專利名稱：：一種中藥組合物在制備促進(jìn)一氧化氮生成藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種中藥組合物的新用途，具體地，本發(fā)明涉及一種中藥組合物在制備促進(jìn)一氧化氮生成藥物中的應(yīng)用，屬中藥應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：急性心肌梗死(AcuteMyocardialInfarction，AMI)發(fā)病兇險(xiǎn)，病死率高，危害大。因而冠脈再通治療(溶栓或急診冠脈介入)盡快使堵塞的冠脈再通，恢復(fù)心肌有效再灌注，也已成為最重要的目標(biāo)和評(píng)價(jià)指標(biāo)。然而AMI冠脈再通后仍存在以下問(wèn)題使心肌完全收益1、無(wú)再流或慢血流現(xiàn)象，即冠脈雖已開通(無(wú)機(jī)械堵塞)，心肌并未恢復(fù)有效的再灌注而表現(xiàn)為慢血流或無(wú)血流。其結(jié)果心肌徹底壞死、梗死范圍擴(kuò)大，心室擴(kuò)張和重構(gòu)、心功能低下和心力衰竭、以及惡性心律失常等嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生率增高，住院病死率增加5-10倍；2、心肌缺血再灌注損傷，即缺血心肌在恢復(fù)血流再灌注后，反而加重其結(jié)構(gòu)破壞，引起細(xì)胞死亡，導(dǎo)致梗死范圍擴(kuò)大，造成心功能的進(jìn)一步損害，并影響AMI患者的預(yù)后。NO可以調(diào)節(jié)血管張力、抑制血小板和白細(xì)胞的聚集、粘附、減少氧化應(yīng)激反應(yīng)并保護(hù)血管結(jié)構(gòu)完整性。已有研究表明急性心肌梗死再灌注后不論是增加外源性還是內(nèi)源性NO都能夠減少缺血再灌注損傷并減少白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附。一些已知可以保護(hù)內(nèi)皮功能如他汀類藥物、內(nèi)皮素受體拮抗劑和脂聯(lián)素等，都可以減少缺血再灌注損傷而且作用機(jī)制都與NO的生成有關(guān)。本發(fā)明是在第01131203.3號(hào)和第200410048292.2號(hào)專利的基礎(chǔ)上進(jìn)行的改進(jìn)發(fā)明，在此全文引用該兩專利文件記載的內(nèi)容。上述兩項(xiàng)專利未公開該中藥組合物在制備促進(jìn)一氧化氮生成藥物中的應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種中藥組合物在制備促進(jìn)一氧化氮生成藥物中的應(yīng)用；優(yōu)選地，本發(fā)明提供了該中藥組合物在制備減輕心肌缺血再灌注損傷的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明應(yīng)用所述中藥組合物含全蝎、水蛭、蜈蚣、土鱉蟲、蟬蛻五種蟲類藥，加上人參、冰片、赤芍等，具有補(bǔ)氣、活血、化瘀、驅(qū)風(fēng)、通絡(luò)等功能，使經(jīng)絡(luò)氣血得以運(yùn)行，經(jīng)脈得以濡養(yǎng)，寒氣得以祛除，正氣得以恢復(fù)，可以有效促進(jìn)NO生成，減輕心肌缺血再灌注損傷。所述中藥組合物由如下重量份的原料藥制成人參3-10水蛭3-11土鱉蟲5-10乳香(制)1_5赤芍3_9降香1-5檀香1-5全蝎3-9蟬蛻3-12蜈蚣1-3冰片1-7酸棗仁(炒)3-10；優(yōu)選地，該中藥組合物由如下重量份的原料藥制成人參6水蛭10土鱉蟲7乳香(制)2赤芍5降香2檀香2全蝎7蟬蛻7蜈蚣1冰片5酸棗仁(炒)5；或人參10水蛭8土鱉蟲7乳香(制)2赤芍5降香2檀香2全蝎9蟬蛻7蜈蚣1冰片5酸棗仁(炒)5；或人參6水蛭11土鱉蟲7乳香(制)2赤芍5降香2檀香2全蝎3蟬蛻7蜈蚣1冰片5酸棗仁(炒)5；上述中藥組合物的活性成分由下列成分組成a平均粒徑小于100μm的全蝎、水蛭、蜈蚣、土鱉蟲、蟬蛻及制乳香藥粉；b冰片藥粉；c由降香和檀香提取的揮發(fā)油；d人參用乙醇提取后的醇提液經(jīng)濃縮后的醇提浸膏；e提取成分c后的降香和檀香藥渣的水提液、赤芍和炒酸棗仁加水煎煮后的水提液以及提取成分d后的人參藥渣的水提液過(guò)濾、混勻后濃縮成的水提浸膏。本發(fā)明中藥組合物中，作為活性組分的原料藥的拉丁名及其加工方法來(lái)自《中藥大辭典》(1977年7月，第一版，上?？茖W(xué)技術(shù)出版社)和《中國(guó)藥典》(2005年版，化學(xué)工業(yè)出版社)。本發(fā)明應(yīng)用還公開了上述中藥組合物的制劑劑型為膠囊劑、片劑、顆粒劑、散劑、口服液或丸劑。為使上述劑型能夠?qū)崿F(xiàn)，需在制備這些劑型時(shí)加入藥學(xué)可接受的輔料，例如填充齊IJ、崩解劑、潤(rùn)滑劑、助懸劑、粘合劑、甜味劑、矯味劑、防腐劑、基質(zhì)等。填充劑包括淀粉、預(yù)膠化淀粉、乳糖、甘露醇、甲殼素、微晶纖維素、蔗糖等；崩解劑包括淀粉、預(yù)膠化淀粉、微晶纖維素、羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、低取代羥丙纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉等；潤(rùn)滑劑包括硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉、滑石粉、二氧化硅等；助懸劑包括聚乙烯吡咯烷酮、微晶纖維素、蔗糖、瓊脂、羥丙基甲基纖維素等；粘合劑包括，淀粉漿、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素等；甜味劑包括糖精鈉、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矯味劑包括甜味劑及各種香精；防腐劑包括尼泊金類、苯甲酸、苯甲酸鈉、山梨酸及其鹽類、苯扎溴銨、醋酸氯乙定、桉葉油等；基質(zhì)包括PEG6000，PEG4000，蟲蠟等。本發(fā)明應(yīng)用所述中藥組合物的膠囊劑優(yōu)選通過(guò)以下制備方法制成將上述配比的水蛭、全蝎、蟬蛻、土鱉蟲、蜈蚣等五味藥洗凈，低溫烘干，備用；檀香、降香提取揮發(fā)油，藥渣及水溶液備用；人參用70%乙醇加熱回流提取二次，第一次3小時(shí)，第二次2小時(shí)，合并提取液，回收乙醇至無(wú)醇味；人參藥渣與檀香、降香的藥渣以水溶液合并，加入赤芍、酸棗仁(炒)，加水煎煮二次，第一次3小時(shí)，第二次2小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.20-1.25(60°C)的清膏，加入上述人參醇提液，混勻，低溫干燥，粉碎成細(xì)粉；乳香(制)與水蛭等五味共粉碎成細(xì)粉；冰片研細(xì)，分別與上述細(xì)粉配研，混勻，噴入揮發(fā)油，混勻，裝入膠囊，即得?；蛘?，本發(fā)明應(yīng)用所述膠囊劑優(yōu)選通過(guò)以下制備方法制成a)原料藥的重量比為人參3-10份、水蛭3-11份、土鱉蟲5-10份、制乳香1-5份、赤芍3-9份、降香1-5份、檀香1-5份、全蝎3-9份、蟬蛻3_12份、蜈蚣1_3份、冰片1_7份、炒酸棗仁3-10份；b)藥材粉碎工藝將全蝎、水蛭、蜈蚣、土鱉蟲和蟬蛻五種蟲藥經(jīng)凈選、水洗處理后和凈選炮制后的制乳香按處方配料，由粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，藥粉細(xì)度達(dá)到80目以上；粗粉后的藥粉經(jīng)各種超微粉碎技術(shù)進(jìn)行超微粉碎，使藥粉平均粒徑小于100μm；待粉碎的藥材經(jīng)清洗烘干滅菌后，配料；c)提取濃縮和干燥工藝降香和檀香先加水提取揮發(fā)油后再用水提取，赤芍和酸棗仁加水煎煮，水提液過(guò)濾后，待濃縮成浸膏；人參用乙醇提取后，再用水提取，醇提液回收乙醇后，濃縮成醇提浸膏，水提液過(guò)濾與所有的水提液混勻后濃縮成水提浸膏；d)制劑工藝在沸騰制粒干燥機(jī)中加入超微粉碎粉，再將步驟C)所得提取浸膏噴入制粒；將制成的顆粒經(jīng)整粒，加入冰片細(xì)粉，噴入由降香和檀香提取的揮發(fā)油，混勻后由膠囊充填機(jī)充填，制成膠囊?；蛘撸景l(fā)明應(yīng)用所述膠囊劑優(yōu)選通過(guò)以下制備方法制成a)原料藥的重量比為人參3-10份、水蛭3-11份、土鱉蟲5-10份、乳香(制)1-5份、赤芍3-9份、降香1-5份、檀香1-5份、全蝎3-9份、蟬蛻3_12份、蜈蚣1_3份、冰片1_7份、炒酸棗仁3-10份；b)藥材粉碎工藝將全蝎、水蛭、蜈蚣、土鱉蟲和蟬蛻五種蟲藥經(jīng)凈選、水洗處理后和凈選炮制后的制乳香按處方配料，由粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，藥粉細(xì)度達(dá)到80目以上；粗粉后的藥粉經(jīng)各種超微粉碎技術(shù)進(jìn)行超微粉碎，使藥粉平均粒徑小于100μm；待粉碎的藥材經(jīng)清洗烘干滅菌后，配料；c)提取濃縮和干燥工藝降香和檀香先加水提取揮發(fā)油后再用水提取，赤芍和酸棗仁加水煎煮，水提液過(guò)濾后，待濃縮成浸膏；人參用乙醇提取后，再用水提取，醇提液回收乙醇后，濃縮成醇提浸膏，水提液過(guò)濾與所有的水提液混勻后濃縮成水提浸膏，將浸膏直接噴霧干燥成噴霧粉；d)制劑工藝將超微粉碎粉與步驟C)所得噴霧干燥粉一起加到沸騰制粒干燥機(jī)中，再噴溶媒制成顆粒；將制成的顆粒經(jīng)整粒，加入冰片細(xì)粉，噴入由降香和檀香提取的揮發(fā)油，混勻后由膠囊充填機(jī)充填，制成膠囊。本發(fā)明應(yīng)用所述中藥組合物的用量，折算成原料藥材的重量，為每次0.8-3克，每日服用2-4次，優(yōu)選為每次1.11-2.22克，每日服用三次。圖1心肌缺血再灌注模型在不同時(shí)間點(diǎn)冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)平均血流量中華小型豬分為假手術(shù)組(sham，η=7)，安慰劑對(duì)照(placebo，η=7)，本發(fā)明藥物(tongxinluo,n=7)和本發(fā)明藥物聯(lián)合N-硝基-左旋-精氨酸(TXL+L_NNA，n=6)處理組。數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤表示。*表示與安慰劑組比較P<0.05，#表示與假手術(shù)組比較ρ<0.05。圖2心肌缺血、無(wú)再流和梗死面積測(cè)量結(jié)果危險(xiǎn)區(qū)面積(AAR)定義為缺血區(qū)心肌重量占左室重量的百分比；心肌梗死重量占危險(xiǎn)區(qū)心肌重量的百分比為梗死區(qū)面積(IR)；心肌無(wú)再流區(qū)重量占危險(xiǎn)區(qū)心肌重量的百分比為無(wú)再流區(qū)面積(NRR)。中華小型豬分為假手術(shù)組(sham,N=7)，安慰劑對(duì)照(placebo,N=7)，本發(fā)明藥物(tongxinluo,N=7))和本發(fā)明藥物聯(lián)合N-硝基-左旋-精氨酸(tongxinluoplusL-ΝΝΑ,Ν=6)處理組。數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤表示。*P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。圖3豬心肌組織內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)及β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)蛋白免疫印記檢測(cè)圖分別來(lái)自自本發(fā)明藥物聯(lián)合N-硝基-左旋-精氨酸(第1-3道)、本發(fā)明藥物處理組(第4-6道)及安慰劑對(duì)照組(第7-9道)的無(wú)再流區(qū)(第1，4和7道)、再流區(qū)(第2，5和8道)及非缺血區(qū)(第3、6和9道)的心肌組織。每組3只動(dòng)物，每只動(dòng)物重復(fù)3次行蛋白免疫印跡檢圖4豬心肌組織血管內(nèi)皮鈣粘連素(VE-vadherin)及β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)蛋白免疫印記檢測(cè)圖分別來(lái)自自本發(fā)明藥物聯(lián)合N-硝基-左旋-精氨酸(第1-3道)、本發(fā)明藥物處理組(第4-6道)及安慰劑對(duì)照組(第7-9道)的無(wú)再流區(qū)(第1、4和7道)、再流區(qū)(第2、5和8道)及非缺血區(qū)(第3、6和9道)的心肌組織。每組3只動(dòng)物，每只動(dòng)物重復(fù)3次蛋白免疫印跡檢測(cè)。圖5豬無(wú)再流區(qū)(NRR)，再流區(qū)(RR)及非缺血區(qū)(NON)心肌髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性中華小型豬分為假手術(shù)組(sham，n=7)，安慰劑對(duì)照(placebos=7)，本發(fā)明藥物(tongxinluo,η=7))和本發(fā)明藥物聯(lián)合N-硝基-左旋-精氨酸(tongxinluoplusL-NNA,η=6)。數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤表示。*表示ρ<0.05。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1a)原料藥配方為人參39.6g水蛭72.6g土鱉蟲46.2g乳香(制)13.2g赤芍33g降香13.2g檀香13.2g全蝎19.8g蟬蛻46.2g蜈蚣6.6g冰片33g酸棗仁(炒)33g；b)藥材粉碎工藝將全蝎、水蛭、蜈蚣、土鱉蟲和蟬蛻五種蟲藥經(jīng)凈選、水洗處理后和凈選炮制后的制乳香按處方配料，由粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，藥粉細(xì)度達(dá)到80目以上；粗粉后的藥粉經(jīng)各種超微粉碎技術(shù)進(jìn)行超微粉碎，使藥粉平均粒徑小于30-40μm；待粉碎的藥材經(jīng)清洗烘干滅菌后，配料；c)提取濃縮和干燥工藝降香和檀香先加水提取揮發(fā)油后再用水提取，赤芍和酸棗仁加適量水煎煮二次，每次3小時(shí)，合并水提液，過(guò)濾后，待濃縮成浸膏；人參用適量70%的乙醇提取二次，每次3小時(shí)，合并提取液，回收乙醇至無(wú)醇味，再用水提取，醇提液濃縮成60°C測(cè)定相對(duì)密度為0.91.1醇提浸膏，水提液過(guò)濾與上述所有水提液混勻后濃縮至60°C測(cè)定相對(duì)密度為0.91.1的清膏，備用；d)制劑工藝在沸騰制粒干燥機(jī)中加入超微粉碎粉，再將步驟C)所得提取浸膏噴入制粒；將制成的顆粒經(jīng)整粒，加入冰片細(xì)粉，噴入由降香和檀香提取的揮發(fā)油，混勻后由膠囊充填機(jī)充填，制成1000粒膠囊。本發(fā)明藥物的用量，為每次2-4粒，每日服用三次。實(shí)施例2a)原料藥配方為人參66g水蛭52.8g土鱉蟲46.2g乳香(制)13.2g赤芍33g降香13.2g檀香13.2g全蝎59.4g蟬蛻46.2g蜈蚣6.6g冰片33g酸棗仁(炒)33gb)藥材粉碎工藝將全蝎、水蛭、蜈蚣、土鱉蟲和蟬蛻五種蟲藥經(jīng)凈選、水洗處理后和凈選炮制后的制乳香按處方配料，由粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，藥粉細(xì)度達(dá)到80目以上；粗粉后的藥粉經(jīng)各種超微粉碎技術(shù)進(jìn)行超微粉碎，使藥粉平均粒徑小于70-90μm；待粉碎的藥材經(jīng)清洗烘干滅菌后，配料；c)提取濃縮和干燥工藝降香和檀香先加水提取揮發(fā)油后再用水提取，赤芍和酸棗仁加適量水煎煮二次，每次3小時(shí)，合并水提液，過(guò)濾后，待濃縮成浸膏；人參用適量70%的乙醇提取二次，每次3小時(shí)，合并提取液，回收乙醇至無(wú)醇味，再用水提取，醇提液濃縮成相對(duì)密度在60°C測(cè)定為1.01.05醇提浸膏，水提液過(guò)濾與上述所有水提液混勻后濃縮至60°C測(cè)定相對(duì)密度為1.01.1的清膏，備用；d)制劑工藝在沸騰制粒干燥機(jī)中加入超微粉碎粉，再將步驟C)所得提取浸膏噴入制粒；將制成的顆粒經(jīng)整粒，加入冰片細(xì)粉，噴入由降香和檀香提取的揮發(fā)油，按常規(guī)制劑工藝壓制成1000片。本發(fā)明藥物的用量，為每次2-4片，每日服用三次。實(shí)施例3丸劑的制備a)原料藥配方為人參39.6g水蛭66g土鱉蟲46.2g乳香(制)13.2g赤芍33g降香13.2g檀香13.2g全蝎46.2g蟬蛻46.2g蜈蚣6.6g冰片33g酸棗仁(炒)33gb)藥材粉碎工藝將全蝎、水蛭、蜈蚣、土鱉蟲和蟬蛻五種蟲藥經(jīng)凈選、水洗處理后和凈選炮制后的制乳香按處方配料，由粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，藥粉細(xì)度達(dá)到80目以上；粗粉后的藥粉經(jīng)各種超微粉碎技術(shù)進(jìn)行超微粉碎，使藥粉平均粒徑10-20μm；待粉碎的藥材經(jīng)清洗烘干滅菌后，配料；c)提取濃縮和干燥工藝降香和檀香先加水提取揮發(fā)油后再用水提取，赤芍和酸棗仁加適量水煎煮二次，每次3小時(shí)，合并水提液，過(guò)濾后，待濃縮成浸膏；人參用適量70%的乙醇提取二次，每次3小時(shí)，合并提取液，回收乙醇至無(wú)醇味，再用水提取，醇提液濃縮成60°C測(cè)定相對(duì)密度為0.91.0醇提浸膏，水提液過(guò)濾與上述所有水提液混勻后濃縮至60°C測(cè)定相對(duì)密度為1.01.1的清膏，備用；d)制劑工藝按常規(guī)制劑工藝，制成1000粒丸劑。本發(fā)明藥物的用量，為每次2-4粒，每日服用三次。實(shí)驗(yàn)例為闡明本發(fā)明中藥組合物促進(jìn)一氧化氮生成，減輕心肌缺血再灌注損傷的應(yīng)用，用按上述實(shí)施例1方法制得的膠囊劑(以下稱本發(fā)明藥物)進(jìn)行了下列試驗(yàn)以證明其療效，但其不能對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)分組選用中華小型豬28只(購(gòu)于北京農(nóng)業(yè)大學(xué))，雌雄不限，體重25士5公斤，隨機(jī)分成假手術(shù)組、安慰劑組、本發(fā)明藥物組和本發(fā)明藥物聯(lián)合一氧化氮合酶抑制劑N-硝基-左旋精氨酸(L-NNA)處理組，每組7只。1.2試劑及儀器硫磺素S、伊文思藍(lán)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；紅四氮唑購(gòu)自北京馬氏化學(xué)品有限公司；MPO試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；兔抗人N0S3、β-actin多克隆抗體、羊抗人VE-cadherin多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)SantaCruze公司；鼠抗兔、鼠抗羊二抗購(gòu)自中山金橋生物公司；超聲血流量?jī)x及1.5mm探頭由TransonicSystems公司生產(chǎn)；西門子900c呼吸機(jī)；美國(guó)BiopacSystemMP-150多導(dǎo)生理記錄儀。1.3藥物及用法本發(fā)明藥物(由石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn))。本發(fā)明藥物0.4g/kg與30ml飲用水混合在冠脈結(jié)扎前3小時(shí)經(jīng)胃管注入；10mg/kg的L-NNA溶于200ml生理鹽水中，在冠脈結(jié)扎前50分鐘以7ml/min由股靜脈注入。安慰劑組在冠脈結(jié)扎前3小時(shí)經(jīng)胃管注入30ml飲用水。1.4實(shí)驗(yàn)方法氯胺酮與安定混合制劑(703)730mg肌肉內(nèi)注射誘導(dǎo)麻醉，然后以2mg/kg/h速度持續(xù)靜脈點(diǎn)滴。所有動(dòng)物均經(jīng)口行氣管插管，呼吸機(jī)控制通氣，沿胸骨正中打開胸腔，縱行切開心包膜，暴露心臟，并將心包膜縫合于胸壁呈吊籃狀。在冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)近端1/3處游離并穿線，沿結(jié)扎線穿入一長(zhǎng)約34cm的硅膠管腔內(nèi)結(jié)扎1.5h，再松解3h建立急性心梗及再灌注模型。假手術(shù)組冠脈下只穿線，不結(jié)扎，無(wú)急性心梗，也無(wú)再灌注。術(shù)中監(jiān)測(cè)體表心電圖、股動(dòng)脈內(nèi)血壓。在冠脈結(jié)扎前、松解即刻、再灌注180分鐘測(cè)量心室內(nèi)壓。在冠脈結(jié)扎前、再灌注5、30、60、120、180分鐘時(shí)測(cè)量LAD平均血流量。所有數(shù)據(jù)均顯示在多導(dǎo)生理記錄儀并用3.8.1版Acqknowledge軟件分析。1.5無(wú)再流面積的判定及取材方法本研究參照既往實(shí)驗(yàn)方法，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，從左心房、室同時(shí)注入lml/kg的4%的熒光染料硫磺素S，它隨血流到達(dá)的區(qū)域在365nm波長(zhǎng)熒光燈下顯熒光，為再流區(qū)；無(wú)再流區(qū)不顯熒光；再于原位重新結(jié)扎LAD，從左心房再注入lml/kg的2%伊文思藍(lán)染料，伊文思藍(lán)不能隨血流到達(dá)缺血區(qū)，所以缺血區(qū)不著藍(lán)色；非缺血區(qū)著藍(lán)色。處死動(dòng)物后立即取出心臟，剪除左右心耳及右心室，于冰生理鹽水中蕩洗去除殘余血液；從心尖向心底方向，平行于房室溝按順序?qū)⒆笫仪谐?-7片，分別稱取重量并拍照。留取正常區(qū)、再流區(qū)和無(wú)再流區(qū)部分心肌保存于液氮中。將各片心肌放入37°C紅四氮唑磷酸鹽緩沖液中15分鐘并拍照，白色的區(qū)域?yàn)閴乃绤^(qū)心肌。使用LECA-QWIN軟件，用面積求積法分別測(cè)算缺血危險(xiǎn)區(qū)占左室重量百分比表示為危險(xiǎn)區(qū)面積(AAR)，梗死區(qū)、無(wú)再流區(qū)占缺血區(qū)重量百分比分別則表示為梗死區(qū)面積(IR)和無(wú)再流區(qū)面積(NRR)。1.6心肌組織髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性測(cè)定從液氮中取出心肌組織約lOOmg，用硬塑料包裹砸碎，余下具體操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。蒸餾水調(diào)零，在460nm處使用分光光度計(jì)測(cè)OD值。以每克組織在37°C的反應(yīng)體系中分解Iumol的H2O2為1個(gè)酶活力單位。1.7免疫印跡法測(cè)蛋白含量從液氮中取心肌組織約lOOmg，與Iml的冰RIPA裂解液及Immol苯甲基磺酰氟化物(PMSF)混合，在超聲粉碎機(jī)下粉碎，離心提取上清，用BCA法測(cè)定總蛋白濃度。采用十二烷基硫酸鈉一變性聚丙烯酰胺凝膠不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，先后配8%的分離膠和5%的濃縮膠；取蛋白樣品，上樣25ul(約含蛋白60ug)，先后以80和120V電泳，約IOOmin后，在轉(zhuǎn)移緩沖液中進(jìn)行電轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜上’放入5%脫脂奶粉封閉液中室溫封閉60min；放入一抗中(1500稀釋)4°C過(guò)夜；再放入二抗(12000稀釋)常溫孵育Ih;用ECL超敏發(fā)光液顯影并在膠片上曝光。1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有變量以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤表示，多組間比較用非參Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，有意義后行Durmett單因素方差分析比較組間差異。用重復(fù)檢驗(yàn)比較血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)。以P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用SPSS13.O軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2結(jié)果2.1動(dòng)物死亡情況本發(fā)明藥物聯(lián)合L-NNA處理組有一只豬在心肌缺血過(guò)程中反復(fù)出現(xiàn)室速、室顫，因搶救失敗而剔除。2.2血流動(dòng)力學(xué)結(jié)果在缺血前、再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定的心率血壓乘積(RPP)、心室內(nèi)壓力變化率峰值(+dp/dt)、左室舒張末壓(LVDEP)和前降支冠脈平均血流量(CBF)，具體見(jiàn)表1。表1血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)(均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注RPP，心率血壓；CBF，前降支平均血流量；LVEDP，左室舒張末壓；+dp/dt，左心室內(nèi)壓力變化率峰值；Sham,假手術(shù)組；Placebo，安慰劑對(duì)照組；TXL，本發(fā)明藥物處理組；TXL+L-NNA，本發(fā)明藥物聯(lián)合一氧化氮合酶抑制劑N-硝基-左旋精氨酸處理組在缺血前，反映心肌氧耗量程度的指標(biāo)RPP在本發(fā)明藥物聯(lián)合L-NNA處理組明顯高于假手術(shù)、安慰劑、和本發(fā)明藥物組(P<0.05)。但在再灌注期間，各組間RPP無(wú)明顯差異；以+dp/dt和LVDEP表示的心室功能在再灌注期間明顯下降(P<0.05)。但在再灌注期間各時(shí)間點(diǎn)，三個(gè)缺血再灌注組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；在缺血前，冠脈血流量在各組間無(wú)差異；再灌注5分鐘后缺血再灌注處理組冠脈血流量增加，隨后逐漸減少；與假手術(shù)和本發(fā)明藥物處理組比較，再灌注120分鐘和180分鐘時(shí)安慰劑組和本發(fā)明藥物聯(lián)合L-NNA處理組冠脈血流量明顯減少(P<0.05)，如圖1所示。2.3心肌缺血、無(wú)再流和梗死面積測(cè)量結(jié)果安慰劑組、本發(fā)明藥物組和本發(fā)明藥物聯(lián)合L-NNA處理組AAR分別是31士3%，32士4%和28士3%，各組間無(wú)明顯差異。與安慰劑組(90士3%，70士4%)和本發(fā)明藥物聯(lián)合L-NNA處理組(95士2%，63士3%)比較，本發(fā)明藥物處理組(78士3%，47士5%)明顯減少了IR,NRR(P<0.05)，如圖2所示。2.4蛋白免疫跡記法測(cè)定無(wú)再流區(qū)、再流區(qū)和非缺血區(qū)心肌組織內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)和血管內(nèi)皮鈣粘連素(VE-vadherin)含量各組無(wú)再流區(qū)心肌組織eNOS含量明顯少于再流區(qū)和非缺血區(qū)，但各缺血再灌注組間比較無(wú)明顯區(qū)別，如圖3所示；無(wú)再流區(qū)VE-cadherin含量也較再流區(qū)、非缺血區(qū)明顯減少；與安慰劑組和本發(fā)明藥物聯(lián)合L-NNA處理組比較，本發(fā)明藥物處理明顯增加了無(wú)再流區(qū)VE-cadherin的含量，如圖4所示。2.5心肌MPO活性測(cè)定結(jié)果安慰劑、本發(fā)明藥物和本發(fā)明藥物聯(lián)合L-NNA處理組非缺血區(qū)心肌的MPO活性與假手術(shù)組比較無(wú)差異。而無(wú)再流區(qū)MPO活性大于再流區(qū)(P<0.05)，再流區(qū)MPO活性大于非缺血區(qū)(P<0.05)。與安慰劑和本發(fā)明藥物聯(lián)合L-NNA處理組比較，本發(fā)明藥物處理明顯減少了無(wú)再流區(qū)和再流區(qū)MPO活性(P<0.05)，如圖5所示。3結(jié)論實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示本發(fā)明藥物聯(lián)合L-NNA處理組在缺血前RPP明顯升高，提示L-NNA處理有可能在心肌缺血期間增加了心肌的氧耗，但既往研究證實(shí)單獨(dú)應(yīng)用L-NNA盡管會(huì)增加RPP，卻不會(huì)對(duì)梗死面積和心肌局部血流產(chǎn)生影響，基于此認(rèn)為在此實(shí)驗(yàn)中，L-NNA藥物處理本身沒(méi)有增加心肌缺血再灌注損傷，而是取消了本發(fā)明藥物的心肌保護(hù)作用，表明本發(fā)明藥物的心肌保護(hù)作用與NO生成有關(guān)。心肌缺血后測(cè)定MPO活性可以定量反映中性粒細(xì)胞在心肌組織浸潤(rùn)的程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示無(wú)再流區(qū)MPO活性高于再流區(qū)及非缺血區(qū)，這與用電鏡、免疫組化等方法觀察得出的結(jié)果相符。與安慰劑組比較，本發(fā)明藥物處理組明顯減少了再流區(qū)和無(wú)再流區(qū)MPO活性，提示本發(fā)明藥物預(yù)處理減少了中性粒細(xì)胞在組織浸潤(rùn)的程度。已有研究顯示用缺少白細(xì)胞的灌流液灌注缺血心肌可以減少無(wú)再流面積，缺血再灌注后，NO可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附分子的生成而減少粒細(xì)胞的滾動(dòng)、與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附。以上實(shí)驗(yàn)顯示L-NNA與本發(fā)明藥物聯(lián)合處理組再流區(qū)和無(wú)再流區(qū)MPO活性明顯增加，表明本發(fā)明藥物是通過(guò)改變NO的生成而減少中性粒細(xì)胞在組織中的浸潤(rùn)。VE-cadherin是內(nèi)皮細(xì)胞特異的一種粘附蛋白，對(duì)維持血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)完整性具有重用的作用。粘附連接蛋白功能異常是導(dǎo)致心肌間質(zhì)水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的重要原因。VE-cadherin對(duì)蛋白水解酶非常敏感，尤其是心肌缺血再灌注后炎性細(xì)胞激活釋放的蛋白水解酶，可以直接導(dǎo)致VE-cadherin降解。以上研究顯示心肌缺血再灌注后無(wú)再流區(qū)心肌VE-cadherin明顯減少，這與既往的研究結(jié)果一致。本發(fā)明藥物預(yù)處理明顯增加無(wú)再流區(qū)VE-cadherin含量，而與L-NNA聯(lián)用后VE-cadherin含量降低，表明本發(fā)明藥物增加VE-cadherin含量與NO生成有關(guān)。綜上所述，本發(fā)明藥物可以明顯減少心肌缺血再灌注損傷，減少中性粒細(xì)胞在缺血區(qū)的浸潤(rùn)，增加無(wú)再流區(qū)VE-cadherin含量，而NOS競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑L-NNA則完全取消了本發(fā)明藥物的這些心肌保護(hù)作用。表明本發(fā)明藥物可以增加血漿一氧化氮的濃度，有效減輕心肌缺血再灌注損傷。權(quán)利要求一種中藥組合物在制備促進(jìn)一氧化氮生成藥物中的應(yīng)用，其特征在于，該中藥組合物由如下重量份的原料藥制成人參3-10水蛭3-11土鱉蟲5-10乳香(制)1-5赤芍3-9降香1-5檀香1-5全蝎3-9蟬蛻3-12蜈蚣1-3冰片1-7酸棗仁(炒)3-10。2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，該中藥組合物由如下重量份的原料藥制成人參6水蛭10土鱉蟲7乳香(制)2赤芍5降香2檀香2全蝎7蟬蛻7蜈蚣1冰片5酸棗仁(炒)5。3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，該中藥組合物由如下重量份的原料藥制成人參10水蛭8土鱉蟲7乳香(制)2赤芍5降香2檀香2全蝎9蟬蛻7蜈蚣1冰片5酸棗仁(炒)5。4.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，該中藥組合物由如下重量份的原料藥制成人參6水蛭11土鱉蟲7乳香(制)2赤芍5降香2檀香2全蝎3蟬蛻7蜈蚣1冰片5酸棗仁(炒)5。5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述中藥組合物的活性成分由下列成分組成a平均粒徑小于100um的全蝎、水蛭、蜈蚣、土鱉蟲、蟬蛻及乳香(制)藥粉；b冰片藥粉；c由降香和檀香提取的揮發(fā)油；d人參用乙醇提取后的醇提液經(jīng)濃縮后的醇提浸膏；e提取成分c后的降香和檀香藥渣的水提液、赤芍和酸棗仁(炒)加水煎煮后的水提液以及提取成分d后的人參藥渣的水提液過(guò)濾、混勻后濃縮成的水提浸膏。6.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，該中藥組合物的制劑劑型為膠囊劑、片劑、顆粒劑、散劑、口服液或丸劑。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述膠囊劑是由以下步驟制成的a)按照重量份比例稱取各原料藥；b)藥材粉碎工藝將全蝎、水蛭、蜈蚣、土鱉蟲和蟬蛻五種蟲藥經(jīng)凈選、水洗處理后和凈選炮制后的制乳香按處方配料，由粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，藥粉細(xì)度達(dá)到80目以上；粗粉后的藥粉經(jīng)各種超微粉碎技術(shù)進(jìn)行超微粉碎，使藥粉平均粒徑小于100um；待粉碎的藥材經(jīng)清洗烘干滅菌后，配料；c)提取濃縮和干燥工藝降香和檀香先加水提取揮發(fā)油后再用水提取，赤芍和酸棗仁加水煎煮，水提液過(guò)濾后，待濃縮成浸膏；人參用乙醇提取后，再用水提取，醇提液回收乙醇后，濃縮成醇提浸膏，水提液過(guò)濾與所有的水提液混勻后濃縮成水提浸膏；d)制劑工藝在沸騰制粒干燥機(jī)中加入超微粉碎粉，再將步驟c)所得提取浸膏噴入制粒；將制成的顆粒經(jīng)整粒，加入冰片細(xì)粉，噴入由降香和檀香提取的揮發(fā)油，混勻后由膠囊充填機(jī)充填，制成膠囊。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述膠囊劑是由以下步驟制成的a)按照重量份比例稱取各原料藥；b)藥材粉碎工藝將全蝎、水蛭、蜈蚣、土鱉蟲和蟬蛻五種蟲藥經(jīng)凈選、水洗處理后和凈選炮制后的制乳香按處方配料，由粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，藥粉細(xì)度達(dá)到80目以上；粗粉后的藥粉經(jīng)各種超微粉碎技術(shù)進(jìn)行超微粉碎，使藥粉平均粒徑小于100um；待粉碎的藥材經(jīng)清洗烘干滅菌后，配料；c)提取濃縮和干燥工藝降香和檀香先加水提取揮發(fā)油后再用水提取，赤芍和酸棗仁加水煎煮，水提液過(guò)濾后，待濃縮成浸膏；人參用乙醇提取后，再用水提取，醇提液回收乙醇后，濃縮成醇提浸膏，水提液過(guò)濾與所有的水提液混勻后濃縮成水提浸膏，將浸膏直接噴霧干燥成噴霧粉；d)制劑工藝將超微粉碎粉與步驟c)所得噴霧干燥粉一起加到沸騰制粒干燥機(jī)中，再噴溶媒制成顆粒；將制成的顆粒經(jīng)整粒，加入冰片細(xì)粉，噴入由降香和檀香提取的揮發(fā)油，混勻后由膠囊充填機(jī)充填，制成膠囊。9.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述中藥組合物在制備減輕心肌缺血再灌注損傷藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種中藥組合物在制備促進(jìn)一氧化氮生成藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明中藥組合物由人參、水蛭、蜈蚣、全蝎、土鱉蟲、蟬蛻、赤芍、冰片等組成，具有益氣活血、化瘀通絡(luò)的功效。通過(guò)試驗(yàn)證明本發(fā)明中藥組合物可以增加血漿一氧化氮的濃度，減輕心肌缺血再灌注損傷。文檔編號(hào)A61P9/10GK101829203SQ20091007390公開日2010年9月15日申請(qǐng)日期2009年3月11日優(yōu)先權(quán)日2009年3月11日發(fā)明者楊躍進(jìn),程宇彤申請(qǐng)人:河北以嶺醫(yī)藥研究院有限公司