專利名稱：益氣復(fù)脈制劑在制備防治內(nèi)毒素引起的休克和腸管損傷的藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及益氣復(fù)脈制劑在制備防治內(nèi)毒素引起的休克、腸管損傷的藥物中的用 途，更具體地說(shuō)是一種注射用益氣復(fù)脈凍干粉針劑在制備防治內(nèi)毒素引起的休克和/或腸 管損傷的藥物中的用途，屬于中藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
益氣復(fù)脈制劑源于金代《醫(yī)學(xué)啟源》中的著名古方生脈散。具有益氣生津、斂陰止 汗的功能。臨床上主要用于治療氣陰兩虧、脈虛欲脫的心悸、氣短、四肢很冷、汗出、脈欲絕 及心肌梗塞、心源性休克、感染性休克的氣陰兩虧證等。中國(guó)專利ZL200410021920. 8提供 了一種益氣復(fù)脈制劑及其制備方法，該制劑構(gòu)成簡(jiǎn)單，生產(chǎn)工藝合理、產(chǎn)品質(zhì)量好。膿毒癥是死亡率較高的危重病癥，內(nèi)毒素引起的微循環(huán)障礙，休克和多臟器損傷 是膿毒癥致死的主要病理基礎(chǔ)。關(guān)于益氣復(fù)脈制劑是否可以用于防治內(nèi)毒素引起的休克和 腸管損傷尚未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供益氣復(fù)脈制劑在制備防治膿毒癥休克和腸管損 傷的藥物中的用途。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案益氣復(fù)脈制劑在制備防治膿毒癥休克和/或腸管損傷的藥物中的用途。所述益氣復(fù)脈制劑由紅參1-50重量份、麥冬3-150重量份、五味子1. 5-75重量份 制備而成，其制備方法為紅參采用乙醇提取，回收乙醇，加水沉淀，除去上層油，水溶液過(guò) 濾、濃縮，用真空干燥、噴霧干燥或凍干干燥法干燥，得紅參提取物；麥冬、五味子用水提取， 提取液濃縮后，醇沉一次或一次以上，第一次醇沉?xí)r的含醇量為70-80%，二次及二次以上 的含醇量均為80-99. 9%，回收乙醇，將藥液濃縮，再用真空干燥、噴霧干燥或冷凍干燥法干 燥，得到麥冬、五味子提取物，再用不同的方法制成粉針劑或注射劑。所述粉針劑的制備方法為，紅參用乙醇提取，回收乙醇，加水沉淀，除去上層油，水 溶液過(guò)濾、濃縮，用真空干燥、噴霧干燥或冷凍干燥法干燥，得紅參提取物；麥冬、五味子用 水提取，提取液濃縮后，醇沉一次或一次以上，第一次醇沉?xí)r的含醇量為70-80%，二次及二 次以上的含醇量均為80-99.9%，回收乙醇，將藥液濃縮，再用真空干燥、噴霧干燥或冷凍干 燥法干燥，得到麥冬、五味子提取物，所得提取物溶解，過(guò)濾，加入葡甲胺及甘露醇，藥液過(guò) 微孔濾膜后灌裝、凍干、加蓋、即得益氣復(fù)脈粉針劑。所述注射劑的制備方法為，紅參用乙醇提取，回收乙醇，加水沉淀，除去上層油，水 溶液過(guò)濾、濃縮，用真空干燥、噴霧干燥或冷凍干燥法干燥，得紅參提取物；麥冬、五味子用 水提取，提取液濃縮后，醇沉一次或一次以上，第一次醇沉?xí)r的含醇量為70-80%，二次及二 次以上的含醇量均為80-99.9%，回收乙醇，將藥液濃縮，再用真空干燥、噴霧干燥或冷凍干燥法干燥，得到麥冬、五味子提取物，所得提取物溶解，過(guò)濾，藥液過(guò)微孔濾膜后灌封，即得 益氣復(fù)脈注射劑。所述防治休克和/或腸管損傷是防治由膿毒癥休克和/或腸管損傷。所述防治由膿毒癥休克是指，降低由內(nèi)毒素引起的休克動(dòng)物(包括人)的死亡數(shù) 量、改善休克體征。所述防治由膿毒癥腸管損傷是指，減輕由內(nèi)毒素引起的腸管出血和腸損傷、抑制 腸管血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子ICMA-1的表達(dá)和抑制白細(xì)胞的游出。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是益氣復(fù)脈制劑解決了膿毒癥引起死亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，即改善休克， 減少腸管出血和損傷。益氣復(fù)脈制劑可以治療內(nèi)毒素引起的休克；益氣復(fù)脈制劑可以降低 內(nèi)毒素引起的死亡；益氣復(fù)脈制劑可以減輕內(nèi)毒素引起的動(dòng)物腸管損傷，減輕腸管出血； 益氣復(fù)脈制劑可以抑制內(nèi)毒素引起的動(dòng)物腸管血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子 ICMA-1的表達(dá)和抑制白細(xì)胞的游出。下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步敘述，以使公眾對(duì)發(fā)明內(nèi)容有更 深入的了解，并非對(duì)本發(fā)明的限制，凡依照本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容所進(jìn)行的任何本領(lǐng)域等同替換， 均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。


圖1為益氣復(fù)脈對(duì)內(nèi)毒素血癥大鼠存活率的影響。圖2A為益氣復(fù)脈前對(duì)內(nèi)毒素血癥大鼠MAP的影響；圖2B為益氣復(fù)脈前對(duì)內(nèi)毒素 血癥大鼠HR的影響。圖3A為益氣復(fù)脈前對(duì)內(nèi)毒素血癥大鼠RR的影響；圖3B為益氣復(fù)脈前對(duì)內(nèi)毒素血 癥大鼠RT的影響。圖4為益氣復(fù)脈對(duì)內(nèi)毒素血癥大鼠腸管出血點(diǎn)的影響。圖5為益氣復(fù)脈對(duì)內(nèi)毒素血癥大鼠腸管組織學(xué)的影響。圖6為72小時(shí)后對(duì)腸管免疫組化染色的結(jié)果。圖7為ICAM-1表達(dá)的結(jié)果。圖8為益氣復(fù)脈對(duì)LPS引起的大鼠腸粘膜內(nèi)MP0陽(yáng)性細(xì)胞的影響。圖9為益氣復(fù)脈對(duì)LPS引起的大鼠腸粘膜內(nèi)MP0陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的影響。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 一.材料和方法1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物ffistar大鼠，雄性，體重200_250g，購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物部，許可證號(hào) SYXK (京)2006-0001。54只大鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組、模型組和益氣復(fù)脈+LPS組，每組18 只，自由進(jìn)食飲水，飼養(yǎng)條件為溫度24士 1°C，相對(duì)濕度50% 士 1%，12小時(shí)切換照明。一切 飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)皆依照北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理規(guī)定進(jìn)行。2.實(shí)驗(yàn)藥品及生物材料注射用益氣復(fù)脈凍干粉針劑由天之?huà)晒咎峁?0070702.
LPS(Escherchia Coli serotype 055 :B), J^T Sigma Chemical Co (St Louis, MO, USA)烏拉坦購(gòu)于上海天蓮精細(xì)化工有限公司，用生理鹽水配制成20%溶液。Triton-100 北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司，ZLI-9329。髓過(guò)氧化物酶試劑盒南京建成生物研究所，20060428。ICAM-1 抗體BD 公司，BD554967。ABC試劑盒北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司，PV-6002。二.方法1. LPS及益氣復(fù)脈的投入正常對(duì)照組(Control組)基礎(chǔ)觀察10分鐘后，經(jīng)由左頸靜脈緩慢(1分鐘)推 注生理鹽水1ml，10分鐘后經(jīng)左頸靜脈連續(xù)滴注生理鹽水(4ml/hr)至90分鐘。模型組(LPS組)基礎(chǔ)觀察10分鐘后，經(jīng)由左頸靜脈緩慢(1分鐘)推注生理鹽 水1ml，經(jīng)由左頸靜脈連續(xù)滴注LPS(5mg/kg/hr)至90分鐘。益氣復(fù)脈+LPS組(N = 6) (yiqifumai+LPS)基礎(chǔ)觀察10分鐘后，經(jīng)由左頸靜脈緩 慢(1分鐘)推注益氣復(fù)脈80mg/kg，滴注10分鐘后沿左頸靜脈連續(xù)滴注LPS (5mg/kg/hr) 至90分鐘觀察結(jié)束。54只大鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組、模型組及益氣復(fù)脈+LPS組，每組18只，每24小時(shí) 評(píng)估每組大鼠存活率、平均動(dòng)脈壓(MAP)，心率(HR)，呼吸頻率(RR)、肛溫(RT)。LPS輸注 72小時(shí)后，觀察存活大鼠的腸管出血情況，取腸管，做HE及免疫組化染色。2.指標(biāo)測(cè)定(1)大鼠存活率和MAP、HR、RR、RT的測(cè)定LPS注入24，48及72小時(shí)后分別監(jiān)測(cè)各組大鼠生理學(xué)指標(biāo)，應(yīng)用無(wú)創(chuàng)智能血壓計(jì) (BP-98A，Softron，China)監(jiān)測(cè)MAP和HR，計(jì)數(shù)RR率，應(yīng)用熱電偶監(jiān)測(cè)RT。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn) 記錄存活動(dòng)物數(shù)并計(jì)算生存率。(2)腸管出血點(diǎn)的計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以烏拉坦肌肉麻醉(1. 25mg/kg. bw, i. m.)。頸靜脈插管以輸注藥物，72 小時(shí)存活的動(dòng)物剪去腹部毛發(fā)沿腹部正中作2 3cm的切口，暴露小腸。將大鼠仰位在觀 察板上，輕輕提出小腸(回盲部向口側(cè)10 15cm)，并將小腸展開(kāi)放在觀察板上，在表面連 續(xù)滴加37°C生理鹽水保持溫度和濕度，通過(guò)體式顯微鏡(SZ-CTV，OLYMPUS, Japan)進(jìn)行觀 察，連接在顯微鏡上的CCD彩色攝像機(jī)(Jk-TO53H，Toshiba，Japan)將圖像傳輸至在顯示屏 上(J2118A，TCL，China)，用CCD錄像機(jī)(DVR-R25，Malata，China)記錄觀察五個(gè)視野，在每 個(gè)視野計(jì)數(shù)五根并行無(wú)彎曲的動(dòng)靜脈周圍的出血點(diǎn)，取五個(gè)視野平均值為腸管出血點(diǎn)。(3)腸管組織學(xué)及組織化學(xué)LPS輸注72小時(shí)后，取2cm回腸組織在10%的福爾馬林中固定，組織樣品按常規(guī) 進(jìn)一步處理進(jìn)行HE染色。組化染色按照下列步驟進(jìn)行腸管組織切片入O.Olmol/L PBS搖 洗3次，每次10分鐘，入0.3% Triton-X-100液30min(37°C )，入3%過(guò)氧化氫20min(避 光)，血清封閉lh (室溫)，分別滴加1 100抗髓過(guò)氧化物酶、抗ICAM-1—抗50iU于各組 不同的切片上，置于室溫下lh，入4°C冰箱過(guò)夜。第二天復(fù)溫lh后入滴加ABC試劑盒中B、C 液50ul于對(duì)應(yīng)的切片上，室溫下各孵育lh，各步驟之間均入0. 01mol/L PBS搖洗3X10min，DAB顯色，常規(guī)梯度酒精脫水、二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，光鏡下觀察。應(yīng)用Imaging-Pro Plus軟件計(jì)算積分光密度來(lái)反映ICAM-1表達(dá)強(qiáng)度變化。應(yīng)用相同軟件隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)20倍 視野下MP0陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。3.統(tǒng)計(jì)方法所有數(shù)值均用均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示，生存率統(tǒng)計(jì)采用x2檢驗(yàn)。剩余資料采用AN0VA 分析及F-檢驗(yàn)，以P < 0. 05為顯著差異。在進(jìn)行MAP，HR，RR，RT監(jiān)測(cè)時(shí)，在0，24，48，72h， 正常對(duì)照組大鼠數(shù)目始終為18只，模型組分別為18只，15只，12只，6只，益氣復(fù)脈+LPS組 為18只，16只，15只，12只。進(jìn)行觀察腸管出血，HE染色及免疫組化染色時(shí)，正常對(duì)照組大 鼠數(shù)目為18只，模型組為6只，益氣復(fù)脈+LPS組為12只。二.實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.益氣復(fù)脈對(duì)內(nèi)毒素血癥大鼠存活率和休克的影響益氣復(fù)脈對(duì)內(nèi)毒素血癥大鼠存活率的影響如圖1所示。正常對(duì)照組在整個(gè)72小 時(shí)觀察過(guò)程中均存活，而模型組存活大鼠隨時(shí)間呈線性下降，72小時(shí)僅存活6只，存活率為 33%。益氣復(fù)脈前投入顯著減輕LPS導(dǎo)致的存活率的下降，48小時(shí)為89%，72小時(shí)為67%。益氣復(fù)脈前對(duì)內(nèi)毒素血癥大鼠MAP的影響如圖2A所示。正常對(duì)照組大鼠的MAP 在72小時(shí)觀察期間內(nèi)無(wú)明顯變化。模型組大鼠的MAP血壓在24小時(shí)開(kāi)始下降，72小時(shí)進(jìn) 一步加劇。益氣復(fù)脈前投入顯著抑制了 LPS引起的大鼠的MAP血壓在48小時(shí)和72小時(shí)的 下降。益氣復(fù)脈前對(duì)內(nèi)毒素血癥大鼠HR的影響如圖2B所示。正常對(duì)照組大鼠的HR在 72小時(shí)觀察期間內(nèi)中無(wú)明顯變化。LPS組的HR在24和48小時(shí)期間導(dǎo)增快，但是，在72小 時(shí)顯著減慢。而益氣復(fù)脈前投入可以顯著抑制LPS引起的48小時(shí)的增快和72小時(shí)的減慢。益氣復(fù)脈前對(duì)內(nèi)毒素血癥大鼠RR的影響如圖3A所示。正常對(duì)照組大鼠的RR在 72小時(shí)的觀察期間內(nèi)中無(wú)明顯變化。LPS組大鼠的RR在24小時(shí)顯著加快，并持續(xù)到72小 時(shí)觀察結(jié)束時(shí)。益氣復(fù)脈前投入可以顯著地抑制LPS引起的RR的加快。益氣復(fù)脈前對(duì)內(nèi)毒素血癥大鼠RT的影響如圖3B所示。正常對(duì)照組大鼠的RT在 72小時(shí)的觀察期間內(nèi)沒(méi)有顯化。LPS組大鼠的RT在24小時(shí)開(kāi)始升高，并持續(xù)到72小時(shí)觀 察結(jié)束。益氣復(fù)脈前投入對(duì)LPS引起的大鼠RT的增高沒(méi)有顯著的抑制作用。2.益氣復(fù)脈對(duì)內(nèi)毒素血癥大鼠腸管出血點(diǎn)的影響圖4表示益氣復(fù)脈對(duì)內(nèi)毒素血癥大鼠腸管出血點(diǎn)的影響。在觀察72小時(shí)后，正常 對(duì)照組大鼠的腸管幾乎看不到出血(圖4A1)，而LPS組大鼠的腸管微血管周圍可以觀察到 多個(gè)出血點(diǎn)(圖4A2)。益氣復(fù)脈前投入組大鼠腸管微血管周圍的出血點(diǎn)顯著減少(A3)。比 較每組大鼠腸管微血管周圍的出血點(diǎn)，結(jié)果如圖4B所示，益氣復(fù)脈可以顯著地抑制LPS引 起的大鼠腸管微血管周圍出血點(diǎn)的增加。3.益氣復(fù)脈對(duì)內(nèi)毒素血癥大鼠腸管組織學(xué)的影響與正常對(duì)照組相比(圖5A)，LPS輸注72小時(shí)后的大鼠腸絨毛出現(xiàn)明顯的水腫、糜 爛和脫落(圖5B)。益氣復(fù)脈明顯減輕了上述改變(圖5C)。72小時(shí)后對(duì)腸管免疫組化染色的結(jié)果顯示 正常對(duì)照組大鼠腸粘膜和黏膜下層幾 乎沒(méi)有觀察到血管內(nèi)皮細(xì)胞的ICAM-1表達(dá)(圖6A和D)，而LPS組大鼠腸粘膜和黏膜下層 的血管內(nèi)皮有明顯的ICAM-1表達(dá)(圖6B和E)。益氣復(fù)脈大鼠腸粘膜和黏膜下層的血管內(nèi)皮有的ICAM-1表達(dá)明顯減少(圖6C和F)。統(tǒng)計(jì)ICAM-1表達(dá)的結(jié)果如圖7所示，益氣復(fù)脈 可以顯著地抑制LPS引起的大鼠腸粘膜和黏膜下層的血管內(nèi)皮ICAM-1表達(dá)的增加。
益氣復(fù)脈對(duì)LPS引起的大鼠腸粘膜內(nèi)MP0陽(yáng)性細(xì)胞的影響如圖8所示。在LPS輸 注72小時(shí)后，大鼠腸粘膜內(nèi)MP0陽(yáng)性細(xì)胞顯著增加(圖8B)，表明白細(xì)胞已經(jīng)游出血管外， 浸潤(rùn)在腸粘膜內(nèi)。益氣復(fù)脈組的大鼠的腸粘膜內(nèi)MP0陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少(圖8C)。統(tǒng)計(jì) 結(jié)果顯示益氣復(fù)脈可以顯著地抑制LPS引起的大鼠腸粘膜內(nèi)MP0陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的增加(圖 9)。
權(quán)利要求
益氣復(fù)脈制劑在制備防治膿毒癥休克和/或腸管損傷的藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述益氣復(fù)脈制劑由紅參1-50重量份、 麥冬3-150重量份、五味子1. 5-75重量份制備而成，其制備方法為紅參采用乙醇提取，回 收乙醇，加水沉淀，除去上層油，水溶液過(guò)濾、濃縮，用真空干燥、噴霧干燥或凍干干燥法干 燥，得紅參提取物；麥冬、五味子用水提取，提取液濃縮后，醇沉一次或一次以上，第一次醇 沉?xí)r的含醇量為70-80%，二次及二次以上的含醇量均為80-99.9%，回收乙醇，將藥液濃 縮，再用真空干燥、噴霧干燥或冷凍干燥法干燥，得到麥冬、五味子提取物，再用不同的方法 制成粉針劑或注射劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于所述粉針劑的制備方法為，紅參用乙醇提 取，回收乙醇，加水沉淀，除去上層油，水溶液過(guò)濾、濃縮，用真空干燥、噴霧干燥或冷凍干燥 法干燥，得紅參提取物；麥冬、五味子用水提取，提取液濃縮后，醇沉一次或一次以上，第一 次醇沉?xí)r的含醇量為70-80%，二次及二次以上的含醇量均為80-99.9%，回收乙醇，將藥 液濃縮，再用真空干燥、噴霧干燥或冷凍干燥法干燥，得到麥冬、五味子提取物，所得提取物 溶解，過(guò)濾，加入葡甲胺及甘露醇，藥液過(guò)微孔濾膜后灌裝、凍干、加蓋、即得益氣復(fù)脈粉針 劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于所述注射劑的制備方法為，紅參用乙醇提 取，回收乙醇，加水沉淀，除去上層油，水溶液過(guò)濾、濃縮，用真空干燥、噴霧干燥或冷凍干燥 法干燥，得紅參提取物；麥冬、五味子用水提取，提取液濃縮后，醇沉一次或一次以上，第一 次醇沉?xí)r的含醇量為70-80%，二次及二次以上的含醇量均為80-99.9%，回收乙醇，將藥 液濃縮，再用真空干燥、噴霧干燥或冷凍干燥法干燥，得到麥冬、五味子提取物，所得提取物 溶解，過(guò)濾，藥液過(guò)微孔濾膜后灌封，即得益氣復(fù)脈注射劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述防治膿毒癥休克和/或腸管損傷是 防治由內(nèi)毒素引起的休克和/或腸管損傷。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于所述防治由內(nèi)毒素引起的休克是指，改善 內(nèi)毒素引起的動(dòng)物休克體征，降低的死亡數(shù)量。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于所述防治由內(nèi)毒素引起的腸管損傷是指， 減輕內(nèi)毒素引起的腸管出血和腸黏膜損傷、抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子ICMA-1的表達(dá)和 抑制白細(xì)胞的游出。
全文摘要
本發(fā)明涉及益氣復(fù)脈制劑在制備防治內(nèi)毒素引起的休克和腸管損傷的藥物中的用途，更具體地說(shuō)是一種注射用益氣復(fù)脈凍干粉針劑在制備防治內(nèi)毒素引起的休克和/或腸管損傷的藥物中的用途，屬于中藥領(lǐng)域。益氣復(fù)脈制劑在制備防治膿毒癥休克和/或腸管損傷的藥物中的用途。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是益氣復(fù)脈制劑可以內(nèi)毒素引起的休克；益氣復(fù)脈制劑可以降低內(nèi)毒素引起的死亡；益氣復(fù)脈制劑可以減輕內(nèi)毒素引起的動(dòng)物腸管損傷，減輕腸管出血；益氣復(fù)脈制劑可以抑制內(nèi)毒素引起的動(dòng)物腸管血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子ICMA-1的表達(dá)和抑制白細(xì)胞的游出。
文檔編號(hào)A61P7/08GK101926931SQ200910069420
公開(kāi)日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2009年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月24日
發(fā)明者原慶, 張淑文, 韓晶巖 申請(qǐng)人:天津天士力制藥股份有限公司