明；13、加入DEPC處理水10μ1-35μ1溶解RNA(可保存在液氮或低溫冰箱)。RT-PCR反應(yīng)體系第一步RNA抽提物2μ1，20mM引物各Ιμ，70°C10分鐘，立即放入冰浴。第二步5xPT-PCR緩沖液5μ1，RNAsin0.5μ1,25mMMgC121.5μ1,2.5mMdNTP2μ1,AMV逆轉(zhuǎn)錄酶Ιμ，無菌水Ιμ;37°C1.5小時(shí)，94°ClOmin。Real-TimePCR反應(yīng)體系上下游引物各IulIOxPCR緩沖液2.5μ1，25mMMgC121.5μ1,DNA模板Ιμ，SYBRgreenI1μ1,2.5mMdNTP2μ1,Taq酶1μ1,無菌水14μ1;反應(yīng)條件1、95°C5分鐘，為第一個(gè)步1個(gè)循環(huán)；2、95°C30秒，55°C30秒，72°C1分鐘為第二步40個(gè)循環(huán)；3、72°C10分鐘。Real-TimePCR的結(jié)果表明相對(duì)于對(duì)照組，病毒NP特異片段的mRNA在金剛烷胺(P<0.01)、黃連素(ρ<0.01)與UA(ρ<0.05)的作用下顯著減少(圖8)。病毒NP特異性片段的cRNA能顯著的被黃連素(ρ<0.01)和金剛烷胺(ρ<0.01)所抑制，并且黃連素的作用效果要高于金剛烷胺；相對(duì)于對(duì)照組，多肽165(ρ<0.05)與對(duì)NP的cRNA的形成也有很強(qiáng)的抑制作用(圖8)。而病毒NP片段的vRNA只有在金剛烷胺(ρ<0.01)存在時(shí)，才會(huì)顯著降低；實(shí)施例2黃連素預(yù)防病毒感染、對(duì)流感病毒吸附入侵、復(fù)制的影響分別將鋪成單層的細(xì)胞進(jìn)行不同的處理方式藥物預(yù)先加入到細(xì)胞中孵育Ih之后，換液，加入相應(yīng)的流感病毒；藥物對(duì)流感病毒吸附入侵采用藥物加入到病毒中共同孵育lh，然后再加入到細(xì)胞中；藥物對(duì)流感病毒的復(fù)制影響，采用病毒先感染細(xì)胞Ih后，然后加入藥物。所有實(shí)驗(yàn)中使用的藥物濃度均為lOOug/ml，病毒感染量為1M.0.I的病毒液。分別在24、36、48h時(shí)采集部分上清，采用HA測(cè)定藥物的抗病毒作用。結(jié)果如圖9所示，黃連素不影響病毒的吸附和入侵，但是對(duì)病毒的復(fù)制抑制作用比較明顯，同時(shí)藥物具有一定的預(yù)防作用，能夠提高細(xì)胞對(duì)病毒感染的抵抗作用。實(shí)施例3哺育動(dòng)物雙雜交試驗(yàn)探討藥物對(duì)復(fù)制過程中一些酶的影響1、細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒分別為pM-PBl、pM-PB2、pVP_16_NP、pG5Luc。本試驗(yàn)組設(shè)陰性對(duì)照不加入任何質(zhì)粒，陽性對(duì)照加入pM-PBl(或pM-PB2)、pVP_16_NP、pG5Luc三種質(zhì)粒，實(shí)驗(yàn)組加入pM-PBl(或pM-PB2)、pVP-16-NP、pG5Luc三種質(zhì)粒與各種藥物。Sofast脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染以下轉(zhuǎn)染操作以24孔板為例。轉(zhuǎn)染全過程必須嚴(yán)格無菌操作。1.在轉(zhuǎn)染前一天將待轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種于24孔板中，37°C培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前的細(xì)胞密度以40-60%為準(zhǔn)。2.準(zhǔn)備以下溶液①稀釋1.5μISofast試劑于30μ1無血清、無抗菌素的DMEM培養(yǎng)基?；靹蚝笫覝仂o置3分鐘。②稀釋0.6μg待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA于30μ1無血清、無抗菌素的DMEM培養(yǎng)基?；靹蚝笫覝仂o置。3.混合①、②兩種溶液，室溫靜置20分鐘。4.棄掉培養(yǎng)板中的舊培養(yǎng)基，加入0.5ml無血清、無抗菌素的DMEM培養(yǎng)基。5.加入上述Sofast試劑-DNA混合物于24孔板。6.37°C溫育4-6小時(shí)后換10%血清和抗生素的DMEM培養(yǎng)基。7.24后換無血清DMEM培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)。8.48-72小時(shí)后檢測(cè)。2、熒光素酶活性測(cè)定1、取出熒光素酶底物和熒光素酶裂解液在室溫下平衡。2、用PBS漂洗細(xì)胞。此過程必須仔細(xì)，不要接觸貼壁細(xì)胞。最后盡可能將PBS吸出ο3、加入足夠的裂解緩沖液以覆蓋細(xì)胞。例如400μl/60mm培養(yǎng)皿，900μ1/lOOmm培養(yǎng)皿或96孔板每孔20μ1。晃動(dòng)培養(yǎng)皿數(shù)次以保證裂解緩沖液完全覆蓋細(xì)胞。4、將細(xì)胞從培養(yǎng)皿刮下。將細(xì)胞及所有的液體轉(zhuǎn)移至一個(gè)離心管中。將離心管置于冰上。旋渦震蕩離心管5-10秒鐘，然后以12000g離心15秒鐘(室溫)，將上清液轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的試管中。5、取約30μ1(所用裂解液總量為100μ1)與50μ1的平衡好的底物在一個(gè)1.5ml的Ep管中混合，然后立即在TurnerBioSystemsTD-20/20熒光光度計(jì)(TurnerDesigns，Sunnyvale,CA)上檢測(cè)樣品的熒光素酶的活性。黃連素(Berberine)不能抑制病毒的吸附入侵。所以通過哺乳動(dòng)物雙雜交試驗(yàn)，檢測(cè)黃連素是否通過抑制病毒的核蛋白(NP)與PB1、PB2之間的相互作用從而影響病毒的復(fù)制。試驗(yàn)結(jié)果如圖10.1所示各實(shí)驗(yàn)組藥物對(duì)NP、PB1蛋白間相互作用沒有很顯著的影響(圖10.2)；而黃連素能抑制NP、PB2蛋白間的相互作用，相對(duì)于陽性對(duì)照，抑制率達(dá)到50%(圖10.3)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃連素可能是通過降低NP、PB2的結(jié)合而抑制病毒的復(fù)制。黃連素對(duì)流感病毒感染所引起的炎癥反應(yīng)的影響作用采用PGE2檢測(cè)試劑盒，分別在36、48h時(shí)收集病毒感染后的A549細(xì)胞上清液，按照試劑盒測(cè)定方法測(cè)定細(xì)胞上清中的PGE2含量。結(jié)果如圖11所示，病毒感染細(xì)胞36小時(shí)時(shí)產(chǎn)生的PGE2沒有明顯變化，且含量很低，等病毒感染細(xì)胞48小時(shí)測(cè)定時(shí)，病毒感染未加任何藥物處理的細(xì)胞組PGE2含量最高，與正常細(xì)胞對(duì)照組和用藥組有顯著性差異(*p<0.05；**p<0.01)，黃連素和陽性對(duì)照藥金剛烷胺能夠顯著降低PGE2的分泌(與病毒感染組比較，*P<0.05；**p<0.01)。說明黃連素能夠顯著降低病毒感染過程中引起的一些炎癥因子的分泌。權(quán)利要求一種黃連素在制備治療或預(yù)防流感病毒藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種黃連素在制備治療流感病毒藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明證實(shí)黃連素在體外對(duì)H5N1、H3N2等A型流感病毒感染的MDCK細(xì)胞和A549細(xì)胞均具有良好的抗流感病毒作用。同時(shí)黃連素對(duì)流感病毒具有一定的殺傷作用，能夠預(yù)防流感病毒的侵襲，并對(duì)流感病毒感染后的細(xì)胞具有較好的抑制作用，其作用效果與陽性對(duì)照藥金剛烷胺比較近似，另外黃連素對(duì)流感病毒引起的炎癥反應(yīng)也有較好的抑制作用，揭示該藥物有開發(fā)成抗流感病毒藥物的前景。文檔編號(hào)A61P31/16GK101829113SQ20091006316公開日2010年9月15日申請(qǐng)日期2009年7月14日優(yōu)先權(quán)日2009年7月14日發(fā)明者吳建國,朱應(yīng),袁婷婷,陶君彥申請(qǐng)人:武漢大學(xué)