專利名稱：葉酸-IgG偶聯(lián)物及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及葉酸-IgG偶聯(lián)物及其制備方法以及它的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
葉酸是1941年由米切爾(H. K. Mitchell)從菠菜中提取純化的，由喋啶，對(duì)氨基 苯甲酸和谷氨酸殘基組成的一種水溶性B族維生素，是人體必需的一種物質(zhì)，具有促進(jìn)骨 髓中幼細(xì)胞成熟的作用，如果缺少葉酸可導(dǎo)致紅血球的異常未成熟細(xì)胞的增加及白血球減 少。最新的研究表明葉酸可能會(huì)引發(fā)癌細(xì)胞的凋亡，對(duì)癌細(xì)胞的基因表達(dá)有一定影響，具有 一定的抗癌作用。其最重要的原因在于葉酸在體內(nèi)能與葉酸受體結(jié)合，葉酸受體(FR)分為 α和β亞型，研究表明在90%的卵巢癌、晚期乳腺癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)腸癌、肺癌、 脈絡(luò)膜癌、室管膜細(xì)胞瘤中出現(xiàn)高表達(dá)的FR-α ；在惡性增殖的白細(xì)胞(白血病)表面及類 風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病患者體內(nèi)激活的巨噬細(xì)胞表面有高表達(dá)的FR-β，而葉酸受 體在正常組織中幾乎不表達(dá)。因此葉酸和葉酸受體在靶向治療技術(shù)中具有很好的研究前
旦
ο一、癌癥治療的現(xiàn)有技術(shù)國(guó)際衛(wèi)生組織(WHO)指出在2010年癌癥將超過(guò)心臟病成為世界第一大殺手，與 1990年相比，全球癌癥患者的發(fā)病率增長(zhǎng)了 19%，死亡率增長(zhǎng)了 18%，預(yù)計(jì)2020年全世界 癌癥發(fā)病率將增加50%，全球每年新增癌癥患者人數(shù)將達(dá)到1500萬(wàn)人。目前全世界發(fā)病 率最高的癌癥是肺癌，每年新增患者人數(shù)為120萬(wàn)；其次是乳腺癌，每年新增大約100萬(wàn)患 者；隨后依次是腸癌(94萬(wàn)人)、胃癌(87萬(wàn)人)、肝癌(56萬(wàn)人)、子宮頸癌(47萬(wàn)人)、食 道癌(41萬(wàn)人)等。此外，美國(guó)、意大利、澳大利亞、德國(guó)、荷蘭、加拿大和法國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家癌 癥發(fā)病率較高，北非、南亞及東亞一些發(fā)展中國(guó)家的發(fā)病率則較低，而發(fā)病率也呈逐年上升 的趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅到了人類的正常生活。現(xiàn)在治療癌癥的代表性方法有(1)外科療法是在癌癥尚未轉(zhuǎn)移前將病灶切除的方法，外科療法是現(xiàn)今治療惡 性腫瘤最重要的手段，對(duì)早、中期惡性腫瘤應(yīng)列為首選方法，而對(duì)擴(kuò)散性癌癥卻很難治療。(2)放射線療法利用射線對(duì)癌細(xì)胞誘發(fā)產(chǎn)生DNA損傷及染色體畸變或斷裂，引起 細(xì)胞或其子代失去活力達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。但射線對(duì)正常組織細(xì)胞也有損害作用， 尤其光輻射量增大時(shí)容易損傷造血器官和血管組織，引起白細(xì)胞和血小板減少、皮膚粘膜 改變，胃腸道反應(yīng)等；而且放射性療法對(duì)復(fù)發(fā)性癌癥和對(duì)射線不敏感的癌癥治療效果不佳。(3)化學(xué)療法主要適用于中、晚期癌癥的綜合治療。按其作用機(jī)理分為五類① 影響核酸合成，如氟尿嘧啶、甲氨喋呤、阿糖胞苷、巰基嘌呤、羥基脲等；②影響蛋白合成，如 長(zhǎng)春新堿、門冬酰胺酶等；③直接破壞DNA，如氮芥、噻替哌、環(huán)磷酰胺、白消安、絲裂霉素、 博菜霉素、丙正胺等；④嵌入DNA中干擾模板作用，如阿霉素、柔紅霉素、光輝霉素、丙脒腙 等；⑤影響體內(nèi)激素平衡，如性激素、腎上腺皮質(zhì)激素等。此種療法的副作用包括骨髓抑制、 胃腸道反應(yīng)、脫發(fā)和化學(xué)性靜脈炎等。
(4)免疫療法通過(guò)機(jī)體內(nèi)部防御系統(tǒng)，經(jīng)調(diào)節(jié)功能達(dá)到遏制腫瘤生長(zhǎng)的目的。這 類藥物通常價(jià)格昂貴且伴有過(guò)敏反應(yīng)、胃腸道反應(yīng)、水腫等副作用。以上治療方法常常聯(lián)合應(yīng)用對(duì)抗癌癥，其中化療藥物不可避免的副作用使得新的 化療藥物的開(kāi)發(fā)顯得尤為必要。近來(lái)，基于單克隆抗體的靶標(biāo)治療藥物受到腫瘤患者的青 睞，如Here印tin 、Avastin 和Rituxan ，與常規(guī)化療藥物相比，其最大的優(yōu)勢(shì)在于低毒， 據(jù)統(tǒng)計(jì)，其市場(chǎng)已達(dá)到4百萬(wàn)美元/年。但此類藥物開(kāi)發(fā)至臨床投入巨大且市場(chǎng)價(jià)格昂貴， 另外，可用于治療癌癥范圍相對(duì)窄。二、自身免疫性疾病治療的現(xiàn)有技術(shù)自身免疫性疾病(Autoimmune disease)是指對(duì)正常機(jī)體組成成分的抗體或有免 疫功能的細(xì)胞，致使機(jī)體發(fā)生器質(zhì)性或功能性的障礙而引起的疾病。同時(shí)，從臨床來(lái)看，自 身免疫性疾病可能出現(xiàn)以下特征(1)血漿Y-球蛋白在1. 5%以上。(2)檢出病變臟器的自身抗體。(3)見(jiàn)到變性的Y-球蛋白或其相應(yīng)的抗原等沉積在腎小球等部位。(4)在病變組織見(jiàn)有大量淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn)。(5)應(yīng)用腎上腺皮質(zhì)激索能夠得到一度或持續(xù)的良好效果。(6)見(jiàn)到一種以上的自身免疫性損害和癥狀。(7)檢出能在常溫下對(duì)病變臟器發(fā)生反應(yīng)的自身抗體。(8)檢出的抗體能特異性的作用于相應(yīng)的自身抗原。(9)用同樣的抗原在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中能產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。(10)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的病變與臨床病例相類似。(11)通過(guò)含抗體的血清，或用免疫學(xué)的方法所激活的淋巴活性細(xì)胞，可引起類似 的疾病。以上標(biāo)準(zhǔn)，提示了自身抗體對(duì)病變部位的侵襲，僅僅是臨床標(biāo)準(zhǔn)，沒(méi)有涉及其病因 的作用。自身免疫性疾病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、銀屑病等(1)炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease, IBD)主要包括潰瘍性結(jié)腸炎 (ulcerative colitis, UC)和克隆氏病(Crohn，s disease，CD)兩種。第十屆歐洲胃腸病 學(xué)年會(huì)上，歐洲克隆氏病與炎性腸病聯(lián)合會(huì)主席RodMitchell指出，目前在歐洲有100萬(wàn) IBD患者，在西方國(guó)家大部分地區(qū)潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病率穩(wěn)定，最高到10例/10萬(wàn)人口。而克 隆氏病的發(fā)病率在過(guò)去30年升高了 600%，我國(guó)發(fā)病率也呈明顯的上升趨勢(shì)，此病癥可導(dǎo) 致患者發(fā)生結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著升高，嚴(yán)重威脅人類的健康。盡管研究多年，人類目前仍然 無(wú)法完全治愈該病。(2)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis, RA)是一種以慢性進(jìn)行性關(guān)節(jié)滑膜 病變?yōu)樘卣鞯娜硇宰陨砻庖咝约膊?。主要表現(xiàn)為進(jìn)行性侵蝕性關(guān)節(jié)炎及晨僵，部分患者 可以出現(xiàn)發(fā)熱、貧血、皮下結(jié)節(jié)和淋巴結(jié)腫大，如不給予及時(shí)治療，最終會(huì)導(dǎo)致受累關(guān)節(jié)強(qiáng) 直、畸形和功能喪失，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎在全世界成人中的發(fā)病率約占 1 % 2 %，并隨著年齡的增長(zhǎng)而增高，35歲以下成人的發(fā)病率約0. 3 %，而65歲以上者發(fā)病 率超過(guò)10%。我國(guó)按照美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)人群普查，調(diào)查結(jié)果顯示，成人患病率為0. 32% 0. 4%，按此數(shù)字估計(jì)，我國(guó)有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者約400萬(wàn)左右。(3)紅斑狼瘡(lupus erythematosus, LE)是一種自身免疫性疾病，發(fā)病緩慢，隱 襲發(fā)生，臨床表現(xiàn)多樣、變化多端，分為盤狀紅斑狼瘡(DLE)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、亞急 性皮膚型紅斑狼瘡、深部紅斑狼瘡等類型。此病能累及身體多系統(tǒng)、多器官，在患者血液和 器官中能找到多種自身抗體。(4)銀屑病是一種有特征鱗屑性紅斑的復(fù)發(fā)性、慢性皮膚病，可能與遺傳、感染、代 謝障礙、內(nèi)分泌影響、神經(jīng)精神因素和免疫異常等有關(guān)。臨床表現(xiàn)以皮膚上出現(xiàn)丘疹及斑 塊，上覆以銀白色鱗屑為主。因其皮損厚硬，狀如牛皮，所以又有“牛皮癬”的俗稱；因其鱗 屑層層脫落，就象粗的松樹(shù)皮，故中醫(yī)學(xué)稱之為“松皮癬”。銀屑病在臨床上有四種類型尋 常型、膿皰型、關(guān)節(jié)病型和紅皮病型，本病在自然人群中的發(fā)病率為0. 1% -3%，根據(jù)全國(guó) 銀屑病流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)銀屑病平均患病率為0. 167%。其病因和發(fā)病機(jī)理至今仍不 完全清楚，其治療目前大多只能達(dá)到近期效果，具有一定的不良反應(yīng)。治療自身免疫性疾病的常用藥物包括(1)非留體類抗炎藥(NSAIDS):如水楊酸制劑、吲哚美辛、丙酸衍生物、滅酸類藥 物等，用于初發(fā)或輕癥病例，其作用機(jī)理主要抑制環(huán)氧化酶使前腺素生成受抑制而起作用， 以達(dá)到消炎止痛的效果，但不能阻止類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病變的自然過(guò)程。本類藥物因體內(nèi)代 謝途徑不同，彼此間可發(fā)生相互作用不主張聯(lián)合應(yīng)用。(2)金制劑常用硫代蘋果酸金鈉，金制劑用藥愈早，效果愈著。金制劑的作用慢， 3 6個(gè)月始見(jiàn)效，不宜與免疫抑制劑或細(xì)胞毒藥物并用?？诜鹬苿┬Чc金注射劑相 似。副作用有大便次數(shù)增多，皮疹，口腔炎等，但停藥后有復(fù)發(fā)可能。(3)青霉胺能選擇性抑制某些免疫細(xì)胞使IgG及IgM減少。副作用有血小板減 少，白細(xì)胞減少，蛋白尿，過(guò)敏性皮疹，食欲不振，視神經(jīng)炎，肌無(wú)力，轉(zhuǎn)氨酶增高等。(4)氯 喹可作為水楊酸制劑或遞減皮質(zhì)類固醇劑量時(shí)的輔助藥物。療程中常有較多胃腸道反應(yīng) 如惡心、嘔吐和食欲減退等。長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)發(fā)生視網(wǎng)膜的退行性變和視神經(jīng)萎縮等。(5)左旋咪唑可減輕疼痛、縮短關(guān)節(jié)僵硬的時(shí)間。副作用有眩暈、惡心、過(guò)敏性皮 疹、視力減退、嗜睡、粒細(xì)胞減少、血小板減少、肝功能損害、蛋白尿等。(6)免疫抑制劑適用在其它藥物無(wú)效的嚴(yán)重類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者，副作用有骨 髓抑制、白細(xì)胞及血小板下降，肝臟毒性損害及消化道反應(yīng)、脫發(fā)、閉經(jīng)、出血性拼膀光炎寸。(7)腎上腺皮質(zhì)激素腎上腺皮質(zhì)激素對(duì)關(guān)節(jié)腫痛，控制炎癥，消炎止痛作用迅 速，但效果不持久，對(duì)病因和發(fā)病機(jī)理毫無(wú)影響。一旦停藥短期可即復(fù)發(fā)。對(duì)RF、血沉和貧 血也無(wú)改善，長(zhǎng)期應(yīng)用將導(dǎo)致嚴(yán)重副作用。這兩種疾病都有治療困難，治療副作用大的問(wèn)題，需要更有針對(duì)性的靶向治療技 術(shù)來(lái)治療這些疾病。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用葉酸受體在癌細(xì)胞和自身免疫性疾病患者體內(nèi)激活的巨噬細(xì)胞表面 中的特異性表達(dá)特性，將葉酸與抗體免疫球蛋白IgG偶聯(lián)，提供一種葉酸-IgG偶聯(lián)物及其 制備方法與在制備抗癌藥物和治療自身免疫性疾病藥物中的應(yīng)用。
因此本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種葉酸-IgG偶聯(lián)物，由葉酸與IgG構(gòu)成，葉酸的 分子式為=C19H19N7O60 IgG為人源IgG或重組IgG或IgG的Fc段。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種葉酸-IgG偶聯(lián)物的制備方法，將0. 1 30mol葉 酸(F)與0. 1 40mol 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、0. 1 30mol羥基琥珀酰亞胺酯(NHS)在 室溫下于DMSO中反應(yīng)2 5小時(shí)，離心取沉淀，與0. 01 2. O倍量人源IgG或重組IgG或 IgG的Fc段室溫反應(yīng)2 5小時(shí)后，將反應(yīng)物過(guò)分子篩，收集產(chǎn)物即為葉酸-IgG偶聯(lián)物。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供葉酸-IgG偶聯(lián)物在制備治療癌癥藥物中的應(yīng)用。所述的癌癥包括白血病、卵巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、肝 癌、脈絡(luò)膜癌、室管膜細(xì)胞瘤。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供葉酸-IgG偶聯(lián)物在制備治療自身免疫性疾病藥物中 的應(yīng)用。所述的自身免疫性疾病是指機(jī)體對(duì)自身抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而導(dǎo)致自身組織損傷 引起的疾病，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、銀屑病、紅斑狼瘡、肺纖維化、肉樣瘤病 (或結(jié)節(jié)病、Boeck肉樣瘤、Schaumann良性淋巴肉芽腫病、Besnier凍瘡樣狼瘡)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果本發(fā)明的葉酸-IgG偶聯(lián)物不會(huì)結(jié)合到正常細(xì)胞上，對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有影響，解決了 現(xiàn)有技術(shù)中癌癥治療和自身免疫性疾病藥物對(duì)正常細(xì)胞的損害問(wèn)題。同時(shí)葉酸-IgG偶聯(lián) 物無(wú)外源性蛋白質(zhì)序列，不會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)的異源抗體中和反應(yīng)。葉酸-IgG偶聯(lián)物為小分子物 質(zhì)，具有到達(dá)靶點(diǎn)時(shí)間短、血液清除速度快、穿透能力強(qiáng)的特點(diǎn)，能減少對(duì)身體的毒副作用。在制備抗癌癥藥物的應(yīng)用中，葉酸-IgG偶聯(lián)物能特異性的與癌細(xì)胞上高表達(dá)的 葉酸受體結(jié)合，然后通過(guò)IgG激活效應(yīng)細(xì)胞的抗體或補(bǔ)體系統(tǒng)，并增強(qiáng)生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑，如 白細(xì)胞介素-2(IL-2)等作用，產(chǎn)生細(xì)胞毒作用殺滅腫瘤細(xì)胞。由于是特異性結(jié)合，對(duì)正常 細(xì)胞沒(méi)有影響。本發(fā)明的葉酸-IgG偶聯(lián)物在制備治療自身免疫性疾病藥物的應(yīng)用還具備以下優(yōu)占.
^ \\\ ·自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制很復(fù)雜，其病理過(guò)程涉及大量免疫細(xì)胞的激活及細(xì)胞 因子的釋放，其中巨噬細(xì)胞的激活和大量炎性因子的釋放在疾病的發(fā)生、發(fā)展中有著關(guān)鍵 性的作用。如前所述，葉酸-IgG偶聯(lián)物特異性結(jié)合于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病患者 體內(nèi)激活的巨噬細(xì)胞表面，并通過(guò)以下途徑抑制巨噬細(xì)胞的吞噬功能或相關(guān)炎性因子的釋 放，從而緩解此類疾病的癥狀。(1)抑制炎癥性細(xì)胞因子的產(chǎn)生葉酸-IgG偶聯(lián)物中IgG分子Fc段競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合 巨噬細(xì)胞表面IgG Fc受體，使巨噬細(xì)胞不能通過(guò)Fc受體結(jié)合自身抗原-自身抗體Fc段， 吞噬功能明顯受抑，炎癥性因子亦隨之分泌減少。(2)抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)正常情況下巨噬細(xì)胞吞噬抗原，并將抗原信息經(jīng)抗原提 呈細(xì)胞(MHC)提呈給T淋巴細(xì)胞。T淋巴細(xì)胞在接受抗原信息和IL-I的刺激下，開(kāi)始活 化、增殖和分化；TH2細(xì)胞分泌IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 ；THl細(xì)胞分泌IL-2、干擾素 (IFN)，IL-12 ；細(xì)胞毒性T細(xì)胞(TC)發(fā)揮直接殺傷效應(yīng)。葉酸-IgG偶聯(lián)物提供大量IgG Fc 段占據(jù)巨噬細(xì)胞表面Fc受體，不能將抗原信息和IL-I提供給T淋巴細(xì)胞，致使其生物學(xué)功 能不能表達(dá)。
(3)減少自身組織破壞一些自身組織和細(xì)胞的破壞也是通過(guò)巨噬細(xì)胞吞噬作用 來(lái)實(shí)現(xiàn)(如血小板、紅血球)。葉酸-IgG偶聯(lián)物中的Fc段封閉巨噬細(xì)胞Fc受體后，可保全 已與自身抗體(如抗血小板抗體)結(jié)合的自身組織不被吞噬。


圖1是葉酸-IgG偶聯(lián)物的作用機(jī)制示意圖
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1葉酸-IgG偶聯(lián)物，由葉酸與人源IgG偶聯(lián)構(gòu)成。葉酸的分子式為C19H19N706。其 制備方法如下將0. 1葉酸(F)與0. 1 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、0. 1羥基琥珀酰亞胺酯(NHS)在 室溫下于DMSO中反應(yīng)2小時(shí)，離心取沉淀，與0. 01倍量的人源IgG室溫反應(yīng)2小時(shí)后，將 反應(yīng)物過(guò)PD-10分子篩，收集產(chǎn)物即為葉酸-IgG偶聯(lián)物。實(shí)施例2葉酸-IgG偶聯(lián)物，由葉酸與重組IgG偶聯(lián)構(gòu)成。葉酸的分子式為C19H19N706。其 制備方法如下將30mol葉酸與40mol 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、30mol羥基琥珀酰亞胺酯(NHS) 在室溫下于DMSO中反應(yīng)5小時(shí)，離心取沉淀，與2. 0倍量的重組IgG室溫反應(yīng)5小時(shí)后，將 反應(yīng)物過(guò)PD-10分子篩，收集產(chǎn)物即為葉酸-IgG偶聯(lián)物。實(shí)施例3葉酸-IgG偶聯(lián)物，由葉酸與重組IgG的Fc段偶聯(lián)構(gòu)成。葉酸的分子式為 C19H19N706。其制備方法如下將IOmol葉酸與20mol 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、IOmol羥基琥珀酰亞胺酯(NHS) 在室溫下于DMSO中反應(yīng)3小時(shí)，離心取沉淀，與1. 0倍量的重組IgG的Fc段室溫反應(yīng)4小 時(shí)后，將反應(yīng)物過(guò)PD-10分子篩，收集產(chǎn)物即為葉酸-IgG偶聯(lián)物。實(shí)施例4葉酸-IgG偶聯(lián)物(FIG)作為抗乳腺癌藥物的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)材料藥品及試劑葉酸-IgG偶聯(lián)物(FIG)，按實(shí)施例2的方式制備；胎牛血清、MEM培養(yǎng) 基由Hyclone公司提供。乳腺癌細(xì)胞MCF-7由武漢大學(xué)菌種典藏中心提供。動(dòng)物健康成熟雌性DBA/2小鼠50只，體重18 22g，由南京大學(xué)模式動(dòng)物提供，生 產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(蘇)2005-0002。小鼠飼料，購(gòu)于武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。儀器TG328A型分析天平，紫外分光光度計(jì)，高速勻漿器等。實(shí)驗(yàn)方法動(dòng)物分組與處理將上述小鼠按體重隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、表阿霉素陽(yáng) 性對(duì)照組、FIG lmg/kg組和FIG 100mg/kg組，試驗(yàn)開(kāi)始前7天給予不含葉酸的鼠料。表 阿霉素陽(yáng)性對(duì)照組、模型組、FIG lmg/kg組和FIG 100mg/kg組于試驗(yàn)第0天皮下注射 1 X 106MCF-7/只，第5天開(kāi)始給藥，F(xiàn)IG lmg/kg組及FIG 100mg/kg組分別腹腔注射FIGlmg/kgU00mg/kg,四日一次；表阿霉素陽(yáng)性對(duì)照組小鼠腹腔注射表阿霉素200mg/kg，四日 一次；正常對(duì)照組和模型組小鼠腹腔注射等量的生理鹽水，四日一次。小鼠于給藥后第15 日禁食，次日給藥后，以游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤體積，并計(jì)算第16天每組小鼠的平均存活時(shí)間。檢測(cè)指標(biāo)腫瘤體積(Volume):以游標(biāo)卡尺測(cè)量實(shí)體瘤的長(zhǎng)(L)、寬(W)和高(H)，按如下公 式計(jì)算V = 0. 5XLXWXH。平均存活時(shí)間(MST)求得每組小鼠的平均存活時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)FIG對(duì)MCF-7在DBA/2小鼠體內(nèi)增殖的抑制作用由表1可見(jiàn)，F(xiàn)IG lmg/kg、100mg/kg腹腔注射給藥均可抑制MCF-7在DBA/2小鼠 體內(nèi)的增殖。16天后，F(xiàn)IG lmg/kg、100mg/kg組實(shí)體瘤體積分別下降41. 5%、51.8%。表 明FIG腹腔給藥對(duì)MCF-7在DBA/2小鼠體內(nèi)的增殖有明顯的抑制作用。(2) FIG對(duì)DBA/2荷瘤小鼠平均存活時(shí)間的影響FIG lmg/kg、100mg/kg腹腔注射給藥均可提高荷瘤小鼠的平均存活時(shí)間，分別為 1. 00,2. 75倍，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1?？梢?jiàn)FIG能明顯延長(zhǎng)荷瘤小鼠的存活時(shí)間。表IFIG對(duì)DBAA荷瘤小鼠腫瘤體積及小鼠平均存活時(shí)間的影響(X±SD，n = 10)
權(quán)利要求
一種葉酸 IgG偶聯(lián)物，其特征在于由葉酸與IgG構(gòu)成，葉酸的分子式為C19H19N7O6；IgG為人源IgG或重組IgG或IgG的Fc段。
2.一種制備權(quán)利要求1所述的葉酸-IgG偶聯(lián)物的方法，其特征在于將0. 1 30mol葉 酸(F)與 0. 1 40mol 二環(huán)己基碳二亞胺(N，N，-dicyclohexylcarbodiimide，DCC)、0· 1 30mol羥基琥珀酰亞胺酯(N-hydroxysuccinimide，NHS)在室溫下于二甲基亞砜(DMSO)中 反應(yīng)2 5小時(shí)，離心取沉淀，與0. 01 2. 0倍量人源IgG或重組IgG或IgG的Fc段室溫 反應(yīng)2 5小時(shí)后，將反應(yīng)物過(guò)分子篩，收集產(chǎn)物即為葉酸-IgG偶聯(lián)物。
3.權(quán)利要求1所述的葉酸-IgG偶聯(lián)物在制備治療癌癥藥物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的葉酸-IgG偶聯(lián)物在制備治療癌癥藥物中的應(yīng)用，其特征在于 所述癌癥包括白血病、卵巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、肝癌、脈絡(luò)膜癌、 室管膜細(xì)胞瘤。
5.權(quán)利要求1所述的葉酸-IgG偶聯(lián)物在制備治療自身免疫性疾病藥物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的葉酸-IgG偶聯(lián)物在制備治療自身免疫性疾病藥物中的應(yīng)用， 其特征在于自身免疫性疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、銀屑病、紅斑狼瘡、肺纖維 化、肉樣瘤病。
全文摘要
本發(fā)明提供一種葉酸-IgG偶聯(lián)物及其制備方法與應(yīng)用，葉酸-IgG偶聯(lián)物由葉酸與人源IgG或重組IgG或IgG的Fc段構(gòu)成。葉酸-IgG偶聯(lián)物的制備方法為0.1-30mol葉酸與0.1-40mol二環(huán)己基碳二亞胺、0.1-30mol羥基琥珀酰亞胺酯在室溫下于DMSO中反應(yīng)，離心取沉淀，與0.01～2.0倍量人源IgG或重組IgG或IgG的Fc段室溫反應(yīng)2～5小時(shí)后，將反應(yīng)物過(guò)分子篩，收集產(chǎn)物即為葉酸-IgG偶聯(lián)物。葉酸-IgG偶聯(lián)物可以作為治療癌癥的藥物和治療自身免疫性疾病的藥物。葉酸-IgG偶聯(lián)物特異性地結(jié)合到癌癥細(xì)胞和自身免疫性疾病患者體內(nèi)激活的巨噬細(xì)胞上，而不會(huì)結(jié)合到正常細(xì)胞上，解決了現(xiàn)有技術(shù)中癌癥治療藥物和自身免疫性疾病藥物對(duì)正常細(xì)胞的損害問(wèn)題。
文檔編號(hào)A61P37/02GK101985471SQ20091006335
公開(kāi)日2011年3月16日 申請(qǐng)日期2009年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月29日
發(fā)明者丁虹, 劉穎 申請(qǐng)人:武漢華耀生物醫(yī)藥有限公司