專利名稱：中藥貝母提取物中貝母素甲和貝母素乙的檢測方法
技術領域：
本發(fā)明屬于毛細管電泳電化學發(fā)光檢測技術領域，具體涉及毛細管電 泳電化學發(fā)光檢測中藥貝母提取物中貝母素甲和貝母素乙的方法。
技術背景由于中藥中各種活性成分具有重要的藥理作用，因此中藥活性成分的 檢測已經(jīng)成為當前分析化學研究的熱點領域。為了提高中藥產(chǎn)業(yè)的國際競 爭力，中國的天然藥物發(fā)展必須與先進的檢測技術相接軌，中藥的分析檢 測必須科學化。貝母是用于止咳化痰的一種有名的中草藥。貝母中的兩種 主要活性成分貝母素甲和貝母素乙對止咳化痰具有重要的藥理作用。人們 一直在研究探索貝母中活性成分檢測的新方法，對貝母提取物中貝母素甲 和貝母素乙的有效分離、靈敏檢測是化學分析領域的一個重要課題。由于貝母素甲和貝母素乙不具有生色基團，因此常需要對其進行衍生 才可實現(xiàn)分析檢測，目前對中藥貝母中貝母素甲和貝母素乙的檢測大部分 集中在色譜-蒸發(fā)光聯(lián)用法[l-3]，此外還包括高效液相色譜-質(zhì)譜分析方法 [4]。對貝母素甲和貝母素乙進行衍生往往需要繁復的操作程序，冗長的分 析時間，且受蒸發(fā)光檢測技術靈敏度的限制，很難滿足中藥貝母提取物中 低含量活性成分的檢測需求。高效液相色譜-質(zhì)譜法不僅具有較高的靈敏度 同時還能提供被分析物的結構信息，是中藥提取物檢測一個重要、常規(guī)的分析方法。但是色譜-質(zhì)譜需要的儀器設備昂貴、操作復雜，這是該技術難 以推廣使用的技術物質(zhì)障礙。毛細管電泳是一種高效的分離分析手段，樣品需求小，高效分離，儀 器價格低廉，適用于各種帶電離子以及中性物質(zhì)的分析，在分析化學、生 物分析化學等領域有著廣泛的應用。吡啶釕電化學發(fā)光是一種靈敏的檢測 技術，其原理是通過電化學方法在電極表面產(chǎn)生一些特殊的物質(zhì)，這些物 質(zhì)之間或與體系中其它組分之間通過電子傳遞形成激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)返回到 基態(tài)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，產(chǎn)生的發(fā)光強度正比于被分析物濃度，從而被分析物 得到檢測。吡啶釕電化學發(fā)光無需對待測樣品進行衍生，無需其它額外的 光源，避免了背景光源的干擾，且吡啶釕電化學發(fā)光反應高效可逆，試劑 本身可循環(huán)使用，是一種靈敏經(jīng)濟的檢測手段。毛細管電泳與吡啶釕電化 學發(fā)光技術相聯(lián)用，使二者的優(yōu)勢相得益彰，毛細管電泳電化學發(fā)光檢測 聯(lián)用技術儀器造價低，操作簡單，可實現(xiàn)待測樣品的高效分離，靈敏檢測。(參考文獻[1] Z. Liu, Y. Jin, R Shen, J. Wang, Y. Shen, Talanta 71 (2007) 1873.[2] Y. Jin, P. Shen, J. Zhang, C. Zhuo, C. Xu, Y. Yu, Research & Information on Traditional Chinese Medicine 7 (2005) 13. [3] S.-L. Li, G. Lin, S.國W. Chan, P. Li, J. Chromatogr. A 909 (2001) 207. [4] J.-L Zhou, P. Li, H,J. Li, Y. Jiang, M,T. Ren, Y. Liu, J. Chromatogr. A1177 (2008) 126.)發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種靈敏、簡單、快速的毛細管電泳 電化學發(fā)光檢測貝母提取物中貝母素甲和貝母素乙的方法。 l.l待檢品的制備 l丄l中藥貝母l丄2貝母素甲標準溶液和貝母素乙標準溶液的制備分別把貝母素甲標準品和貝母素乙標準品溶解甲醇中，制得貝母素甲 標準品儲備液和貝母素乙標準品儲備液，所述的儲備液的濃度為分別為5.0 mmol/L，儲備液在4。C冰箱中冷藏保存；分別用甲醇，將貝母素甲標準品儲備液和貝母素乙標準品儲備液稀釋 成濃度為5.0X104 mol/L的貝母素甲標準溶液和貝母素乙標準溶液； l丄3貝母提取物相關溶液的制備A. 貝母提取物溶液的制備將貝母研磨成粉末，過40目篩子，稱取0.2g中藥貝母粉末，用0.2mL 氨水堿化，然后在超聲池中用3.0mL氯仿超聲萃取30min，萃取操作重復 2次，合并萃取液，在室溫下?lián)]發(fā)掉氯仿，得到中藥貝母提取物干物質(zhì)；由 0.2g中藥貝母粉末提取的干物質(zhì)溶解在1.0 mL甲醇中，用0.45pm的濾膜 過濾，得到貝母提取物溶液；B. 貝母提取物稀釋溶液的制備由步驟A得到的貝母提取物溶液用甲醇稀釋，獲得貝母提取物稀釋溶 液，甲醇加入的體積是步驟A甲醇體積的20或120倍；C. 貝母提取物稀釋加標溶液的制備向步驟A得到的貝母提取物溶液中分別加入由步驟1丄2獲得的濃度為 5.0X10-Smol/L的貝母素甲標準溶液和濃度為5.0Xl(TSmol/L的貝母素乙標準溶液，用甲醇稀釋獲得貝母提取物稀釋加標溶液，甲醇加入的體積是步 驟A甲醇體積的20或120倍； 1.2檢測步驟和條件1.2.1儀器裝置內(nèi)徑50/z附未涂層融硅毛細管；直徑500/zw鉑盤工作電極；士30kV 直流髙壓電源，美國Spellman高壓電子公司生產(chǎn)；電化學發(fā)光檢測系統(tǒng)， 西安瑞邁分析儀器有限責任公司生產(chǎn)；Cffl 832型電化學分析儀，上海辰 華儀器公司生產(chǎn)；1.2.2試劑 'NaH2P04， Na2HP04， NaOH，氨水，氯仿，甲醇，1-丁基-3-甲基咪唑 四氟硼酸鹽(BMImBF4)，三聯(lián)吡啶釕的六水合氯化物(Ru(bpy)32+)，貝母 素甲和貝母素乙的標準品，二次水；所用試劑均為分析純；配制好的溶液 在使用之前均經(jīng)0.45/zm濾膜過濾； 1.2.3溶液的制備 1.2.3.1背景電解質(zhì)溶液的配制(1) 磷酸鹽緩沖溶液的配制配制濃度為200.0 mmol/L的NaH2P04和濃度為200.0 mmol/L的 Na2HP04，將同濃度的二者混合再用二次水稀釋配成濃度為100.0 mmol/L 的磷酸鹽緩沖溶液，調(diào)整磷酸鹽緩沖溶液pH值為7.48;(2) Ru(bpy)32+溶液的配制 用二次水配制20.0mmol/LRu(bpy)3"溶液；(3) 背景電解質(zhì)溶液的配制將步驟(1)制備的磷酸鹽緩沖溶液與步驟(2)制備的Ru(bpy),溶 液混合，用二次水稀釋配制背景電解質(zhì)溶液；背景電解質(zhì)溶液中磷酸鹽濃 度為50.0 mmol/L， Ru(bpy)^+濃度為5.0 mmol/L;(4)含貝母素甲的背景電解質(zhì)溶液和含貝母素乙的背景電解質(zhì)溶液的配制先將步驟(1)制備的磷酸鹽緩沖溶液與步驟(2)制備的Ru(bpy)32+溶 液混合；把得到的混合溶液中的一部分加入由步驟l丄2獲得的貝母素甲標 準溶液，把得到的混合溶液中的另一部分加入由步驟l丄2獲得的貝母素乙 標準溶液，然后分別用二次水稀釋，分別得到含貝母素甲的背景電解質(zhì)溶 液和含貝母素乙的背景電解質(zhì)溶液；含貝母素甲的背景電解質(zhì)溶液和含貝 母素乙的背景電解質(zhì)溶液中磷酸鹽濃度均為50.0 mmol/L， Ru(bpy)f濃度 均為5.0mmol/L，貝母素甲和貝母素乙的濃度均為1.0X l(T6mol/L; 1.2.3.2運行緩沖溶液的配制(a) 磷酸鹽緩沖溶液的配制配制濃度為200.0 mmol/L的NaH2P04和濃度為200.0 mmol/L的 Na2HP04，將同濃度的二者混合，再用二次水稀釋配成濃度為100.0 mmol/L 的磷酸鹽緩沖溶液，調(diào)整磷酸鹽緩沖溶液pH值為8.00; .(b) BMImBF4溶液的配制將BMImBF4用二次水稀釋配成濃度為100.0 mmol/L的溶液；(c) 運行緩沖溶液的配制將步驟(a)得到的磷酸鹽緩沖溶液與步驟(b)獲得的BMmBF4溶液 混合，再用二次水稀釋得到運行緩沖溶液；運行緩沖溶液中磷酸鹽濃度為 8.0 mmol/L, BMImBF4濃度為40.0 mmol/L; 1.2.4檢測步驟 1.2.4.1分離毛細管的處理為了保證貝母素甲和貝母素乙高效分離，靈敏檢測及分析結果的重現(xiàn) 性，需對毛細管做以下處理新的毛細管柱使用0.1 mol/L氫氧化鈉活化過夜，之前，毛細管柱用0.1 mol/L濃度的氫氧化鈉沖洗5 min，再用二次水沖洗5min，然后用由步驟 1.2.3.2獲得的運行緩沖溶液平衡5 min;由于中藥貝母提取物中含有大量共存物質(zhì)對毛細管內(nèi)壁產(chǎn)生吸附，因 此，在兩次進樣之間需要對毛細管進行如下活化處理毛細管柱用0.1 mol/L 濃度的氫氧化鈉沖洗30 s，再用二次水沖洗30s，然后用由步驟1.2.3.2獲 得的運行緩沖溶液平衡30 s。1.2.4.2貝母素甲標準品溶液和貝母素乙標準品溶液的循環(huán)伏安實驗在步驟1.2.3.1 (3)獲得的背景電解質(zhì)溶液中循環(huán)掃描3-10周，掃描 電位區(qū)間是0 - 1.30 V，記錄穩(wěn)定時的循環(huán)伏安曲線；然后分別用由步驟 1.2.3.1 (4)獲得的含貝母素甲的背景電解質(zhì)溶液和含貝母素乙的背景電解 質(zhì)溶液中循環(huán)掃描3-10周，掃描區(qū)間同樣為0-1.30V，記錄穩(wěn)定時的循 環(huán)伏安曲線；將由含貝母素甲的背景電解質(zhì)溶液和含貝母素乙的背景電解質(zhì)溶液獲 得的循環(huán)伏安曲線分別與背景電解質(zhì)溶液得到的循環(huán)伏安曲線進行比較， 以確定貝母素甲和貝母素乙具有電化學活性及其電化學活性區(qū)間； 1.2.4.3中藥貝母提取物的檢測將步驟1丄3中的步驟B得到的貝母提取物稀釋溶液和1丄3中的步驟 C得到的貝母提取物的稀釋加標溶液分別按下述條件進行檢測檢測電位1.20 V;進樣時間3 S;進樣高壓16kV;電泳分離高壓16 kV;檢測池中添加步驟1.2.3.1制備的背景電解質(zhì)溶液；電泳采用步驟1.2.3.2獲 得的運行緩沖溶液；三電極體系包括直徑500/^鉑盤工作電極、鉑絲對極 以及Ag/AgCl參比電極；毛細管柱內(nèi)徑50/^2;電化學發(fā)光采用柱端檢測 模式；光電倍增管偏置電壓設定在800V;獲得中藥貝母檢測的電泳圖譜。 有關湖北貝母和新疆貝母的檢測電泳圖譜分別見圖2和圖3。 有益效果本發(fā)明所涉及的中藥貝母中兩種活性成分貝母素甲和貝母素乙的檢測方法同其它檢測方法比較有如下特點1) 靈敏度高，線性范圍寬。本發(fā)明的方法對貝母素甲和貝母素乙的檢測限分別為1.25xl(T1()mol/L和1.0><10—1()mol/L，比常用的蒸發(fā)光檢測方法 檢測限低4個數(shù)量級，比質(zhì)譜檢測技術檢測限低2個數(shù)量級。貝母素甲和 貝母素乙的線性范圍分別為是l.OxlO-8 - l.OxlO"6 mol/L和5.0X10-8 — 1.0x10—6 mol/L，跨越二個數(shù)量級。2) 分離功能強大。離子液體具有特殊的物理、化學性質(zhì)，運行緩沖溶 液中離子液體BMImBF4的使用，使得結構相似的貝母素甲和貝母素乙的分 離選擇性發(fā)生了重要改變，可以實現(xiàn)二者的高效分離。3) 樣品用量少，檢測時間短。納升級的進樣量即可滿足毛細管電泳電 化學發(fā)光體系的分離檢測需求。本發(fā)明的檢測方法不需要對待測樣品進行 柱前、柱后衍生，中藥貝母提取物可直接用于毛細管電泳分離電化學發(fā)光 檢測，整個電泳過程可控制在12min以內(nèi)。4) 分析成本低，操作簡單。毛細管、高壓電源、恒電位儀是毛細管電 泳電化學發(fā)光檢測的基本操作平臺，輔助一些實驗室常用的化學試劑即可 完成檢測任務；吡啶釕電化學發(fā)光可逆、高效，極大的降低了試劑的消耗，減少檢測成本。同質(zhì)譜等一些非常靈敏的檢測方法相比，本發(fā)明的方法更 加方便快捷，同時儀器成本相對較低。本發(fā)明首次將毛細管電泳電化學發(fā)光檢測技術應用于中藥貝母提取物中貝母素甲和貝母素乙的檢測，首次采用離子液體BMImBF4對中藥的活性成分進行分離。


圖l是對湖北貝母提取物進行檢測的電泳譜圖。其中a是湖北貝母的貝母提 取物稀釋溶液電化學發(fā)光電泳譜圖，b是加入貝母素甲標準品和貝母素乙標準品 的貝母提取物稀釋加標溶液電泳譜圖。貝母素甲標準品和貝母素乙標準品加標 濃度均為2.5X10々mol/L。 1、 2峰分別為貝母素乙和貝母素甲的電泳峰。圖2是對新疆貝母提取物進行檢測的電泳譜圖。其中a是新疆貝母的貝母提 取物稀釋溶液電化學發(fā)光電泳譜圖，b是加入貝母素甲標準品的貝母提取物稀釋 加標溶液電泳譜圖。貝母素甲標準品加標濃度為1.0X1(T6 mol/L。 l峰為貝母素 甲的電泳峰。
具體實施方式
以下實施例采用毛細管電泳電化學發(fā)光分析檢測體系。檢測電位1.20 V; 進樣時間3S;進樣高壓16kV;電泳分離高壓16kV;檢測池中添加步驟1.2.3.1制備的背景電解質(zhì)溶液；電泳采用步驟1.2.3.2獲得的運行緩沖溶液；三電極體 系包括直徑50(Mm鉑盤工作電極、鉑絲對極以及Ag/AgCl參比電極；毛細管柱 內(nèi)徑50/^;電化學發(fā)光采用柱端檢測模式；光電倍增管偏置電壓設定在800V;實施例l中藥湖北貝母提取物中貝母素甲和貝母素乙的檢測 1.1待檢品的制備l丄l中藥貝母是中藥湖北貝母l丄2貝母素甲標準溶液和貝母素乙標準溶液的制備分別把貝母素甲標準品和貝母素乙標準品溶解甲醇中，制得貝母素甲 標準品儲備液和貝母素乙標準品儲備液，所述的儲備液的濃度為分別為5.0 mmol/L，儲備液在4。C冰箱中冷藏保存；分別用甲醇，將貝母素甲標準品儲備液和貝母素乙標準品儲備液稀釋 成濃度為5.0X104mol/L的貝母素甲標準溶液和貝母素乙標準溶液； l丄3貝母提取物溶液的制備A貝母提取物溶液的制備將貝母研磨成粉末，過40目篩子，準確稱取0.2g中藥貝母粉末，用 0.2mL氨水堿化，然后在超聲池中用3.0mL氯仿超聲萃取30min，萃取操 作重復2次，合并萃取液，在室溫下?lián)]發(fā)掉氯仿，得到中藥貝母提取物干 物質(zhì)；由0.2g中藥貝母粉末提取的干物質(zhì)溶解在1.0 mL甲醇中，用0.45pm 的濾膜過濾，得到貝母提取物溶液；B貝母提取物稀釋溶液的制備由A得到的貝母提取物溶液用甲醇稀釋，獲得貝母提取物稀釋溶液， 甲醇加入的體積是步驟A甲醇體積的120倍； C貝母提取物稀釋加標溶液的制備向步驟A得到的貝母提取物溶液中分別加入由步驟1丄2獲得的濃度為 5.0X l(r5mol/L的貝母素甲標準溶液和濃度為5.0X 10—5mol/L的貝母素乙標準溶液，用甲醇稀釋獲得貝母提取物稀釋加標溶液，甲醇加入的體積是步 驟A甲醇體積的120倍；1.2檢測步驟和條件 1.2.1儀器裝置內(nèi)徑50/Z7W未涂層融硅毛細管；直徑500//附鉑盤工作電極；± 30 kV直流高壓電源,美國Spellman高壓電子公司生產(chǎn)；電化學發(fā)光檢測系統(tǒng)， 西安瑞邁分析儀器有限責任公司生產(chǎn)；Cffl 832型電化學分析儀，上海辰 華儀器公司生產(chǎn)； 1.2.2試齊JNaH2P04， Na2HP04， NaOH，氨水，氯仿，甲醇，1-丁基-3-甲基咪唑 四氟硼酸鹽(BMmBF4)，三聯(lián)吡啶釕的六水合氯化物(Ru(bpy)32+)，貝母 素甲和貝母素乙的標準品，二次水；所用試劑均為分析純；配制好的溶液 在使用之前均經(jīng)0.45/zw濾膜過濾； 1.2.3溶液的制備 1.2.3.1背景電解質(zhì)溶液的配制(1) 磷酸鹽緩沖溶液的配制配制濃度為200.0 mmol/L的NaH2P04和濃度為200.0 mmol/L的 Na2HP04，將同濃度的二者混合再用二次水稀釋配成濃度為100.0 mmol/L 的磷酸鹽緩沖溶液，調(diào)整磷酸鹽緩沖溶液pH值為7.48;(2) Ru(bpy)32+溶液的配制 用二次水配制20.0mmol/LRu(bpy),溶液；(3) 背景電解質(zhì)溶液的配制將步驟(1)制備的磷酸鹽緩沖溶液與步驟(2)制備的Ru(bpy)32+溶 液混合，用二次水稀釋配制背景電解質(zhì)溶液；背景電解質(zhì)溶液中磷酸鹽濃度為50.0 mmol/L， Ru(bpy)32+濃度為5.0 mmol/L;(4)含貝母素甲的背景電解質(zhì)溶液和含貝母素乙的背景電解質(zhì)溶液的配制先將步驟(1)制備的酸鹽緩沖溶液與步驟(2)制備的Ru(bpy)32+溶 液混合，再分別加入由步驟l丄2獲得的貝母素甲標準溶液和貝母素乙標準 溶液，然后用二次水稀釋，分別得到含貝母素甲的背景電解質(zhì)溶液和含貝 母素乙的背景電解質(zhì)溶液；含貝母素甲的背景電解質(zhì)溶液和含貝母素乙的 背景電解質(zhì)溶液中磷酸鹽濃度均為50.0 mmol/L， Ru(bpy) +濃度均為5.0 mmol/L，貝母素甲和貝母素乙的濃度均為1.0X10《mol/L; 1.2.3.2運行緩沖溶液的配制(1) 磷酸鹽緩沖溶液的配制配制濃度為200.0 mmol/L的NaH2P04和濃度為200.0 mmol/L的 Na2HP04，將同濃度的二者混合，再用二次水稀釋配成濃度為100.0 mmol/L 的磷酸鹽緩沖溶液，調(diào)整磷酸鹽緩沖溶液pH值為8.00;(2) BMImBF4溶液的配制將BMImBF4用二次水稀釋配成濃度為100.0 mmol/L的溶液；(3) 運行緩沖溶液的配制將步驟(1)得到的運行緩沖溶液與步驟(2)獲得的BMImBF4溶液混 合，再用二次水稀釋得到運行緩沖溶液；運行緩沖溶液中磷酸鹽濃度為8.0 mmol/L, BMImBF4濃度為40.0 mmol/L; 1.2.4檢測步驟 1.2.4.1分離毛細管的處理為了保證貝母素甲和貝母素乙高效分離，靈敏檢測及分析結果的重現(xiàn) 性，需對毛細管做以下處理新的毛細管柱使用0.1 mol/L氫氧化鈉活化過夜，之前，毛細管柱用0.1 mol/L濃度的氫氧化鈉沖洗5 min，再用二次水沖洗5 min，然后用由步驟 1.2.3.2獲得的運行緩沖溶液平衡5 min;由于中藥貝母提取物中，有大量共 存物質(zhì)對毛細管內(nèi)壁產(chǎn)生吸附，因此，在兩次進樣之間需要對毛細管進行 如下活化處理毛細管柱用0.1mol/L濃度的氫氧化鈉沖洗30s，再用二次 水沖洗30 s，然后用由步驟1.2.3.2獲得的運行緩沖溶液平衡30 s。 1.2.4.2貝母素甲標準品溶液和貝母素乙標準品溶液的循環(huán)伏安實驗在步驟1.2.3.1 (3)獲得的背景電解質(zhì)溶液中循環(huán)掃描3-10周，掃描 電位區(qū)間是0 - 1.30 V，記錄穩(wěn)定時的循環(huán)伏安曲線；然后分別用由步驟 1.2.3.1 (4)獲得的含貝母素甲的背景電解質(zhì)溶液和含貝母素乙的背景電解 質(zhì)溶液中循環(huán)掃描3-10周，掃描區(qū)間同樣為0-1.30 V，記錄穩(wěn)定時的循 環(huán)伏安曲線；將由含貝母素甲的背景電解質(zhì)溶液和含貝母素乙的背景電解質(zhì)溶液獲 得的循環(huán)伏安曲線分別與背景電解質(zhì)溶液得到的循環(huán)伏安曲線進行比較， 以確定貝母素甲和貝母素乙具有電化學活性及其電化學活性區(qū)間； 1.2.4.3中藥貝母提取物的檢測將步驟l丄3 B中得到的貝母提取物稀釋溶液和l丄3 C中得到的貝母 提取物的稀釋加標溶液分別按下述條件進行檢測檢測電位1.20 V;進樣時間3 S;進樣高壓16kV;電泳分離高壓16 kV;檢測池中添加步驟1.2.3.1制備的背景電解質(zhì)溶液；電泳采用步驟1.2.3.2獲得的運行緩沖溶液；三電極體系包括直徑500^m鉑盤工作電極、鉑絲對極以及Ag/AgCl參比電極；毛細管柱內(nèi)徑50，；電化學發(fā)光采用柱端檢測模式；光電倍增管偏置電壓設定在800V;獲得中藥湖北貝母提取物的電泳譜圖(見圖1)。
實施例2中藥新疆貝母提取物中貝母素甲和貝母素乙的檢測中藥新疆貝母提取物的檢測，所采用的檢測步驟除步驟1丄3外，均采用與實施例1相同的檢測步驟和條件。l丄3貝母提取物溶液的制備A貝母提取物溶液的制備
將貝母研磨成粉末，過40目篩子，準確稱取0.2g中藥貝母粉末，用0.2mL氨水堿化，然后在超聲池中用3.0mL氯仿超聲萃取30min，萃取操作重復2次，合并萃取液，在室溫下?lián)]發(fā)掉氯仿，得到中藥貝母提取物干物質(zhì)；由0.2g中藥貝母粉末提取的干物質(zhì)溶解在l.OmL甲醇中，用0.45nm的濾膜過濾，得到貝母提取物溶液；
B貝母提取物稀釋溶液的制備
由A得到的貝母提取物溶液用甲醇稀釋，獲得貝母提取物稀釋溶液，甲醇加入的體積是步驟A甲醇體積的20倍；C貝母提取物稀釋加標溶液的制備
向步驟A得到的貝母提取物溶液中加入由步驟l丄2獲得的濃度為5.0X10-5mol/L的貝母素甲標準溶液，用甲醇稀釋獲得新疆貝母的貝母提取物稀釋加標溶液，甲醇加入的體積是步驟A甲醇體積的20倍；獲得中藥新疆貝母提取物的電泳譜圖(見圖2)。
權利要求
1、中藥貝母提取物中貝母素甲和貝母素乙的檢測方法，其特征在于步驟和條件如下1.1待檢品的制備1.1.1中藥貝母1.1.2貝母素甲標準溶液和貝母素乙標準溶液的制備分別把貝母素甲標準品和貝母素乙標準品溶解甲醇中，制得貝母素甲標準品儲備液和貝母素乙標準品儲備液，所述的儲備液的濃度為分別為5.0mmol/L，儲備液在4℃冰箱中冷藏保存；分別用甲醇，將貝母素甲標準品儲備液和貝母素乙標準品儲備液稀釋成濃度為5.0×10-4mol/L的貝母素甲標準溶液和貝母素乙標準溶液；1.1.3貝母提取物相關溶液的制備A.貝母提取物溶液的制備將貝母研磨成粉末，過40目篩子，稱取0.2g中藥貝母粉末，用0.2mL氨水堿化，然后在超聲池中用3.0mL氯仿超聲萃取30min，萃取操作重復2次，合并萃取液，在室溫下?lián)]發(fā)掉氯仿，得到中藥貝母提取物干物質(zhì)；由0.2g中藥貝母粉末提取的干物質(zhì)溶解在1.0mL甲醇中，用0.45μm的濾膜過濾，得到貝母提取物溶液；B.貝母提取物稀釋溶液的制備由步驟A得到的貝母提取物溶液用甲醇稀釋，獲得貝母提取物稀釋溶液，甲醇加入的體積是步驟A甲醇體積的20或120倍；C.貝母提取物稀釋加標溶液的制備向步驟A得到的貝母提取物溶液中分別加入由步驟1.1.2獲得的濃度為5.0×10-5mol/L的貝母素甲標準溶液和濃度為5.0×10-5mol/L的貝母素乙標準溶液，用甲醇稀釋獲得貝母提取物稀釋加標溶液，甲醇加入的體積是步驟A甲醇體積的20或120倍；1.2檢測步驟和條件1.2.1儀器裝置內(nèi)徑50μm未涂層融硅毛細管；直徑500μm鉑盤工作電極；±30kV直流高壓電源，美國Spellman高壓電子公司生產(chǎn)；電化學發(fā)光檢測系統(tǒng)，西安瑞邁分析儀器有限責任公司生產(chǎn)；CHI 832型電化學分析儀，上海辰華儀器公司生產(chǎn)；1.2.2試劑NaH2PO4，Na2HPO4，NaOH，氨水，氯仿，甲醇，1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽(BMImBF4)，三聯(lián)吡啶釕的六水合氯化物(Ru(bpy)32+)，貝母素甲和貝母素乙的標準品，二次水；所用試劑均為分析純；配制好的溶液在使用之前均經(jīng)0.45μm濾膜過濾；1.2.3溶液的制備1.2.3.1背景電解質(zhì)溶液的配制(1)磷酸鹽緩沖溶液的配制配制濃度為200.0mmol/L的NaH2PO4和濃度為200.0mmol/L的Na2HPO4，將同濃度的二者混合再用二次水稀釋配成濃度為100.0mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液，調(diào)整磷酸鹽緩沖溶液pH值為7.48；(2)Ru(bpy)32+溶液的配制用二次水配制20.0mmol/L Ru(bpy)32+溶液；(3)背景電解質(zhì)溶液的配制將步驟(1)制備的磷酸鹽緩沖溶液與步驟(2)制備的Ru(bpy)32+溶液混合，用二次水稀釋配制背景電解質(zhì)溶液；背景電解質(zhì)溶液中磷酸鹽濃度為50.0mmol/L，Ru(bpy)32+濃度為5.0mmol/L；(4)含貝母素甲的背景電解質(zhì)溶液和含貝母素乙的背景電解質(zhì)溶液的配制先將步驟(1)制備的磷酸鹽緩沖溶液與步驟(2)制備的Ru(bpy)32+溶液混合；把得到的混合溶液中的一部分加入由步驟1.1.2獲得的貝母素甲標準溶液，把得到的混合溶液中的另一部分加入由步驟1.1.2獲得的貝母素乙標準溶液，然后分別用二次水稀釋，分別得到含貝母素甲的背景電解質(zhì)溶液和含貝母素乙的背景電解質(zhì)溶液；含貝母素甲的背景電解質(zhì)溶液和含貝母素乙的背景電解質(zhì)溶液中磷酸鹽濃度均為50.0mmol/L，Ru(bpy)32+濃度均為5.0mmol/L，貝母素甲和貝母素乙的濃度均為1.0×10-6mol/L；1.2.3.2運行緩沖溶液的配制(a)磷酸鹽緩沖溶液的配制配制濃度為200.0mmol/L的NaH2PO4和濃度為200.0mmol/L的Na2HPO4，將同濃度的二者混合，再用二次水稀釋配成濃度為100.0mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液，調(diào)整磷酸鹽緩沖溶液pH值為8.00；(b)BMImBF4溶液的配制將BMImBF4用二次水稀釋配成濃度為100.0mmol/L的溶液；(c)運行緩沖溶液的配制將步驟(a)得到的磷酸鹽緩沖溶液與步驟(b)獲得的BMImBF4溶液混合，再用二次水稀釋得到運行緩沖溶液；運行緩沖溶液中磷酸鹽濃度為8.0mmol/L，BMImBF4濃度為40.0mmol/L；1.2.4檢測步驟1.2.4.1分離毛細管的處理為了保證貝母素甲和貝母素乙高效分離，靈敏檢測及分析結果的重現(xiàn)性，需對毛細管做以下處理新的毛細管柱使用0.1mol/L氫氧化鈉活化過夜，之前，毛細管柱用0.1mol/L濃度的氫氧化鈉沖洗5min，再用二次水沖洗5min，然后用由步驟1.2.3.2獲得的運行緩沖溶液平衡5min；由于中藥貝母提取物中含有大量共存物質(zhì)對毛細管內(nèi)壁產(chǎn)生吸附，因此，在兩次進樣之間需要對毛細管進行如下活化處理毛細管柱用0.1mol/L濃度的氫氧化鈉沖洗30s，再用二次水沖洗30s，然后用由步驟1.2.3.2獲得的運行緩沖溶液平衡30s。1.2.4.2貝母素甲標準品溶液和貝母素乙標準品溶液的循環(huán)伏安實驗在步驟1.2.3.1(3)獲得的背景電解質(zhì)溶液中循環(huán)掃描3-10周，掃描電位區(qū)間是0-1.30V，記錄穩(wěn)定時的循環(huán)伏安曲線；然后分別用由步驟1.2.3.1(4)獲得的含貝母素甲的背景電解質(zhì)溶液和含貝母素乙的背景電解質(zhì)溶液中循環(huán)掃描3-10周，掃描區(qū)間同樣為0-1.30V，記錄穩(wěn)定時的循環(huán)伏安曲線；將由含貝母素甲的背景電解質(zhì)溶液和含貝母素乙的背景電解質(zhì)溶液獲得的循環(huán)伏安曲線分別與背景電解質(zhì)溶液得到的循環(huán)伏安曲線進行比較，以確定貝母素甲和貝母素乙具有電化學活性及其電化學活性區(qū)間；1.2.4.3中藥貝母提取物的檢測將步驟1.1.3中的步驟B得到的貝母提取物稀釋溶液和1.1.3中的步驟C得到的貝母提取物的稀釋加標溶液分別按下述條件進行檢測檢測電位1.20V；進樣時間3s；進樣高壓16kV；電泳分離高壓16kV；檢測池中添加步驟1.2.3.1制備的背景電解質(zhì)溶液；電泳采用步驟1.2.3.2獲得的運行緩沖溶液；三電極體系包括直徑500μm鉑盤工作電極、鉑絲對極以及Ag/AgCl參比電極；毛細管柱內(nèi)徑50μm；電化學發(fā)光采用柱端檢測模式；光電倍增管偏置電壓設定在800V；獲得中藥貝母檢測的電泳圖譜。
全文摘要
本發(fā)明提供了中藥貝母提取物中貝母素甲和貝母素乙的檢測方法，采用毛細管電泳電化學發(fā)光的方法。對貝母素甲和貝母素乙的檢測限分別為1.25×10^-10mol/L和1.0×10^-10mol/L，線性范圍分別為是1.0×10^-8-1.0×10^-6mol/L和5.0×10^-8-1.0×10^-6mol/L；比常用的蒸發(fā)光檢測方法檢測限低4個數(shù)量級，比質(zhì)譜檢測技術檢測限低2個數(shù)量級，線性范圍跨越二個數(shù)量級；運行緩沖溶液中離子液體BMImBF₄實現(xiàn)貝母素甲和貝母素乙的高效分離；納升級的進樣量且不需要對待測樣品進行柱前、柱后衍生，中藥貝母提取液直接用于檢測；整個電泳過程在12min以內(nèi)。
文檔編號A61P11/10GK101601805SQ20091006719
公開日2009年12月16日 申請日期2009年6月30日 優(yōu)先權日2009年6月30日
發(fā)明者前 向, 吳仙花, 春 鄭, 戈 馬, 英 高 申請人:長春工程學院