專利名稱：松蘿酸在抗流感病毒藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及松蘿酸在抗流感病毒藥物中的應用，屬于醫(yī)藥技術領域。
背景技術：
流感病毒是引起流行性感冒的病原，分為甲(influenza A virus)、乙 (influenzaB virus)、丙(influenza C virus)三型，其中以甲型流感對人類威脅最大。人 流感病毒主要是Hl、 H2和H3亞型，而目前危害嚴重的高致病性禽流感病毒多為H5、 H7和 H9亞型，即H5N1 、 H7N7 、 H9N2等，其中以H5N1亞型病死率高。 流感病毒屬正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，具有包膜的8個片段，共編碼11種 蛋白質(zhì)的單鏈負RNA病毒。與其他RNA病毒不同的是，流感病毒所有RNA (mRNA、cRNA、 vRNA) 的合成均在被感染細胞的核內(nèi)完成。mRNA在核內(nèi)合成后轉移到胞漿，合成病毒的結構和非 結構蛋白；而后開始裝配流感病毒，完成后以出芽方式釋放出子代病毒顆粒，進一步侵入新 的宿主細胞。 在流感病毒的各個基因中，NP基因最為保守。NP具有型特異性，還是一種多功能 蛋白質(zhì)，除了形成病毒的核衣殼外，還可通過RNP來穩(wěn)定vRNA，使之免受RNA酶作用。多年 來研究認為，PB1是病毒RNA聚合酶的催化亞基，負責病毒RNA的復制以及轉錄；PB2是負責 以一種稱為"Snatch"的方式奪取宿主mRNA的CAP帽子結構用于病毒mRNA轉錄。流感病 毒能否在人體細胞內(nèi)進行有效的復制，主要與病毒復制酶(PB1、PB2和PA)基因有關。
目前，流感仍屬未能有效控制的急性上呼吸道傳染病。由于流感病毒的抗原變 異能力強，加之個體免疫力的不同，疫苗的保護率并不高，且疫苗只對已知的流感病毒亞 型有預防作用，而對于由抗原性漂移或抗原性轉換所產(chǎn)生的新型流感病毒無效。當前美 國食品和藥物管理局(FDA)批準用于防治流感的藥物有金剛烷胺(Amantadine)、金剛乙 胺(Rimantadine)和扎那米韋(Zanamivir)，但分別存在易引起流感病毒耐藥株的出現(xiàn)和 服用不方便的問題。中醫(yī)藥治療藥物包括清開靈口服液、雙黃連注射液、藿香正氣丸、參脈 注射液等清熱解毒、增強人體免疫力的中成藥，這些藥物具有綜合療效好、毒副作用低等優(yōu) 勢。因此，抗流感病毒藥物的研究方興未艾。中草藥是天然寶庫，以其內(nèi)在科學性和實踐的 有效性，正日益受到世界各國醫(yī)藥學工作者的關注。中藥不僅具有耐藥性低、副作用和不良 反應少等優(yōu)點，而且還有抑制病毒復制、調(diào)節(jié)免疫功能、改善血液循環(huán)、解熱鎮(zhèn)痛、及抗菌消 炎等綜合功效，其在防治流感病毒方面具有獨特的優(yōu)勢和廣闊的發(fā)展前景。因此，近年來， 國內(nèi)外均開展了抗流感病毒中草藥的研究，取得了較好的結果。 但是目前文獻報道中還沒有出現(xiàn)松蘿酸(usnic acid，UA)在抗流感病毒方面的應 用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于彌補現(xiàn)有技術的不足，提供松蘿酸在抗流感病毒藥物中的應 用，從而為臨床上流感病毒性疾病的治療提供一種安全有效毒副作用小的天然藥物。
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為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是松蘿酸在抗流感病毒藥物中的應用。
所述松蘿酸的給藥劑量按照細胞實驗用量為0. 16 500 ii g/ml。
所述松蘿酸制成抗流感病毒復方藥物。
所述松蘿酸單獨制成抗流感病毒藥物。
所述流感病毒為甲型流感病毒。 本發(fā)明通過血凝效價試驗(HA)與實時熒光定量PCR(Real-Time PCR)試驗，對 前期篩選的有效藥物的給藥劑量及有效性做出分析，同時采用體外細胞模型——狗腎細胞 (Madin-Darby canine kidney,MDCK cell)，從直接殺病毒、抑制病毒的吸附與入侵、抑制病 毒的復制、影響病毒出膜等方面研究了藥物的抗病毒機制。研究結果顯示松蘿酸在細胞和 分子水平上對流感病毒具有較好的抑制作用，表明該藥物具有開發(fā)成抗流感病毒的有效藥 物而應用于臨床，并且可以作為臨床上潛在的抗病毒藥物進一步開發(fā)的廣闊前景。
由于松蘿酸具有一定的抗感染和炎癥作用，同時具有一定的抗真菌作用，而病毒 所引起的傳染性疾病發(fā)生過程中常伴隨有炎癥反應，故該藥物在治療病毒性疾病的同時對 病毒所引起的炎癥等癥狀均有較好的緩解和輔助治療作用。在治療流感病毒感染及其并發(fā) 癥的藥物中可加入該藥成分或在治療過程中聯(lián)合用藥使用該藥。結合現(xiàn)代常用藥物制劑手 段，可將松蘿酸制成薄膜包衣片、膠囊劑、顆粒劑、分散劑，從而采用比較方便的口服給藥形 式。 綜上所述，本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有以下優(yōu)點和效果 1、松蘿酸是一種純天然藥物，在0. 16 500ii g/ml濃度范圍內(nèi)沒有細胞毒性。
2、能夠抑制病毒感染所導致的炎癥反應，松蘿酸在使用36小時后使細胞上清中 的PGE2含量明顯降低。 3 、在體外對H5N1 、H3N2等甲型流感病毒感染的MDCK細胞和A549細胞均具有一定
的抗流感病毒作用。 4 、可口服給藥，使用方便。 5、松蘿酸為非核苷類化合物，兼有抗炎作用，故能提高治療過程中的耐受性，提高 治療質(zhì)量和給藥依從性，減輕治療痛苦。


圖1為本發(fā)明實施例對松蘿酸進行藥物篩選的流程圖； 圖2為實施例1不同濃度藥物加入到MDCK細胞中培養(yǎng)48h后，采用四甲基偶氮唑 鹽(MTT)法觀察藥物對細胞生長的影響結果圖(第一組是將不同濃度的松蘿酸加入到MDCK 細胞，第二組是將不同濃度的金剛烷胺加入到MDCK細胞，第三組沒有加入藥物)；
圖3為實施例1將不同濃度藥物加入到病毒感染MDCK細胞之后培養(yǎng)48h時，采用 MTT法測定光密度結果圖(第一組是將不同濃度的松蘿酸加入到病毒感染細胞培養(yǎng)48h，第 二組是將不同濃度的金剛烷胺加入到病毒感染細胞培養(yǎng)48h，分別以20ii g/ml病毒感染細 胞懸液和生理鹽水為對照)； 圖4為實施例1采用血凝效價試驗測定不同濃度藥物處理病毒感染細胞36h后的 上清液中的病毒滴度結果圖(第一組是用不同濃度松蘿酸處理病毒感染細胞36h，第二組 是用不同濃度金剛烷胺處理病毒感染細胞36h，第三組為模型組)；
圖5為實施例1將不同的藥物加入到感染病毒的MDCK細胞中，通過HA試驗來檢 測不同時間點細胞上清中的病毒滴度結果圖(第一組加入的藥物為lOOyg/ml的松蘿酸， 第二組加入的藥物為lOOyg/ml的金剛烷胺，第三組為模型組)； 圖6為實施例1采用噬斑法(plaque reduce assay)的方法檢測松蘿酸對流感病 毒的抑制作用結果圖(其中A為100i!g/ml松蘿酸加入到病毒感染細胞后的染色結果，B 為lOOii g/ml金剛烷胺加入到病毒感染細胞后的染色結果，C為未加入藥物的病毒感染細 胞的染色結果，D為正常細胞的染色結果；藍染色表明細胞沒有受到病毒影響，未染色而出 現(xiàn)空斑的結果表明細胞受到流感病毒的侵蝕)； 圖7為實施例1加入不同藥物的感染H5N1的MDCK細胞進行免疫熒光試驗結果 圖； 圖8-1為實施例1采用實時(real-time)PCR檢測藥物對流感病毒復制過程病毒 NP特異性片段mRNA載量的影響結果圖(*p < 0. 05 ;**p < 0. 01); 圖8-2為實施例1采用實時(real-time) PCR檢測藥物對流感病毒復制過程病毒 NP特異性片段cRNA載量的影響結果圖(*p < 0. 05 ;**p < 0. 01); 圖8-3為實施例1采用實時(real-time) PCR檢測藥物對流感病毒復制過程病毒 NP特異性片段vRNA載量的影響結果圖(*p < 0. 05 ;**p < 0. 01); 圖9-l為實施例2不同給藥方式時藥物對流感病毒的抑制作用結果圖(在藥物作 用24小時收集細胞上清液，采用HA檢測病毒滴度，數(shù)據(jù)為平均值±標準差(每個濃度3 個平行)，第一組藥物為松蘿酸，第二組藥物為金剛烷胺，與模型組比較^P < 0. 05，病毒滴 度的差異超過2倍可視為有顯著性差異)； 圖9-2為實施例2不同給藥方式時藥物對流感病毒的抑制作用結果圖(在藥物作 用36小時收集細胞上清液，采用HA檢測病毒滴度，數(shù)據(jù)為平均值±標準差(每個濃度3 個平行)，與模型組比較，*P < 0. 05，病毒滴度的差異超過2倍可視為有顯著性差異)；
圖9-3為實施例2不同給藥方式時藥物對流感病毒的抑制作用結果圖(在藥物作 用48小時后收集細胞上清液，采用HA檢測病毒滴度，數(shù)據(jù)為平均值±標準差(每個濃度 3個平行)，與模型組比較，*p < 0. 05，病毒滴度的差異超過2倍可視為有顯著性差異)；
圖10-1為實施例3檢測NP和藥物之間相互作用的熒光素酶活性結果圖。在HeLa 細胞中，分別轉染報告質(zhì)粒pG5Luc和測試質(zhì)粒pvP16核蛋白(NP)攜帶NP基因，然后在6h 后分別添加藥物，質(zhì)粒pVP16(VP16)為陰性對照和本底控制對照，數(shù)據(jù)為平均值±標準差 (3個平行樣)；與陽性對照比較，*p < 0. 05或**p < 0. 01表示有顯著性差異；
圖10-2為實施例3檢測松蘿酸是否抑制NP與NP之間相互作用的熒光素酶活性 結果圖。在HeLa細胞中，分別轉染報告質(zhì)粒pG5Luc和測試質(zhì)粒pvP16核蛋白(NP)攜帶NP 基因，然后在6h后分別添加藥物，未轉染質(zhì)粒和給藥為陰性對照，轉染質(zhì)粒但是沒有給藥 組為陽性對照，數(shù)據(jù)為平均值±標準差(3個平行樣)；與陽性對照比較^p < 0. 05或**p <0.01表示有顯著性差異； 圖10-3為實施例3檢測松蘿酸是否抑制NP、PB1蛋白間相互作用的熒光素酶活性 結果圖。在HeLa細胞中，分別轉染報告質(zhì)粒pG5Luc和測試質(zhì)粒pvP16核蛋白(NP)攜帶NP 基因、M-PB1基因，然后在6h后分別添加藥物；未轉染質(zhì)粒和給藥組為陰性對照，轉染質(zhì)粒 但是沒有給藥組為陽性對照，數(shù)據(jù)為平均值±標準差(3個平行樣)；與陽性對照比較，*p< 0. 05或**p < 0. 01表示有顯著性差異； 圖10-4為實施例3檢測松蘿酸是否抑制NP、PB2蛋白間相互作用的熒光素酶活性 結果圖。在HeLa細胞中，分別轉染報告質(zhì)粒pG5Luc和測試質(zhì)粒pvP16核蛋白(NP)攜帶NP 基因、M-PB2基因，然后在6h后分別添加藥物；未轉染質(zhì)粒和給藥組為陰性對照，轉染質(zhì)粒 但是沒有給藥組為陽性對照，數(shù)據(jù)為平均值±標準差(3個平行樣)；與陽性對照比較，*p
< 0. 05或**p < 0. 01表示有顯著性差異； 圖11為實施例4采用PGE2檢測試劑盒測定細胞上清中的PGE2含量結果圖(與 測定空白對照比較，*P < 0. 05表示有顯著性差異)。
具體實施例方式
為了更好地理解本發(fā)明的內(nèi)容，下面結合具體實施例對本發(fā)明的內(nèi)容作進一步說 明，但本發(fā)明的保護內(nèi)容不局限于以下實施例。 目前常采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法，檢測藥物對流感病毒感染后MDCK細胞存活 率的差異性進行藥物篩選。另外也有一些針對流感病毒復制的關鍵酶進行的藥物體外篩 選，但是相比而言，采用細胞培養(yǎng)篩選的方法會更簡單，并可以系統(tǒng)探討藥物的有效濃度和 治療指數(shù)，為后期機理研究提供更多基礎。本發(fā)明采用細胞培養(yǎng)篩選法檢測松蘿酸對流感 病毒感染后MDCK細胞或A549細胞存活率的差異性，從而進行藥物篩選，其流程圖見圖1。
以下實施例中的百分比濃度均為質(zhì)量百分比濃度(含有氣體部分為體積百分比， 如5% C02)。
實施例1 :松蘿酸抗流感病毒活性的評價 I.試驗材料 1.細胞、病毒和質(zhì)粒 MDCK細胞由中國科學院山東醫(yī)學微生物研究所提供，A549細胞、HeLa細胞、病 毒H5N1或H3N2購于中國典型微生物保藏中心；pM-scFv、 pVP-16-NP、 pM-PBl、 pM-PB2、 pVP-16-NP、 pG5Luc質(zhì)粒由武漢大學病毒學國家重點實驗室醫(yī)學病毒學研究課題組吳 建國教授指導完成，相關詳細信息可見本實驗室已經(jīng)發(fā)表的論文——Mukhtar， M.M.， Li， S. ， Li， W. ， Wan， T. ， Mu， Y. ， Wei， W. ， Kang， L. ， Rasool， S. T. ， Xiao， Y. ， Zhu， Y. ， and Wu， J. (2009). Single-chain intracellular antibodiesinhibit influenza virus replication by disrupting interaction of proteins involved in viralr印lication and transcription. Int J Biochem Cell Biol 41(3)，554-60.
2.工具酶 LA-taq， LC-taq， M-MLV Reverse Transcriptase, M-MLV RT 5X Buffer, RNAexhibit購自寶生物(TaKara)公司；
3.其他材料 DMEM粉劑購自Gibco公司；SofastTM轉染試劑，購自上海太陽馬公司；TRIzol試劑 購自Gibco公司；松蘿酸(UA)由武漢健民藥業(yè)集團中藥現(xiàn)代化工程研究中心提供，HPLC檢 測純度為98%以上；PGE2檢測試劑盒購自BiotrakProstaglandin E2 Enzyme Immunoassay system, R&D Systems。
II.試驗器材
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Turner BioSystems TD-20/20熒光光度計(Turner Designs, Sunnyvale, CA)。 [OO52]( — )藥物細胞毒性檢測試驗 1、消化T25瓶中MDCK細胞，加適量細胞培養(yǎng)基，吹打細胞10-15次。
2、將細胞鋪到96孔板中，放置于培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h待用。 3、將培養(yǎng)的MDCK細胞取出，倒去原有培養(yǎng)液，換用2X胎牛血清(FBS)的維持培養(yǎng) 基稀釋的梯度藥物，培養(yǎng)24h待用。 4、然后加入不同濃度的藥物，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，棄培養(yǎng)液上清，于培養(yǎng)板加入5mg/ mL MTT液50 y L/孔(以不含血清的DMEM培養(yǎng)基配制成)，置C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
5、培養(yǎng)2-3h后，棄MTT上清，PBS緩沖液洗3次，每孔加溶解液(溶解液由匿S0 : 乙醇按1 : 1的體積比配制成)100 ii L，振蕩5-10分鐘。 6、待結晶完全溶解，置酶標測定儀上，測定570nm(或490nm)波長處的光密度0D 值，結果如表1所示。通過OD值變化比較細胞存活率情況，OD值越大，表明細胞存活越多， 見圖2。 7、找出藥物對細胞的最大無毒濃度范圍。
表1松蘿酸對MDCK細胞毒性試驗結果
濃度 OD570 (mean士SD) -
500嗎/ml 0.908±0.0145
100jLig/ml 0.883±0.037
20嗎/ml 0.884±0.033
4pg/ml 0.718±0.066
0.8ng/ml 0.833±0.028
0.16叱/ml 0.799±0.039
normal 0.76233±0,063 結果顯示松蘿酸在O. 16ii g/ml 500 y g/ml范圍內(nèi)對MDCK細胞沒有明顯細胞毒 性，說明松蘿酸有比較安全的適用范圍，即松蘿酸的給藥劑量按照細胞實驗用量為0. 16 500 li g/ml。 ( 二 )松蘿酸抗H5N1病毒的篩選試驗
A、 HA檢測松蘿酸是否具有抗流感病毒作用 1、用胰酶將生長良好的MDCK細胞分散成單個細胞懸液，按1 X 105/mL濃度分加于 48孔板，每孔O. 2mL。 2、置37°。、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。將培養(yǎng)的MDCK細胞取出，倒去原有培養(yǎng)液，
換上無血清無抗性的培養(yǎng)基，加1M. 0. I的病毒液，于37t:孵育1-2小時。 3、倒出病毒液，換用2% FBS的維持培養(yǎng)基稀釋的梯度藥物。設空白對照、陽性對
照(金剛烷胺)、陰性對照(沒有任何藥物處理)。實驗組藥物有六個梯度。 4、置37°C、5% C02孵箱中培養(yǎng)，36h后收集各實驗孔病毒上清進行血凝實驗。
5、選用96孔血凝實驗板，除第一孔外，每孔加入75 ii L的PBS。
6、第一孔加入75 ii L待測病毒懸液，然后等比稀釋，至第12孔時棄去75 y L。
7、每孔加入1%雞紅細胞懸液75ii L，輕彈實驗板，使紅細胞與病毒充分混合，室 溫(20 25°C，以下相同)靜置30min、45min、60min時，觀察血凝現(xiàn)象并記錄結果。
8、以靜置45min時的血凝現(xiàn)象為最終結果。以出現(xiàn)"++"(即紅細胞在孔底形成一 個環(huán)狀，四周有小凝集塊)的流感病毒最高稀釋度為血凝終點，該稀釋度的倒數(shù)即為流感 病毒的血凝滴度。實驗同時設生理鹽水對照(排除血細胞自身的非特異性凝集)和病毒對 昭。 9 、處理試驗數(shù)據(jù)，得出試驗組各藥物抗病毒的最佳濃度。
10、按上述試驗結果，取各藥物抗病毒的最佳濃度進行試驗。 11、重復上述1-9的步驟，此時，只加入抗病毒藥物的最佳濃度(無需做梯度試 驗)，分別于24h、36h、48h取上清做病毒的時間相關性試驗。 在上述基礎上，考察了不同劑量的給藥是否對流感病毒表現(xiàn)出不同的作用，結果
顯示松蘿酸作用于流感病毒時也沒有明顯的劑量依賴性關系(見圖3)，在其使用安全濃度
范圍內(nèi)，松蘿酸已經(jīng)在較低劑量時達到了較好的抑制病毒復制作用，而隨著藥物濃度的增
加，其作用效果并不會發(fā)生明顯變化，也提示該藥物在治療時劑量可以適當調(diào)整。 同時檢測了藥物處理病毒感染后的細胞上清液中的病毒滴度，結果同樣表明不同
藥物的作用效果比較近似(見圖4)，雖然沒有劑量依賴性關系，但也說明藥物的細胞毒性
較低，藥物能夠在較低濃度和較大濃度范圍內(nèi)(即0. 16 500ii g/ml范圍內(nèi))發(fā)揮抗病毒作用。 根據(jù)上述結果，選用松蘿酸和金剛烷胺的細胞給藥濃度均為100i! g/ml，探討了不 同作用時間后病毒感染細胞上清液中病毒滴度(見圖5)，以病毒稀釋倍數(shù)來計數(shù)，不同作 用時間點實驗結果顯示病毒滴度隨著病毒感染時間的延長不斷增加，在48h達到最高值， 而松蘿酸和陽性對照藥物金剛烷胺在24h時就表現(xiàn)出良好的抑制病毒效果，隨著作用時間 的延長，其抑制病毒的作用有所降低，表明其在流感病毒感染的早期使用效果會更好。
B、噬斑法檢測松蘿酸是否具有抗流感病毒的作用 實驗過程MDCK單層細胞感染甲型流感病毒lh后，然后分別加入松蘿酸(100 ii g/ ml)，在藥物作用24h后，分別收集細胞上清液150iU，加入到已經(jīng)長滿單層細胞的六孔板， 在病毒上清液吸附lh之后，按照傳統(tǒng)噬斑法加入0. 5%瓊脂糖，然后繼續(xù)培養(yǎng)72h，孵化后 3天在37°C ， 10%福爾馬林膜固定，染色，1 %結晶紫染色。藍染色表明細胞沒有受到病毒影 響；未染色而出現(xiàn)空斑的結果表明細胞受到流感病毒的侵蝕。 結果顯示松蘿酸具有比較好的抗病毒復制作用，病毒感染的細胞中加入松蘿酸后 其細胞比較完整，病毒蝕斑較少，其作用效果比陽性對照藥金剛烷胺稍差，但是比病毒感染 未處理組有明顯的改善作用(見圖6)。
C、免疫熒光試驗檢測病毒感染細胞
免疫熒光染色操作 1、固定液的準備用4%多聚甲醛作為固定液，或根據(jù)特定的一抗或樣品采用有
效成分為乙醇、甲醇或其它類型的固定液。
2、洗滌液的準備
10XTBS的配制稱取24. 2g三羥甲基氨基甲烷(Tris堿)，80g NaCl ;用鹽酸調(diào)節(jié) pH值至7.6，定容至一升。TBS配制把10XTBS按照1 : 9的比例用水稀釋至IX即為TBS。
TBSTx的配制在TBS中加入Triton X-100使最終濃度為0. 1 %，混勻，即為 TBSTx。 3、封閉液的準備 配制含5%牛血清白蛋白(BSA)的TBSTx作為封閉液在100毫升TBSTx中加入 5g BSA，溶解并混勻，即為含5% BSA的TBSTx。
4、一抗稀釋液的準備 使用上述封閉液，即含5% BSA的TBSTx，作為一抗稀釋液。 —抗的稀釋一抗為鼠抗人H5N1HA單克隆抗體。按照一抗說明書中推薦的用于免
疫熒光染色的稀釋比例用一抗稀釋液稀釋一抗。
5、熒光標記二抗的稀釋把熒光標記的二抗，按照l : iooo的比例用本試劑盒提供的免疫熒光染色二抗稀
釋液進行稀釋。根據(jù)熒光的強弱，稀釋的比例可以適當提高或降低。 在熒光顯微鏡下，其結果見圖7，其中A.未感染病毒的陰性對照；B.感染病毒的細 胞對照；C.為感染病毒后加入松蘿酸的實驗組；D.為感染病毒后加入金剛烷胺的實驗組。 陰性對照組在激發(fā)光下不產(chǎn)生熒光；在視野中病毒感染未加任何藥物處理對照組在綠色激 發(fā)熒光下產(chǎn)生非常多的紅色熒光，表明細胞中表達的HA蛋白量很大，證明被流感病毒感染 的MDCK細胞很多；加入藥物UA的實驗組熒光結果比病毒感染對照組要少，但是比陽性對照 組——金剛烷胺要多，說明其抗病毒作用稍差于金剛烷胺，但效果還是比較明顯。
D、實時逆轉錄聚合酶鏈反應(Real-Time RT-PCR)檢測松蘿酸對病毒復制的影響
為了檢測松蘿酸對病毒轉錄和復制的影響，通過實時熒光定量試驗檢測了甲型流 感病毒三種不同形式的病毒RNA(mRNA、cRNA、vRNA)。不同藥物(松蘿酸和金剛烷胺)加入 感染H5N1病毒的MDCK細胞，4小時后收樣提取RNA。用不同的引物將病毒的mRNA、 cRNA、 vRNA反轉錄成cDNA，再通過熒光定量試驗，檢測病毒mRNA、 cRNA、 vRNA的量。
( — )引物設計 1、逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)引物
mRNA : 5' -TTTTTTTTTTTTTTTTTT_3'NP-cRNA:5' -AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCTTTAATTGTCAT-3，
NP-vRNA:5' -CTCACCGAGTGACATCAACATCATG-3，
2、 Real-Time PCR弓I物NP :正義(sense) 5， -GGATTTGGCGTCAAGCGAACA-3 ，
反義(antisense)5' -GTCCCTACCCCCTTTACTGC—3'
r-actin :正義(sense) 5， -TCTGTCAGGGTTGGAAAGTC-3'
反義(sense) 5， -AAATGCAAACCGCTTCCAAC—3' [O109] (二)病毒RNA的提取 1、用6孔板培養(yǎng)MDCK細胞，加入病毒1. 5h后分別加入最佳濃度(即lOOii g/ml) 的藥物，設空白對照、陽性對照與陰性對照；
2、4h后每孔加入lml Trizol勻槳；
3、移入1. 5ml新離心管； 4、冰上孵育5分鐘； 5、采用12， 000rpm的轉速4t:離心5分鐘，取上清液移入1. 5ml新離心管； 6、加0. 2ml氯仿，震蕩，冰上孵育5分鐘; 7、采用12，000rpm的轉速4。C離心10分鐘，取上層液移入1. 5ml新離心管； 8、加0. 5ml異丙醇，震蕩，冰上孵育5分鐘； 9、采用12，000rpm的轉速4。C離心5分鐘，棄去上清液； 10、加入lml 75%乙醇，震蕩； 11、采用7， 500rpm的轉速4。C離心5分鐘，棄去上清液； 12、室溫下使之變透明； 13、加入DEPC處理水10 ii 1-35 ii 1溶解RNA (可保存在液氮或低溫冰箱)。 (三)RT-PCR反應體系 第一步 RNA抽提物 2iU， 20mM引物 各lyl， 70°C 10分鐘，立即放入冰浴。 第二步 5x PT-PCR緩沖液 5iU， RNA sin 0. 5u 1， 25mM MgCl2 1. 5ii 1， 2. 5mM dNTP 2ii 1， AMV逆轉錄酶 liil， 無菌水 11 ill; 37°C 1. 5小時，94。C 10min。 (四)Real-Time PCR反應體系 上下游引物 各lul， 10xPCR緩沖液 2. 5 ii 1 ， 25mM MgC12 1. 5ii 1， DNA模板 liil， SYBR green I 1 u 1， 2. 5mM dNTP 2ii 1， Taq酶 lul， 無菌水 14iil; 反應條件1、95。C 5分鐘，為第一個步1個循環(huán)；2、95。C 30秒，55。C 30秒，72。C 1 分鐘為第二步40個循環(huán)；3、72°C 10分鐘。 Real-Time PCR的結果表明相對于對照組，病毒NP特異片段的mRNA在金剛烷胺 (p<0.01)、UA(p<0.05)的作用下顯著減少(見圖8-l)，病毒NP特異性片段的cRNA被 金剛烷胺(P < 0. 01)顯著地所抑制(見圖8-2)，病毒NP片段的vRNA只有在金剛烷胺(p <0.01)存在時，才會顯著降低(見圖8-3);但是cRNA和vRNA在使用UA后均明顯上升，
10說明UA抑制了 mRNA后，相應mRNA轉變成后者的量增加，其作用特點與金剛烷胺不同。
實施例2 :松蘿酸預防病毒感染、對流感病毒吸附入侵、復制的影響
分別將鋪成單層的細胞進行不同的處理方式藥物預先加入到細胞中孵育lh之 后，換液，加入相應的流感病毒；藥物對流感病毒吸附入侵采用藥物加入到病毒中共同孵育 lh，然后再加入到細胞中；藥物對流感病毒的復制影響，采用病毒先感染細胞lh后，然后加 入藥物。所有實驗中使用的藥物濃度均為100yg/ml，病毒感染量為1M.0. I的病毒液。分 別在24h、36h、48h時采集部分上清，采用HA測定藥物的抗病毒作用。 結果見圖9-l、9-2和9-3，表明松蘿酸不影響病毒的吸附和入侵，對病毒復制抑制 作用在36h之后才體現(xiàn)出來，但是并沒有陽性對照藥效果好，提示松蘿酸作為補充和聯(lián)合 用藥會更好。 實施例3 :哺育動物雙雜交試驗探討松蘿酸對復制過程中一些酶的影響
( — )細胞轉染質(zhì)粒分別為pM-PBl、 pM-PB2、 pVP_16_NP、 pG5Luc。本試驗組設陰性對照不加入 任何質(zhì)粒，陽性對照加入pM-PBl (或pM-PB2) 、 pVP-16-NP、 pG5Luc三種質(zhì)粒，實驗組加入 pM-PBl (或pM-PB2) 、 pVP-16-NP、 pG5Luc三種質(zhì)粒與各種藥物。
Sof ast 脂質(zhì)體轉染 以下轉染操作以24孔板為例。轉染全過程必須嚴格無菌操作。 1.在轉染前一天將待轉染細胞接種于24孔板中，37t:培養(yǎng)。轉染前的細胞密度以
40-60 %為準。 2.準備以下溶液 ①稀釋1. 5iilSofastTM試劑于30iil無血清、無抗菌素的DMEM培養(yǎng)基。混勻后室 溫靜置3分鐘。 ②稀釋0. 6 ii g待轉染質(zhì)粒DNA于30 iU無血清、無抗菌素的DMEM培養(yǎng)基?；靹?后室溫靜置。 3.混合①、②兩種溶液，室溫靜置20分鐘。 4.棄掉培養(yǎng)板中的舊培養(yǎng)基，加入0. 5ml無血清、無抗菌素的DMEM培養(yǎng)基。 5.加入上述Sofast 試劑-DNA混合物于24孔板。 6. 37。C溫育4-6小時后換10%血清和1%抗生素的DMEM培養(yǎng)基。 7. 24后換無血清DMEM培養(yǎng)基，37。C培養(yǎng)。 8. 48-72小時后檢測。 (二)熒光素酶活性測定 1 、取出熒光素酶底物和熒光素酶裂解液在室溫下平衡。 2、用PBS漂洗細胞(此過程必須仔細，不要接觸貼壁細胞。最后盡可能將PBS吸 出)。 3、加入足夠的裂解緩沖液以覆蓋細胞。例如400iil/60mm培養(yǎng)皿，900ia/100mm
培養(yǎng)皿或96孔板每孔20 iU。晃動培養(yǎng)皿數(shù)次以保證裂解緩沖液完全覆蓋細胞。 4、將細胞從培養(yǎng)皿刮下。將細胞及所有的液體轉移至一個離心管中。將離心管置
于冰上。旋渦震蕩離心管5-10秒鐘，然后以12000g離心15秒鐘(室溫)，將上清液轉移至
一個新的試管中。
5、取約30 ii 1 (所用裂解液總量為100 ill)與50 ill的平衡好的底物在一個1. 5ml 的Ep管中混合，然后立即在Turner BioSystems TD-20/20熒光光度計(TurnerDesigns， Su皿yvale， CA)上檢測樣品的熒光素酶的活性。 松蘿酸(UA)不能抑制病毒的吸附入侵，所以通過哺乳動物雙雜交試驗，檢測松蘿 酸是否通過抑制病毒的核蛋白(NP)與PB1、PB2之間的相互作用從而影響病毒的復制。試 驗結果見圖10-1、 10-2、 10-3和10-4，表明松蘿酸并不影響NP與PB2或PB1之間的結合而 抑制病毒復制，提示其抑制病毒的途徑和陽性對照藥物金剛烷胺不同，說明其作為聯(lián)合用 藥會提高其作用效果。(三)松蘿酸對流感病毒感染所引起的炎癥反應的影響作用 采用PGE2檢測試劑盒，分別在36、48h時收集病毒感染后的A549細胞上清液，按 照試劑盒測定方法測定細胞上清中的PGE2含量，結果見圖11 (PGE2含量的具體數(shù)據(jù)見表 2)。由圖11和表2中數(shù)據(jù)可知，病毒感染細胞36小時時產(chǎn)生的PGE2沒有明顯變化，且含 量很低，等病毒感染細胞48小時測定時，病毒感染未加任何藥物處理的細胞組PGE2含量最 高，與正常細胞對照組和用藥組有顯著性差異(*P < 0. 05 ;**p < 0. 01)，松蘿酸和陽性對 照藥金剛烷胺能夠顯著降低PGE2的分泌(與病毒感染組比較，*p < 0. 05 ;**p < 0. 01)。 說明松蘿酸能夠顯著降低病毒感染過程中引起的一些炎癥因子的分泌。
表2藥物對流感病毒感染A549細胞上清液中PGE2的影響
實驗組36h48h
松蘿酸0.439020.76744
金剛垸胺0.4146340.511628
病毒0.5609763.069767
正常細胞0.6585371.7卯698
空白1權利要求
松蘿酸在抗流感病毒藥物中的應用。
2. 根據(jù)權利要求1所述的松蘿酸在抗流感病毒藥物中的應用，其特征在于所述松蘿酸的給藥劑量按照細胞實驗用量為0. 16 500 g/ml。
3. 根據(jù)權利要求1所述的松蘿酸在抗流感病毒藥物中的應用，其特征在于所述松蘿酸制成抗流感病毒復方藥物。
4. 根據(jù)權利要求1所述的松蘿酸在抗流感病毒藥物中的應用，其特征在于所述松蘿酸單獨制成抗流感病毒藥物。
5. 根據(jù)權利要求1所述的松蘿酸在抗流感病毒藥物中的應用，其特征在于所述流感病毒為甲型流感病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種松蘿酸(unic acid，UA)在抗流感病毒藥物中的應用。本發(fā)明證實松蘿酸在體外對H5N1、H3N2等甲型流感病毒感染的MDCK細胞和A549細胞均具有一定的抗流感病毒作用。其作用效果與陽性對照藥金剛烷胺比較近似，另外松蘿酸對流感病毒引起的炎癥反應也有較好的抑制作用，揭示該藥物有開發(fā)成抗流感病毒藥物的前景。
文檔編號A61K31/343GK101693027SQ20091006381
公開日2010年4月14日 申請日期2009年9月4日 優(yōu)先權日2009年9月4日
發(fā)明者吳建國, 朱應, 李崇明, 袁婷婷, 陶君彥, 黃志軍 申請人:武漢大學;