專利名稱：狂犬病、破傷風(fēng)雙效價人免疫球蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種生物免疫制品，特別是涉及一種能同時預(yù)防人狂犬病及破傷風(fēng)的雙效價免疫球蛋白及其制備方法。
背景技術(shù)：
狂犬病是一種病原體為核糖核酸型的彈性病毒。世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球三分之二以上的國家和地區(qū)有狂犬病流行，我國及東南亞地區(qū)處于世界狂犬病
高發(fā)區(qū)，其病例約占全球的70%以上。狂犬病一旦發(fā)病，目前尚無法醫(yī)治，死亡
率幾乎達(dá)iooy。。根據(jù)冊o推薦的狂犬免疫接種方案，對暴露者注射人狂犬病免
疫球蛋白(RIg),然后肌肉注射狂犬病疫苗，以確保暴露者免疫效果。該方法
被世界衛(wèi)生組織公認(rèn)為是目前唯一有效的預(yù)防方法。
破傷風(fēng)是一種嚴(yán)重威脅人類生命健康的急性特異性感染疾病，由破傷風(fēng)桿菌侵入人體傷口、生長繁殖、產(chǎn)生毒素引起。破傷風(fēng)桿菌及其毒素不能侵入正常的皮膚和粘膜，故破傷風(fēng)都發(fā)生在傷后。 一切開放性損傷均有發(fā)生破傷風(fēng)的
可能。人體破傷風(fēng)免疫球蛋白(TIg )是經(jīng)乙肝疫苗接種后再經(jīng)破傷風(fēng)類毒素(TD )
免疫的具有高效價破傷風(fēng)抗體的血漿，經(jīng)低溫乙醇法分級沉淀、加壓過濾分離提純，并經(jīng)病毒滅活處理，用于防治破傷風(fēng)。
世界衛(wèi)生組織要求，在對病犬咬傷積極預(yù)防狂犬病的同時，也應(yīng)預(yù)防破傷風(fēng)。目前我國臨床使用的狂犬病人免疫球蛋白和破傷風(fēng)人免疫球蛋白均為單一效價，使用時需要多次注射，臨床使用不便，而且費用高。制備一種即能預(yù)防狂犬病同時又能預(yù)防破傷風(fēng)發(fā)生的雙效價免疫球蛋白，將會有較大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)及產(chǎn)品效能的不足，提供 一種即能預(yù)防狂犬病同時又能預(yù)防破傷風(fēng)發(fā)生的雙效價免疫球蛋白及制備方法。本發(fā)明提供的狂犬病、破傷風(fēng)雙效價人免疫球蛋白含有高效價的狂犬病抗
體及破傷風(fēng)抗體，其免疫球蛋白純度不低于總蛋白含量的92%;狂犬病抗體效價不小于100IU/ml,破傷風(fēng)抗體效價不小于60IU/mL;蛋白質(zhì)含量不大于175g/L。
本發(fā)明提供的狂犬病、破傷風(fēng)雙效價人免疫球蛋白僅與抗人的血清產(chǎn)生沉淀線，與抗馬、抗牛、抗豬、抗羊的血清均不產(chǎn)生沉淀線。
本發(fā)明提供的狂犬病、破傷風(fēng)雙效價人免疫球蛋白與正常人血清比較，主要沉淀線應(yīng)為IgG，且其IgG單體及二聚體的含量之和不低于92%。
本發(fā)明將狂犬病、破傷風(fēng)雙效價人免疫球蛋白制成常規(guī)的液體型或凍干劑型使用。
本發(fā)明的狂犬病、破傷風(fēng)雙效價人免疫球蛋白的制備方法是將雙效價原料血漿經(jīng)常規(guī)的低溫乙醇蛋白分離法分級沉淀，提取免疫球蛋白組分，經(jīng)加壓過濾、離心、病毒滅活處理等必要的工序制成免疫球蛋白液體或凍干劑型。其制備方法的關(guān)鍵在于原料血漿的制備，具體方法是
1) 選擇身體健康，符合血液制品原料血漿規(guī)定要求的供血漿者接種狂犬病疫苗，至少15天后再應(yīng)用吸附破傷風(fēng)疫苗進(jìn)行免疫接種；
2) 以固相酶聯(lián)免疫法(ELISA)定量檢測原料血漿的狂犬病抗體及破傷風(fēng)抗體，單一血漿的狂犬病抗體效價不低于6IU/mL,破傷風(fēng)抗體效價不低于5IU/mL,其它符合"血液制品原料血漿規(guī)程"要求，釆集為狂犬病、破傷風(fēng)雙效價人免疫球蛋白原料血漿；
3) 混合釆集的狂犬病、破傷風(fēng)雙效價人免疫球蛋白原料血漿，混合后血漿的狂犬病抗體效價不低于10IU/mL,破傷風(fēng)抗體效價不低于8IU/mL。
本發(fā)明釆集得到的原料血漿應(yīng)低溫冰凍儲存，其保存期不超過2年。作為制備狂犬病、破傷風(fēng)雙效價人免疫球蛋白原料的混合原料血漿，每批次需由不少于IOO名供血漿者的原料血漿混合而成。
本發(fā)明的狂犬病、破傷風(fēng)雙效價人免疫球蛋白可用于被狂犬或其他瘋動物咬傷或抓傷暴露患者的免疫。其使用量以狂犬病抗體效價計，按20IU/kg體重
計算， 一次注射。如個體所需免疫球蛋白注射總劑量大于10mL時，可在1~2曰內(nèi)分次注射。隨后即可進(jìn)行狂犬病疫苗的注射。
本發(fā)明提供的狂犬病、破傷風(fēng)雙效價人免疫球蛋白 一次注射即可預(yù)防狂犬病和破傷風(fēng)，使用簡單方便，具有較大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明免疫球蛋白的原料血漿制備方法簡單，免疫球蛋白制備成本低。
具體實施例方式
實施例1
1、 供血漿者的免疫
選擇身體健康，符合血液制品原料血漿規(guī)定要求的供血漿者，在0、 3、 7、14、 28天分別接種狂犬病疫苗2、 2、 1、 1、 2劑。接種狂犬疫苗30天后，再應(yīng)用吸附破傷風(fēng)疫苗，接照0、 14、 28天劑量不小于0. 5mL進(jìn)行免疫接種，并建立詳細(xì)的免疫記錄。
2、 供血漿者的血漿篩選釆集
選擇固相酶聯(lián)免疫法(ELISA)分別定量檢測供血漿者血清或血漿中的狂犬病抗體及破傷風(fēng)抗體，狂犬病抗體效價不小于6IU/mL,同時破傷風(fēng)抗體效價不小于5IU/mL,蛋白質(zhì)含量(雙縮脲法)不低于55g/L，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(賴氏法)不高于25單位，乙型肝炎表面抗原陰性，梅毒陰性，HIV-l/HIV-2抗體陰性，HCV抗體陰性等符合國家要求的血漿為特免血漿，按血液制品原料血漿規(guī)程要求釆集為狂犬病、破傷風(fēng)雙效價免疫球蛋白原料血漿，低溫冰凍儲存，保存期不超過2年。
3、 狂犬病、破傷風(fēng)雙效價人免疫球蛋白的制備
(1) 將100名以上供血漿者的血漿融化混合，混合后血漿狂犬病抗體效價不低于10IU/mL、破傷風(fēng)抗體效價不低于8IU/mL為合格原料血漿；
(2) 分離后的無菌血漿，在0 4。C下離心去除冷沉淀；
6(3) 去除冷沉淀后的血漿用醋酸緩沖液調(diào)節(jié)pH值至6. 8 ~ 7. 2,加95°/。乙醇至 反應(yīng)液最終濃度為8~10%,反應(yīng)液溫度至-1~-3°(:,離心得沉淀；
(4) 在上清液中加95%乙醇至反應(yīng)液最終濃度為19~21%，以醋酸緩沖液調(diào)節(jié) pH值至6. 5-6. 8,反應(yīng)液溫度至-4~-5°C，分離得沉淀；
(5) 將步驟(4)的沉淀以15 ~ 20倍沉淀量的溶解液攪拌溶解；
(6) 在上清液中加95%乙醇至反應(yīng)液最終濃度為14~17%，以醋酸緩沖液調(diào)節(jié) pH值至5. 0-5.2，反應(yīng)液溫度至-4~-5°C,分離得沉淀；
(7) 在上清液中加95°/。乙醇至反應(yīng)液最終濃度為24 ~ 26%,以碳酸氫納緩沖液 調(diào)節(jié)pH值至7. 0~7. 2，反應(yīng)液溫度至-5 -7。C,分離得沉淀；
(8) 將步驟(7)的沉淀用10倍沉淀量的溶解液攪拌溶解，調(diào)節(jié)pH值為7. 0~ 7.2,溫度至0-2。C，蛋白濃度在1. 5~2. 5%，離心得沉淀；
(9) 將步驟(8)的沉淀用溶解液攪拌至溶解，經(jīng)超濾、脫醇、脫鹽、濃縮，得
到含有高效價的狂犬病、破傷風(fēng)雙效價人免疫球蛋白原液；
(10) 調(diào)整上述原液的pH值為3. 8~4. 2，蛋白濃度5%，經(jīng)24 25'C孵放21天
和納米膜過濾的雙病毒滅活處理；
(11) 調(diào)整滅活的原液，使蛋白濃度不超過17.5%，狂犬病抗體效價不低于 100IU/mL，破傷風(fēng)效價不低于60IU/mL， pH值為6.6~7.2,并加入一定比例的
甘氨酸及適量麥芽糖作為保護(hù)劑制成半成品；
(12) 分裝為成品，檢定合格。 4、檢定
(1) 活性
狂犬病抗體效價不低于100IU/mL，破傷風(fēng)效價不低于60IU/mL。
(2) 鑒別
免疫雙擴(kuò)散法僅與抗人的血清產(chǎn)生沉淀線，與抗馬、抗牛、抗豬、抗羊 的血清不產(chǎn)生沉淀線。
7免疫電泳法與正常人血清比較，主要沉淀線應(yīng)為IgG。
(3) 蛋白質(zhì)含量 不高于175g/L。
(4) 純度
免疫球蛋白含量不低于蛋白質(zhì)總量的92%。
(5) 分子大小分布
IgG單體與二聚體含量之和不低于92%。
(6) 外觀
應(yīng)為無色或淡黃色澄清液體，可帶乳光，不應(yīng)出現(xiàn)渾濁。
(7) 熱穩(wěn)定性
57。C土0.5。C水浴中保溫4小時后，用可見異物檢查裝置，肉眼觀察無凝膠 化或絮狀物。
(8) pH值
用生理氯化鈉溶液將供試品蛋白質(zhì)含量稀釋成10g/L， pH值為6.6-7.2。
(9) 其它符合人免疫球蛋白要求。 實施例2
使用實施例1制備得到的狂犬病、破傷風(fēng)雙效價人免疫球蛋白對患者進(jìn)行 免疫，其中犬傷100人份，鼠咬傷20人份，貓傷20人份，豬咬傷20人份。連 續(xù)觀察4年，未見發(fā)病及死亡病例。
權(quán)利要求
1、狂犬病、破傷風(fēng)雙效價人免疫球蛋白，含有高效價的狂犬病抗體和破傷風(fēng)抗體，其免疫球蛋白純度不低于總蛋白的92％，狂犬病抗體的效價不小于100IU/mL，同時破傷風(fēng)抗體效價不小于60IU/mL，蛋白質(zhì)含量不大于175g/L。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的狂犬病、破傷風(fēng)雙效價人免疫球蛋白，其特征是 所述免疫球蛋白僅與抗人血清產(chǎn)生沉淀線，與抗馬、牛、豬、羊血清不產(chǎn)生沉 淀線。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的狂犬病、破傷風(fēng)雙效價人免疫球蛋白，其特征是 所述免疫球蛋白與正常人血清比較，主要沉淀線為IgG。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的狂犬病、破傷風(fēng)雙效價人免疫球蛋白，其特征是 所述免疫球蛋白的IgG單體及二聚體含量之和不低于92%。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的狂犬病、破傷風(fēng)雙效價人免疫球蛋白，其特征是所述免疫球蛋白的劑型為液體型或凍干劑型。
6、 權(quán)利要求l所述的狂犬病、破傷風(fēng)雙效價人免疫球蛋白的制備方法，其 特征是其原料血漿的制備方法是1) 選擇身體健康，符合血液制品原料血漿規(guī)定要求的供血漿者接種狂犬病 疫苗，至少15天后再應(yīng)用吸附破傷風(fēng)疫苗進(jìn)行免疫接種；2) 定量檢測原料血漿的狂犬病抗體及破傷風(fēng)抗體，單一血漿狂犬病抗體效 價不低于6IU/mL，破傷風(fēng)抗體效價不低于5IU/mL,其它符合"血液制品原料血 漿規(guī)程"要求，采集為狂犬病、破傷風(fēng)雙效價人免疫球蛋白原料血漿；3) 混合釆集的狂犬病、破傷風(fēng)雙效價人免疫球蛋白原料血漿，混合后血漿 的狂犬病抗體效價不低于10IU/mL，破傷風(fēng)抗體效價不低于8IU/mL。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的狂犬病、破傷風(fēng)雙效價人免疫球蛋白的制備方法，其特征是每批次的混合原料血漿由不少于ioo名供血漿者的原料血漿混合而成。
8、 權(quán)利要求l所述的狂犬病、破傷風(fēng)雙效價人免疫球蛋白在被狂犬或其他 瘋動物咬傷或抓傷暴露患者免疫中的應(yīng)用。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的狂犬病、破傷風(fēng)雙效價人免疫球蛋白在被狂犬或 其他瘋動物咬傷或抓傷暴露患者免疫中的應(yīng)用，其特征是所述免疫球蛋白的使用量以狂犬病抗體效價計，按20IU/kg體重計算。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的狂犬病、破傷風(fēng)雙效價人免疫球蛋白在被狂犬 或其他瘋動物咬傷或抓傷暴露患者免疫中的應(yīng)用，其特征是個體免疫球蛋白注 射總劑量大于10mL時，在1 ~ 2日內(nèi)分次注射。
全文摘要
一種狂犬病、破傷風(fēng)雙效價人免疫球蛋白，其狂犬病抗體效價不小于100IU/mL，破傷風(fēng)抗體效價不小于60IU/mL，蛋白質(zhì)含量不大于175g/L，免疫球蛋白純度不低于總蛋白含量的92％。其原料血漿的制備方法是選擇供血漿者接種狂犬病疫苗，至少15天后再接種吸附破傷風(fēng)疫苗，以獲取狂犬病抗體效價不低于6IU/mL，同時破傷風(fēng)抗體效價不低于5IU/mL的原料血漿，且應(yīng)保證混合后原料血漿狂犬病抗體效價不低于10IU/mL，破傷風(fēng)抗體效價不低于8IU/mL。本發(fā)明的免疫球蛋白可用于被狂犬或其他瘋動物咬傷或抓傷暴露患者的免疫。
文檔編號A61K39/42GK101502651SQ20091007395
公開日2009年8月12日 申請日期2009年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月16日
發(fā)明者凱 周, 孫思才 申請人:山西康寶生物制品股份有限公司