專利名稱：巴馬丁在治療黃熱病毒感染藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域,更具體涉及一種巴馬丁在制備治療或預(yù)防黃熱病 毒感染藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
黃熱病毒(yellow fever virus, YFV)屬于黃病毒科黃病毒屬的成員，在該 屬中還包括西尼羅病毒，登革病毒，流行性乙型腦炎病毒等。黃熱病毒能夠引起 黃熱病，該病為急性傳染病。國際上己將黃熱病定為檢疫傳染病，中國也將其定 為甲類傳染病。1648年，美洲的YUCATAN半島首次證實黃熱病的流行。17 19世紀，此病通過交通運輸被帶到歐洲及北美，在差不多兩個世紀內(nèi)，黃熱病 成為美、非、歐三大洲一些地方最嚴重的瘟疫之一，造成大量人群死亡。20世 紀以來，本病在北美及歐洲未再發(fā)生，但在中、南美、非洲的一些國家和地區(qū)仍 不時流行。據(jù)WHO(1983)報告，1979 1982年期間，黃熱病在非洲發(fā)生50例， 南美洲發(fā)生695例，估計實際病例數(shù)為上述報告數(shù)的35 480倍。埃及伊蚊是 主要傳播媒介。迄今為止，中國尚無病例的報道，但是這并不能使我們放松對該 病毒的警惕，因為中國的氣候、地理環(huán)境復(fù)雜，蚊蟲種類繁多,具備傳播條件，同 時隨著國際交流的日益頻繁,YFV傳入中國境內(nèi)的可能性非常大。
因此，我們應(yīng)該高度重視對黃熱病毒的研究，加強對其的科研力度，做好 相關(guān)知識和藥物的儲備。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種巴馬丁在制備治療或預(yù)防黃熱病毒感染藥物 中的應(yīng)用，巴馬丁在10ppM濃度下對YFV的抑制率為96.58%。而巴馬丁在濃 度為100 liM條件下，Vero細胞的存活率為92.93%。巴馬丁能夠有效地抑制黃熱病毒的增殖，但是對細胞毒性很小，可進一步開發(fā)為治療這些病毒感染引起的疾病的藥物，具有廣泛的應(yīng)用前景。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案
巴馬丁來源于中藥黃連，是黃連的主要成份之一，目前，巴馬丁己經(jīng)在臨床上用于治療婦科炎癥，菌痢,腸炎，呼吸道及泌尿道感染,外科感染等。
A. 巴馬丁對Vero細胞的毒性實驗
Vero細胞是YFV的易感細胞。因此，本實驗首先檢測巴馬丁對Vero細胞的細胞毒性，以不同濃度的巴馬丁作用于Vero細胞，來了解在細胞存活率為90%以上的巴馬丁的最大使用濃度，為后續(xù)的巴馬丁對YFV的抑制作用實驗提供參考數(shù)據(jù)。
B、 巴馬丁對YFV的抑制實驗
以不同濃度的巴馬丁作用于己經(jīng)感染了 YFV的Vero細胞，來獲得巴馬丁對病毒的抑制效率。本實驗中的巴馬丁的使用濃度均在使Vero細胞在90%以上存活率的濃度的范圍內(nèi)，因此，可以排除巴馬丁的濃度過高而對實驗數(shù)據(jù)的分析產(chǎn)生影響。
一種巴馬丁在制備治療或預(yù)防黃熱病毒感染藥物中的應(yīng)用，其步驟是-A.巴馬丁對Vero細胞的毒性實驗
Vero細胞(非洲綠猴腎細胞)是YFV的易感細胞。實驗中的Vero細胞購買于中國科學(xué)院上海生科院細胞資源中心；MTT試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所；胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)購買于美國GIBCO公司；細胞培養(yǎng)板購買于德國Greiner bio one公司；DMEM培養(yǎng)基和MEM培養(yǎng)基購買于美國GIBCO公司。實驗步驟如下
1:接種Vero細胞用含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基配成單個細胞懸液，以每孔1000—10000個細胞接種到96孔細胞培養(yǎng)板，每孔接種體積
100 pi;
2:培養(yǎng)Vero細胞在37°C, 5% (v/v) C02培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)2天；3:加入巴馬丁吸棄每個孔中的DMEM培養(yǎng)基，向各個孔中加入IOO pl用含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成相應(yīng)濃度(0 pM, 0.4 ^M, 1.2 pM,3.7 pM， 11 ^tM， 33 ^M, 100 300 (aM)的巴馬丁，對照孔加不加含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基100 nl;
4:呈色培養(yǎng)48小時后，每孔加MTT溶液IO pi,在37 °C，5% (v/v) C02培養(yǎng)條件下繼續(xù)孵育4小時，然后加入Formazan溶解液，在37 °C, 5% (v/v) C02培養(yǎng)條件下繼續(xù)孵育4小時，直至在普通光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)formazan全部溶解；
5.測量在570nm測定吸光值。
表1不同濃度的巴馬丁對Vero細胞的毒性實驗
Concentration(pM)OD57o nm
00.7880,7670.834
0.40,8100.7380.764
1.20.7420.8020.812
3.70.7340.7460.758
110.7540.8010.747
330.7390.7630.766
1000,7180.7470.753
3000.6310.6960.674
B、巴馬丁對YFV的抑制實驗:
以Vero細胞為培養(yǎng)病毒YFV的細胞,MOI為0.1 ，實驗步驟如下在24孔細胞培養(yǎng)板中接入Vero細胞，24小時后細胞長至單層(細胞覆蓋孔底的面積約為80-90%)，吸出培養(yǎng)基，接入病毒樣品200 pl， 37 。C吸附2小時。吸附完成后，吸棄各孔中的病毒液，用DMEM培養(yǎng)基洗去未吸附的病毒。加入用含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋的指定濃度(0 pM， 0.41.2 )^M， 3.7 11 )LiM， 33 100 pM)的巴馬丁，于37 。C、 5% (v/v) C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42小時，收集各個孔中的上清，做病毒噬斑實驗。
病毒噬斑實驗在24孔板中接入Vero細胞，24小時后細胞長至單層(細胞覆蓋孔底的面積約為80-90%)，吸棄各孔中的培養(yǎng)基，接入用含3% (v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基10倍系列稀釋的病毒樣品200^1， 37°C吸附2小時。吸附完成后將各個孔的上清板吸棄，用10% (v/v) FBS的DMEM培養(yǎng)基洗去未吸附的病毒。加入新鮮的45r預(yù)熱的半固定培養(yǎng)基[A成分3% (v/v) FBS，2xMEM培養(yǎng)基，青霉素(美國AMRESCO)和鏈霉素(美國AMRESCO)終濃度分別為100U/ml， 0.1mg/ml; B成分1% (w/v)的瓊脂糖(法國Biowest)。 A成
5分B成分-l: 1 (v/v)]，于37。C、 5% (v/v) C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 72小時。待噬斑形成后用結(jié)晶紫(美國AMRESCO)染色(2。/。 (w/v)結(jié)晶紫溶于10%(v/v)甲醛)，2小時后用流水沖去結(jié)晶紫和瓊脂糖，在顯微鏡下對每孔產(chǎn)生的細胞噬斑，根據(jù)噬斑數(shù)和稀釋倍數(shù)計算病毒的滴度(PFU/ml， PFU: plaqueformation unit噬斑形成單位)。PFU-病毒稀釋度xP/V， (P:空蝕斑數(shù)目；V:接種量)。在2次不同的時間進行實驗。
表2不同濃度的巴馬丁對YFV滴度降低實驗
Concentration(nM) Viral titer (105 PFU/mL)
04170
0.43462
1.23458
3.73047
111319
333.75.7
1001.42.4
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果:
本發(fā)明通過對YFV的抑制實驗證實了巴馬丁對YFV具有很好的抑制作用，從本質(zhì)上證明了該藥物在治療YFV感染疾病中具有廣泛的應(yīng)用前景。同時，巴馬丁來源于中藥黃連，獲取十分方便，同時巴馬丁在臨床上已經(jīng)使用多年，因此，其臨床使用很安全性。加強對黃病毒科黃病毒屬病毒引起的疾病重視程度，增強對藥物和疫苗的研發(fā)力度，十分重要。研制抗黃熱病毒引起的疾病的藥物，以便對疾病進行有效的預(yù)防和治療，具有巨大的社會效益和研究價值。巴馬丁來源于中藥，由于中藥是中國重要的自然資源，具有很強的民族特色，而且一些報道也顯示中藥在預(yù)防和治療一些疾病的過程中發(fā)揮著重要的作用。中藥在一定程度上能有效地增強機體的免疫力，毒副作用較小甚至無毒副作用，同時，由于巴馬丁已經(jīng)用于臨床治療婦科炎癥，菌痢,腸炎，呼吸道及泌尿道感染,外科感染等。因此該發(fā)明能夠為臨床治療由YFV引起的疾病提供很好的后選藥物，具有十分良好的應(yīng)用前景。


圖1巴馬丁對Vero細胞的毒性實驗巴馬丁對Vero的細胞毒性實驗，在0 nM, 0.4 |iM, 1.2 ^M, 3.7 ^M， 11 pM， 33pM, 100 nM, 300 nM濃度下，Vero細胞的平均存活率分別為100%, %.87%,98.70%, 93.77%, 96.56%,95.04o/o， 92.93%，83.88%。圖2巴馬丁對YFV的抑制作用
巴馬丁對YFV的抑制作用，在OnM， 0.4 |aM， 1.2 jxM， 3.7 pM， 11 pM, 33pM,lOO 濃度下，分別在不同的時間進行實驗，病毒的滴度分別為4.1 X106PFU/mL， 3.4 X 106 PFU/mL, 3.4 X 106, 3.0X106 PFU/mL， 1.3 X106 PFU/mL， 3.7 X 105PFU/mL, 1.4X 105 PFU/mL和7.0X106 PFU/mL， 6.2 X 106 PFU/mL, 5.8 X106, 4.7 X106 PFU/mL, 1.9X 106 PFU/mL, 5.7X105 PFU/mL， 2.4 X105 PFU/mL,其平均抑制率分別為0%, 14.25%, 17.14%, 29.84%， 70.57%， 91.42%， 96.58%。圖3巴馬丁的結(jié)構(gòu)和分子式中文名巴馬丁英文名Palmatine分子式C21H22N04分子量352.40CAS號3486-67-具體實施例方式
實施例l:
一種巴馬丁在制備治療或預(yù)防黃熱病毒感染藥物中的應(yīng)用，其步驟是A.巴馬丁對Vero細胞的毒性實驗Vero細胞(非洲綠猴腎細胞)是YFV的易感細胞。實驗步驟如下
1:接種Vero細胞用含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基配成單個細胞懸液，以每孔IOOO—10000個細胞接種到96孔細胞培養(yǎng)板，每孔接種體積
腦
2:培養(yǎng)Vero細胞在37°C， 5% (v/v) 0)2培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)2天；3:加入巴馬丁吸棄每個孔中的DMEM培養(yǎng)基，向各個孔中加入IOO pl用含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成相應(yīng)濃度(0pM，0.4pM， 1.2|uM，3.7 |aM, 11 nM, 33 )xM， 100 ^M, 300 pM)的巴馬丁，對照孔加不加含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基100
4:呈色培養(yǎng)48小時后，每孔加MTT溶液IO 在37 °C, 5% (v/v) C02培養(yǎng)條件下繼續(xù)孵育4小時，然后加入Formazan溶解液，在37 °C, 5% (v/v) C02培養(yǎng)條件下繼續(xù)孵育4小時，直至在普通光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)formazan全部溶解；
5. 測量在570nm測定吸光值。
6. 實驗結(jié)果見圖l。
B、巴馬丁對YFV的抑制作用
以Vero細胞為培養(yǎng)病毒YFV的細胞，MOI為O.l，實驗步驟如下1.在24孔細胞培養(yǎng)板中接入Vero細胞，24小時后細胞長至單層(細胞覆蓋孔底的面積約為80-90%)，吸出培養(yǎng)基，接入病毒樣品200pl， 37 'C吸附2小時。吸附完成后，吸棄各孔中的病毒液，用DMEM培養(yǎng)基洗去未吸附的病毒。加入用含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋的指定濃度(0 ^M， 0.4 |nM,1.2 |uM, 3.7岸，11 ^M， 33岸,100 pM)的巴馬丁，于37 。C、 5% (v/v) C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42小時，收集各個孔中的上清，做病毒噬斑實驗。
2. 病毒噬斑實驗在24孔板中接入Vero細胞，24小時后細胞長至單層(細胞覆蓋孔底的面積約為80-90%)，吸棄各孔中的培養(yǎng)基，接入用含3% (v/v)
胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基10倍系列稀釋的病毒樣品200)xl， 37°C吸附2小時。吸附完成后將各個孔的上清板吸棄，用10% (v/v) FBS的DMEM培養(yǎng)基洗去未吸附的病毒。加入新鮮的45'C預(yù)熱的半固定培養(yǎng)基[A成分3% (v/v) FBS，2xMEM培養(yǎng)基，青霉素和鏈霉素終濃度分別為100 U/ml， 0.1 mg/ml; B成分1% (w/v)的瓊脂糖(法國Biowest)。 A成分B成分=1: 1 (v/v)]，于37°C、5% (v/v) C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 72小時。待噬斑形成后用結(jié)晶紫(美國AMRESCO)染色(2% (w/v)結(jié)晶紫溶于10% (v/v)甲醛)，2小時后用流水沖去結(jié)晶紫和瓊脂糖，在顯微鏡下對每孔產(chǎn)生的細胞噬斑，根據(jù)噬斑數(shù)和稀釋倍數(shù)計算病毒的滴度(PFU/ml， PFU: plaque formation unit噬斑形成單位)。PFU-病毒稀釋度xP/V， (P:空蝕斑數(shù)目；V:接種量)。
3. 實驗結(jié)果見圖2。
權(quán)利要求
1、一種巴馬丁在制備治療或預(yù)防黃熱病毒感染藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種巴馬丁在制備治療或預(yù)防黃熱病毒感染藥物中的應(yīng)用，巴馬丁在100μM濃度下對黃熱病毒(yellow fever virus，YFV)抑制率為96.58％，而巴馬丁在濃度為100μM條件下，Vero細胞的存活率為92.93％。巴馬丁能夠有效地抑制黃熱病毒的增殖，但是對細胞毒性很小，可進一步開發(fā)為治療這些病毒感染引起的疾病的藥物，具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號A61P31/12GK101596193SQ20091006316
公開日2009年12月9日 申請日期2009年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月14日
發(fā)明者晶 李, 石沛勇, 蔡全信, 袁志明, 凡 賈, 罡 鄒, 鄭大勝, 閆建平 申請人:中國科學(xué)院武漢病毒研究所