專利名稱：一種用于血友病b基因治療的腺病毒載體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種腺病毒載體，尤其是一種可以環(huán)化后整合入宿主基因組的用于治 療血友病B的腺病毒載體及其用途。
背景技術(shù)：
血友病B是X性染色體連鎖的遺傳性出血性疾病，其病因?yàn)槟蜃覫X(FIX)基 因缺陷所致，主要臨床表現(xiàn)為反復(fù)的自發(fā)性軟組織及大關(guān)節(jié)出血，反復(fù)的關(guān)節(jié)出血可導(dǎo)致 退行性血友病關(guān)節(jié)病，嚴(yán)重的可以致畸致殘，血友病B患者出血的嚴(yán)重程度與循環(huán)中FIX的 水平相關(guān)。目前預(yù)防性因子替代療法已經(jīng)大大降低了出血發(fā)生的頻率以及血友病性關(guān)節(jié)疾 病的發(fā)生，并提高了血友病患者的生存期和生活質(zhì)量，但是患者仍存在致命性出血和慢性 關(guān)節(jié)損傷的風(fēng)險(xiǎn)。此外純化FIX價(jià)格昂貴，在發(fā)展中國(guó)家絕大多數(shù)患者不可能實(shí)施終生的 預(yù)防性治療。盡管重組FIX因子可以使患者免于輸注血漿濃縮FIX導(dǎo)致的傳染性疾病，但 大多數(shù)發(fā)展中國(guó)家的患者仍使用血漿來(lái)源的FIX，仍然有感染傳染性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。然而血友病B本身的特點(diǎn)為基因治療提供了非常有利的條件①其臨床表現(xiàn)完全 是因單一特異的基因產(chǎn)物FIX缺乏造成的，F(xiàn)IX以微量在血漿中循環(huán)；②FIX基因編碼序列 相對(duì)較短(約1. 5kb)，這使其容易包裝并易于載體轉(zhuǎn)染到靶細(xì)胞；③FIX半衰期相對(duì)較長(zhǎng) (大約20小時(shí))；④功能性的FIX表達(dá)不需要特定的組織器官；⑤最重要的是，血漿FIX水 平不需要嚴(yán)格的調(diào)控，其血漿水平的輕度升高(生理水平的5%)即可顯著改善患者的出 血癥狀。所以，基因治療作為血友病B的治療手段前景十分看好。目前血友病B的基因治 療主要使用病毒或非病毒載體把hFIX (human FIX)基因轉(zhuǎn)染到靶細(xì)胞。病毒載體包括腺病 毒、腺相關(guān)病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒。腺病毒載體是在基因治療、基因免疫等方面應(yīng)用開發(fā)得較早 的一種基因載體，在美國(guó)近三分之一的基因治療臨床試驗(yàn)中采用腺病毒載體。腺病毒載體 的容量大，安全性高，在體外穩(wěn)定，易于制備與純化，既可感染分裂細(xì)胞，又可感染非分裂細(xì) 胞并以較高水平表達(dá)外源基因。腺病毒載體的不足之處在不能整合到宿主染色體上，所以 不能持續(xù)表達(dá)所需產(chǎn)物，表達(dá)時(shí)間短暫，需重復(fù)給予載體制劑治療，但這樣又能刺激免疫反 應(yīng)，使反復(fù)治療的效果會(huì)逐漸降低。腺相關(guān)病毒為基礎(chǔ)構(gòu)建基因轉(zhuǎn)移載體的優(yōu)點(diǎn)是安全穩(wěn) 定，感染宿主細(xì)胞廣泛并能特異整合于人的第19號(hào)染色體長(zhǎng)臂末端，減少了插入突變的可 能性，但是它難以大量生產(chǎn)，復(fù)制需要輔助病毒，并且包裝外源基因的能力有限，小于5kb， 因此腺相關(guān)病毒的利用受到一定限制。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能使外源基因完全整合到宿主細(xì)胞 染色體上，但也有明顯的不足，主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面1)不能感染非分裂的細(xì)胞；2)可 能產(chǎn)生具有復(fù)制能力的病毒；3)由于是隨機(jī)整合，可能會(huì)引起“插入誘變”，誘導(dǎo)腫瘤的發(fā) 生。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)單純腺病毒的短效性，逆轉(zhuǎn)錄病毒的不安全 性，腺相關(guān)病毒的包裝復(fù)雜性，提供一種定點(diǎn)整合入宿主基因組的安全的用于血友病B基因治療的腺病毒載體及其用途。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種用于血友病B基因治療 的腺病毒載體，該載體能同時(shí)表達(dá)hFIX與紅色熒光蛋白；在hFIX與紅色熒光蛋白串聯(lián)基因 表達(dá)框兩側(cè)各有一個(gè)方向相同的Cre整合酶作用位點(diǎn)Ioxp位點(diǎn)，在表達(dá)框內(nèi)部有位點(diǎn)特異 性整合酶PhiC31的作用位點(diǎn)attB。在其中一個(gè)Loxp位點(diǎn)與目的基因啟動(dòng)子之間存在一個(gè)attB位點(diǎn)，使其能在 Phic31整合酶存在的情況被整合到宿主基因組中。所述目的基因表達(dá)框5，端的Ioxp與attB相鄰，形成Ioxpattb片段。能表達(dá)紅色熒光蛋白，能作為腺病毒包裝時(shí)的示蹤蛋白，并且與傳統(tǒng)綠色熒光蛋 白的腺病毒載體相區(qū)分，當(dāng)兩種腺病毒共同作用與宿主細(xì)胞能進(jìn)行區(qū)分與示蹤。能表達(dá)人凝血因子FIX。所述的腺病毒載體或其體外包裝的腺病毒顆粒在治療血友病B藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果得到由紅色熒光蛋白標(biāo)記的DNA可以環(huán)化的重組腺病毒載 體，并為該載體進(jìn)一步經(jīng)由attb序列整合入宿主基因組中發(fā)揮持久治療血友病B打下基 石出。


圖1載體A中的Ioxp序列。圖 2 載體 C 經(jīng) BamHI 和 BstXI 雙酶切鑒定(1 :DL2000Marker ；2 載體 C BamHI+BstXI)。圖3載體E中Ioxpattb片段測(cè)序圖。圖4載體Bgl II和SacI凝膠電泳分析(1 :DL2000marker ；2載體B Bglll+BamHI)。圖 5 含有 loxpattb-CMV-hFIX-PA-CMV-DsRed-PA-loxp 的穿梭質(zhì)粒載體 E 經(jīng) Sal I 與 Not I 雙酶切鑒定(1 載體 E Sal I+Not I 2 λ HindIIImarker)。圖6穿梭質(zhì)粒載體E中各主要部分的PCR鑒定(1 :DL2000marker ；2 =DsRed產(chǎn)物； 3 =PA-CMV 產(chǎn)物；4 :hFIX 產(chǎn)物)。圖7穿梭質(zhì)粒載體E的構(gòu)建示意圖。圖8pAd-attb-hFIX_DsRed(Ioxp)的凝膠電泳分析(1、2 兩個(gè)克隆的Pac I酶切 產(chǎn)物；3 λ HindIII marker)。圖 9pAd-attb-hFIX_DsRed (Ioxp)中主要組分的 PCR 鑒定(1 :DsRed 產(chǎn)物；2 PA-CMV 產(chǎn)物；3 :hFIX 產(chǎn)物；4 :DL2000marker)。圖 10pAd-attb-hFIX-DsRed (Ioxp)體外轉(zhuǎn)染 293A 后 24h,用 trizol 一步法 提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄，用PCR的方法對(duì)hFIX的基因表達(dá)進(jìn)行鑒定(1 以水代替模板陰性 對(duì)照；2 轉(zhuǎn)染 pAdtrack 的 293A ；3 轉(zhuǎn)染 pAd-attb-hFIX-DsRed (Ioxp)的 293A ；4 以 pAd-attb-hFIX-DsRed(Ioxp)質(zhì)粒為模板的陽(yáng)性對(duì)照；5 :DL2000marker)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明用于血友病B基因治療的腺病毒載體，該載體能同時(shí)表達(dá)hFIX與紅色熒光 蛋白；在hFIX與紅色熒光蛋白串聯(lián)基因表達(dá)框兩側(cè)各有一個(gè)方向相同的Cre整合酶作用位點(diǎn)Ioxp位點(diǎn)，在表達(dá)框內(nèi)部有位點(diǎn)特異性整合酶PhiC31的作用位點(diǎn)attB。在其中一個(gè)Loxp位點(diǎn)與目的基因啟動(dòng)子之間存在一個(gè)attB位點(diǎn)，使其能在 Phic31整合酶存在的情況被整合到宿主基因組中。所述目的基因表達(dá)框5，端的Ioxp與attB相鄰，形成Ioxpattb片段。能表達(dá)紅色熒光蛋白，能作為腺病毒包裝時(shí)的示蹤蛋白，并且與傳統(tǒng)綠色熒光蛋 白的腺病毒載體相區(qū)分，當(dāng)兩種腺病毒共同作用與宿主細(xì)胞能進(jìn)行區(qū)分與示蹤。能表達(dá)人凝血因子FIX。所述的腺病毒載體或其體外包裝的腺病毒顆粒在治療血友病B藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)一系列的載體構(gòu)建過(guò)程，提供一種由紅色熒光蛋白為標(biāo)記物，表達(dá)人 凝血因子IX的腺病毒載體，表達(dá)框兩側(cè)存在可以被重組酶Cre環(huán)化的兩個(gè)方向相同的Ioxp 位點(diǎn)，內(nèi)部加入一個(gè)可以被位點(diǎn)特異性整合酶phiC31識(shí)別的attB位點(diǎn)。(1)用重疊PCR的方法，從pIRES2-EGFP載體中擴(kuò)增出加A尾信號(hào)PA，在其3’端引 入一個(gè)Ioxp序列，并插入載體pShuttle中，酶切位點(diǎn)為KpnI和NotI，其中PA是加polyA 尾的信號(hào)，形成載體A ；(2)從h FIX-pIRES2-EGFP中擴(kuò)增出啟動(dòng)子CMV，插入該載體原啟動(dòng)子與h FIX編 碼序列之間的Bgl II與Sac I位點(diǎn)，CMV是最常用的基因啟動(dòng)子，形成載體B; (3)改造pIRES2-EGFP載體，用PA-CMV替代IRES2序列，酶切位點(diǎn)為BamHI和 BstXI，新載體命名為載體C;(4)從pDsRed2-Cl中克隆出紅色熒光蛋白編碼序列，替換載體A中的綠色熒光蛋 白編碼序列，酶切位點(diǎn)為NotI，構(gòu)成載體D ；(5)以載體A為模板，利用重疊PCR的方法，擴(kuò)增出Loxp序列，并在其后面加入 attb 序列，形成 Ioxpattb 片段 ATA ACT TCG TAT AGC ATA CATTAT ACG AAG TTA TGG TGC CAG GGC GTG CCC TTG GGC TCC CCG GGC GCG插入到載體D 的 AseI 與 Bgl II 位點(diǎn)，形成載 體E ；(6)載體B經(jīng)由Bgl II與BamH雙酶切，切下其中的CMV-hFIX片段，連入載體E中 的Bgl II與BamH兩酶切位點(diǎn)之間，新載體命名為載體F ；(7)載體F 經(jīng)由 Sal I 和 Not I 雙酶切，切下 loxpattb-CMV-hFIX-PA-CMV-DsRed， 連入載體A的相應(yīng)酶切位點(diǎn)中，最終構(gòu)成載體G，該載體成為一個(gè)有紅色熒光蛋白標(biāo)記的， 可以表達(dá)hFIX的腺病毒載體系統(tǒng)的穿梭載體，此二蛋白表達(dá)框兩端由方向相同的Ioxp環(huán) 繞，其中還包含attb位點(diǎn)；(8)將載體G與骨架載體共轉(zhuǎn)染至BJ5183細(xì)菌內(nèi)，通過(guò)細(xì)菌內(nèi)同源重組得到重組 載體。(9)該重組腺病毒載體體外轉(zhuǎn)染293A后，在熒光顯微鏡下可見表達(dá)紅色熒光蛋白 的細(xì)胞，用hFIX的特異檢測(cè)引物，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄PCR的方法可以檢測(cè)出hFIX的表達(dá)。下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明一、一個(gè)Ioxp位點(diǎn)的引入Loxp 是一個(gè) 34bp 的序列，為 ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT。我們利用 重疊PCR的方法，將該序列引入加A尾信號(hào)的3’端，形成PA-Ioxp片段，插入腺病毒穿梭質(zhì) 粒pShuttle中，得到載體A。具體方法如下
1、利用重疊PCR的方法擴(kuò)增出PA-Ioxp片段。引物序列為PAloxp 1 =ATT gCg gCC gCg ACT CTA gAT CAT AAT C, PAloxp2 :TAA TgT ATg CTA TACgAA gTT ATT TAA gAT ACA TTg ATg AgT Τ, PAloxp3 :CAC ggT ACC ATA ACTTCg TAT AAT gTA TgC TAT ACg AAg TT0 劃線部分分別為NotI和KpnI的酶切位點(diǎn)。反應(yīng)條件以載體PIRES2-EGFP為模板，以上述 PAloxpl和ΡΑ1οχρ2為引物，進(jìn)行第一次PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出PA序列。采用IOOyL體系，具體
如下IOXPCR Buffer (含 Mg2+L 5mM) 10 μ L4 X dNTP (1 OmM/mL)8 μ LPAloxpl4μ LΡΑ1οχρ24 μ L模板4 μ LPyrobest DNA 聚合酶0· 6 μ L_滅菌去離子水補(bǔ)足到100 μ L反應(yīng)條件為94°C變性 5minute ；94°C變性 30seconds，60°C退火 30seconds, 72°C延 伸Iminute ；72°C延伸7minute，共25個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用Takara的小片段DNA回收試劑 盒回收后，用此回收產(chǎn)物作為模板，用PAloxpl和ΡΑ1οχρ3引物再次擴(kuò)增，方法同上，得到的 PCR產(chǎn)物再次膠回收即為PAloxp片段。2、將片段PAloxp插入pShuttle，形成載體A。pShuttle載體為本室保存。將 PShuttle載體及上述PAloxp片段分別用NotI和KpnI雙酶切，分別膠回收后用Takara T4 連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，連接反應(yīng)按試劑盒要求進(jìn)行。取連接產(chǎn)物5ul，轉(zhuǎn)化以氯化鈣方法制 備的大腸桿菌(DH5 α)感受態(tài)，將感受態(tài)細(xì)菌涂布于含有卡那霉素的固體LB平板上。12小 時(shí)后挑取單菌落并送測(cè)序公司測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果及酶切鑒定(見圖1)均證實(shí)，34bp的 Ioxp及PA序列被成功的引入了 pShuttle載體。二、含Ioxpattb序列載體的構(gòu)建1、可獨(dú)立表達(dá)紅色熒光蛋白的載體的構(gòu)建首先，利用PCR的方法，以 pAdtrack-CMV (本室保存)為模板，將PAPCMV序列克隆到載體pIRES2_EGFP中，替換其中的 IRES2片段。引物分別為PAPCMV1 =ATA rrATCC Tgg AgT TCg TgA CCg CC gCCg g,PAPCMV2 ATA ￡^_Ig^JI^JggCCggTAgCgCTAgCggATCTg，劃線部分分別為 BamHI 和 BstXI 的酶切位 點(diǎn)。將回收后的PCR產(chǎn)物及pIRES2-EGFP載體分別用BamHI和BstXI雙酶切，分別膠回收 后用Takara T4連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，連接反應(yīng)按試劑盒要求進(jìn)行。取連接產(chǎn)物5ul，轉(zhuǎn)化 以氯化鈣方法制備的大腸桿菌(DH5ci)感受態(tài)，將感受態(tài)細(xì)菌涂布于含有卡那霉素的固體 LB平板上。12小時(shí)后挑取單菌落并送測(cè)序公司測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果及酶切鑒定(見圖2) 均證實(shí)載體構(gòu)建成功，如前所述，此載體命名為載體C。然后，將該載體中綠色熒光蛋白編 碼部分替換為紅色熒光蛋白編碼序列?？寺∫锓謩e為DsRedl =CgC CAC CATggC CTC CTC CgA gAA C，DsRed2 =ATA rCr rCC rCC TAC Agg AAC Agg TggTgg Cgg，下劃線部分為 NotI 的酶切位點(diǎn)，模板為pDsRed2-Cl (本室保存)。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后經(jīng)NotI單酶切，回收后 備用。載體C先經(jīng)BstXI單酶切，回收后用Takara公司的T4DNA聚合酶按說(shuō)明書要求將粘 末端削平，在經(jīng)NotI但酶切，回收后與上述處理的DsRed片段進(jìn)行連接。取連接產(chǎn)物5ul，轉(zhuǎn)化以氯化鈣方法制備的大腸桿菌(DH5ci)感受態(tài)，將感受態(tài)細(xì)菌涂布于含有卡那霉素的 固體LB平板上。12小時(shí)后挑取單菌落并送測(cè)序公司測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果證實(shí)載體D構(gòu)建 成功。2、Ioxpattb的合成并插入載體利用重疊PCR的方法合成Ioxpattb片段。引物 序列為 loxpattbl =CgC ATT AAT gTC gAC gTC CAA ACT CAT CAATgT ATC Τ, loxpattb2 Mg ggC ACg CCC Tgg CAC CAT AAC TTC gTA TAATgT ATg C, loxpattb3 :ACA AgA TCT CgC gCC Cgg ggA gCC CAA ggg CACgCC CTg gCA CC0 劃線部分分別為 Asel，Sail 和 BglII 的 酶切位點(diǎn)。反應(yīng)條件以載體A為模板，以上述loxpattbl和loXpattb2為引物，進(jìn)行第 一次PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出Ioxp及部分attb序列。反應(yīng)條件為94°C變性5minute ；94°C變性 30seconds，60°C退火 30seconds，72°C延伸 Iminute ；72°C延伸 7minute，共 25 個(gè)循環(huán)。PCR 產(chǎn)物用Takara的小片段DNA回收試劑盒回收后，用此回收產(chǎn)物作為模板，用loxpattbl和 loxpattb3引物再次擴(kuò)增，方法同上，得到的PCR產(chǎn)物再次膠回收即為Ioxpattb片段ATA ACTTCG TAT AGC ATA CAT TAT ACG AAG TTA TGG TGC CAG GGC GTG CCC TTG GGC TCC CCG GGCGCG0載體D與Ioxpattb分別用AseI與Bgl II雙酶切，分別膠回收后用TakaraT4連 接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。取連接產(chǎn)物5ul，轉(zhuǎn)化以氯化鈣方法制備的大腸桿菌(DH5ci)感受態(tài)， 將感受態(tài)細(xì)菌涂布于含有卡那霉素的固體LB平板上。12小時(shí)后挑取單菌落并送測(cè)序公司 測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果(見圖3)證實(shí)，Ioxpattb片段成功插入載體D，并替換多克隆位點(diǎn)前 的CMV啟動(dòng)子形成載體E。三、穿梭腺病毒載體的構(gòu)建1、CMV驅(qū)動(dòng)的hFIX編碼序列的引入。為了將CMV驅(qū)動(dòng)的hFIX編碼序列加入載體 E的Bgl II和BamHI兩酶切位點(diǎn)之間，我們先將帶有Bgl II酶切位點(diǎn)的CMV啟動(dòng)子序列插 到 hFIX-pIRES2-EGFP (本室構(gòu)建)hFIX 之前?？寺?CMV 的引物為 CMVl =ACg ArA TCT CgA CTC gAg TAg TTA TTA ATA gTA ATCAAT TAC g, CMV2 :ACC rAr CTC ggA TCT gAC ggT TCA CTA AAC CAg C，劃線部分為Bgl II和SacI酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增片段與載體hFIX_pIRES2_EGFP 分別用Bgl II和SacI雙酶切，純化后連接。取連接產(chǎn)物5ul，轉(zhuǎn)化以氯化鈣方法制備的大 腸桿菌(DH5 α)感受態(tài)，將感受態(tài)細(xì)菌涂布于含有卡那霉素的固體LB平板上。12小時(shí)后挑 取單菌落用上述兩種酶切鑒定(見圖4)，載體B構(gòu)建成功。載體B經(jīng)Bgl II及BamHI雙酶 切，切下CMV-hFIX片段，與載體E相應(yīng)酶切后的載體片段連接，轉(zhuǎn)化，篩選，挑取單克隆進(jìn)行 酶切鑒定，證明載體F構(gòu)建成功。2、載體F與上述插入PA-Ioxp的腺病毒穿梭載體A分別用Sal I與NotI雙酶切， 將載體F中的loxpattb-CMV-hFIX-PA-CMV-DsRed切下，連入載體A片段中，連接，轉(zhuǎn)化，篩 選，挑取單克隆，提取質(zhì)粒用Sal I與Not I雙酶切鑒定及PCR鑒定(見圖5及圖6)證實(shí) 載體G既為目的穿梭質(zhì)粒，構(gòu)建成功，示意圖見圖7，可下一步重組構(gòu)建腺病毒載體。四、重組腺病毒載體的構(gòu)建1、載體G質(zhì)粒經(jīng)PmeI酶線性化載體G2 μ gPmeIIUIOXNEB buffer4 5μ L100 X BSA0. 5 μ L
_補(bǔ)足去離子水至總體積50 μ L，37°C水浴4小時(shí)，95度水浴10分鐘，Takara膠回 收試劑盒純化回收。2、線性化質(zhì)粒的去磷酸化線性化的載體GIUg10XCIAP buffer 5μ LCTAPIU_補(bǔ)足去離子水至總體積50 μ L，37°C水浴4小時(shí)，65度水浴30分鐘滅活CIAP，博大
泰克小量膠回收試劑盒濃縮回收。3、BJ5183 pAdEasier_l氯化鈣法感受態(tài)細(xì)胞的制備E. coli BJ5183甘油菌復(fù)蘇，常規(guī)氯化鈣方法制備BJ5183感受態(tài)細(xì)胞。取IyL pAdEasier-Ι質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，鋪鏈霉素/氨芐青霉素雙抗性LB平板(濃度均 為50g/mL)，置37°C孵箱培養(yǎng)。12_16h后，挑取數(shù)個(gè)克隆，接種于鏈霉素/氨芐青霉素雙抗 性LB培養(yǎng)基，37°C振蕩過(guò)夜。次日晨收菌，將含有pAdEasier-Ι質(zhì)粒的BJ5183菌按照常規(guī) 氯化鈣的方法制備BJ5183pAdEasier-l感受態(tài)細(xì)胞。4、細(xì)菌內(nèi)同源重組及鑒定以回收的CIAP處理的線性化載體G質(zhì)粒轉(zhuǎn)化常規(guī)氯化鈣方法制備的 BJ5183pAdEasier-l感受態(tài)細(xì)胞，鋪卡那霉素抗性的LB平板，37°C孵箱倒置培養(yǎng)14 16小 時(shí)。挑選數(shù)個(gè)體積最小的卡那霉素抗性菌落，接種于3mL含有50 μ g/mL卡那霉素的LB培 養(yǎng)基內(nèi)，37 °C中速振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。用博大泰克質(zhì)粒抽提試劑盒小量抽提質(zhì)粒DNA，0. 8 %瓊脂 糖凝膠電泳根據(jù)質(zhì)粒大小初步鑒定。選取近40Kb大小的質(zhì)粒，用PCR及PacI酶切的方法 鑒定重組子。PacI酶切反應(yīng)條件如下候選質(zhì)粒1 μ gPacIIU10XNEB buffer 15 μ L100 X BSA0. 5 μ L_補(bǔ)足去離子水至總體積50μ L，37°C水浴4小時(shí)，0. 8%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切 結(jié)果。正確的重組子命名為pAd-attb-hFIX-DsRed(Ioxp)(見圖8)。此外還用PCR的方法 對(duì)其中的DsRed, PA-CMV, hFIX進(jìn)行了鑒定(見圖9)。四、pAd-attb-hFIX-DsRed (Ioxp)載體在體外表達(dá)紅色熒光蛋白及phFIX將構(gòu)建好的pAd-attb-hFIX-DsRed (Ioxp)及陰性對(duì)照載體pAdtrack-CMV采用脂 質(zhì)體Lipofectamine2000 (Invitrogen公司)方法分別轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞系，24小時(shí)后，在熒 光顯微鏡下觀察，可見表達(dá)紅色熒光蛋白的細(xì)胞；分別收集pAd-attb-hFIX-DsRed (Ioxp) 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞，以Iml Trizol (Invitrogen公司)裂解細(xì)胞后，通過(guò)氯仿，異丙醇 抽提得到RNA，經(jīng)過(guò)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度，取2ugRNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega 公司)將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，hFIX的特異檢測(cè)引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR產(chǎn)物
8進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，可見pAd-attb-hFIX-DsRed (Ioxp)轉(zhuǎn)然的細(xì)胞有hFIX的表達(dá)(見圖 10)。本發(fā)明中的腺病毒載體除其自身的優(yōu)點(diǎn)外，能夠整合到宿主基因組，且安全性比 逆轉(zhuǎn)錄載體高，兼有上述三種載體的優(yōu)點(diǎn)，又能克服它們的不足。Loxp是重組酶Cre的識(shí)別位點(diǎn)。如果兩個(gè)LoxP位點(diǎn)位于一條DNA鏈上，且方向 相同，Cre重組酶能將兩個(gè)LoxP位點(diǎn)間的序列以環(huán)化的形式切出。attB原是細(xì)菌基因組中 的附著點(diǎn)。鏈霉菌cpC31噬菌體整合酶((pC31-int)是一種位點(diǎn)特異性重組酶，該酶能識(shí)別 噬菌體附著位點(diǎn)(attp)和宿主基因組上的attB，介導(dǎo)二者同源序列之間的位點(diǎn)特異性重 組。在人或小鼠細(xì)胞中表達(dá)的cpC31-int能夠識(shí)別基因組中的假attp位點(diǎn)(pseudo-attp) 和外源載體中的attB位點(diǎn)，將環(huán)形的帶有目的片段的載體位點(diǎn)特異性的整合到基因組中。 cpC31位點(diǎn)特異性整合酶系統(tǒng)在完成有效的基因轉(zhuǎn)移過(guò)程中安全性高，由于是定點(diǎn)整合而 非隨機(jī)整合，引起畸形、癌變的機(jī)率幾乎為零，而且pseudo-attP位點(diǎn)周圍不存在功能基 因，重組不會(huì)引起新的變異，也不影響外源基因的表達(dá)。綜上所述，本發(fā)明的內(nèi)容并不局限在上述的實(shí)施例中，相同領(lǐng)域內(nèi)的有識(shí)之士可 以在本發(fā)明的技術(shù)指導(dǎo)思想之內(nèi)可以輕易提出其他的實(shí)施例，但這種實(shí)施例都包括在本發(fā) 明的范圍之內(nèi)。
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權(quán)利要求
一種用于血友病B基因治療的腺病毒載體，其特征在于，該載體能同時(shí)表達(dá)hFIX與紅色熒光蛋白；在hFIX與紅色熒光蛋白串聯(lián)基因表達(dá)框兩側(cè)各有一個(gè)方向相同的Cre整合酶作用位點(diǎn)loxp位點(diǎn)，在表達(dá)框內(nèi)部有位點(diǎn)特異性整合酶PhiC31的作用位點(diǎn)attB。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于血友病B基因治療的腺病毒載體，其特征在于，在其中一 個(gè)Loxp位點(diǎn)與目的基因啟動(dòng)子之間存在一個(gè)attB位點(diǎn)，使其能在Phic31整合酶存在的情 況被整合到宿主基因組中。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于血友病B基因治療的腺病毒載體，其特征在于，所述目的 基因表達(dá)框5，端的Ioxp與attB相鄰，形成Ioxpattb片段。
4.根據(jù)權(quán)利1所述的用于血友病B基因治療的腺病毒載體，其特征在于，能表達(dá)紅色熒 光蛋白，能作為腺病毒包裝時(shí)的示蹤蛋白，并且與傳統(tǒng)綠色熒光蛋白的腺病毒載體相區(qū)分， 當(dāng)兩種腺病毒共同作用與宿主細(xì)胞能進(jìn)行區(qū)分與示蹤。
5.根據(jù)權(quán)利1所述的腺病毒載體，其特征在于，能表達(dá)人凝血因子FIX。
6.根據(jù)權(quán)利要求3、4、5中任一項(xiàng)所述的腺病毒載體或其體外包裝的腺病毒顆粒在治 療血友病B藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于血友病B基因治療的腺病毒載體及其用途，該載體能同時(shí)表達(dá)hFIX與紅色熒光蛋白；在hFIX與紅色熒光蛋白串聯(lián)基因表達(dá)框兩側(cè)各有一個(gè)方向相同的Cre整合酶作用位點(diǎn)loxp位點(diǎn)，在表達(dá)框內(nèi)部有位點(diǎn)特異性整合酶PhiC31的作用位點(diǎn)attB。本發(fā)明得到由紅色熒光蛋白標(biāo)記的DNA可以環(huán)化的重組腺病毒載體，并為該載體進(jìn)一步經(jīng)由attb序列整合入宿主基因組中發(fā)揮持久治療血友病B打下基礎(chǔ)。所述的腺病毒載體或其體外包裝的腺病毒顆粒在治療血友病B藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P7/04GK101935674SQ20091006951
公開日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2009年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月30日
發(fā)明者張磊, 杜偉廷, 楊仁池, 薛峰, 顧東生 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所