專利名稱：：具有抗腫瘤功能的灌洗液的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種蘇木提取物的制備方法，具體為一種具有抗腫瘤功能的灌洗液的制備方法。
背景技術(shù)：
：蘇木簡介，蘇木為豆科小喬木或灌木蘇木的干燥心材，味甘、咸、微辛，入心、肝、脾，能活血化瘀、消腫之痛。近年來的研究表明，蘇木除具有傳統(tǒng)的功效之外，尚具有免疫抑制、抗移植排斥反應(yīng)、降低血糖等多種作用。20世紀(jì)70年代日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)蘇木水提取液在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用，國內(nèi)也有這方面報(bào)道。例如蘇木精對(duì)人類膀胱癌T24細(xì)胞的殺傷及誘導(dǎo)凋亡作用，《腫瘤研究與臨床》，2008年12月第20巻第12期，P799-801。蘇木精與順鉑、羥喜樹堿等藥物腹腔化療對(duì)小鼠肝癌HepA細(xì)胞抑制作用的比較，《腫瘤研究與臨床》，2009年2月第21巻第2期，P84-86。在上述論文中，對(duì)蘇木提取得到的灌注液進(jìn)行了相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，并且得到了該灌注液對(duì)小鼠移植性肝癌具有顯著的抑制作用，以及對(duì)人體膀胱癌細(xì)胞具有殺傷及誘導(dǎo)調(diào)亡的作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。但是該灌注液并沒有經(jīng)過人體臨床試驗(yàn)，還不具有應(yīng)用價(jià)值，也并沒有公開其具體的提取工藝。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的具有特定效果的蘇木提取的問題而提供了一種具有抗腫瘤功能的灌洗液的制備方法。本發(fā)明是由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，一種具有抗腫瘤功能的灌洗液的制備方法，步驟包括，2、加入3-5倍量的純化水，室溫下浸泡12-24小時(shí)，3、煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；再加入2-3倍量的純化水并煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；再加入2-3倍量的純化水并煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；合并三次得到的提取液，減壓濃縮至加水總量的12-16%,4、將濃縮液在-2(TC下冷凍結(jié)冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀，5、上步驟得到的濃縮液再加熱煮沸，然后將其在-20。C下冷凍結(jié)冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀，6、上步驟得到的濃縮液再加熱煮沸，然后將其在-20。C下冷凍結(jié)冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀并加熱濃縮最后得到加水總量10%的蘇木提取濃縮液。該提取液可以制成注射液或者粉針劑以供臨床使用。經(jīng)過小鼠的不同藥物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本提取液對(duì)小鼠肝癌株HEPA具有顯著的抑制作用，具體結(jié)果為對(duì)照組動(dòng)物的平均生存天數(shù)為15.99-16.33天，順鉑組為32.98-41.89天，羥喜組為20.79-38.47天，絲裂霉素組為35.77-40.06天，本灌注液組為36.35-39.81天，該灌注液對(duì)人體膀胱癌T24細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡和直接殺傷作用。具體實(shí)驗(yàn)過程在
背景技術(shù)：
中所述的論文中已經(jīng)詳細(xì)地做出說明。經(jīng)過臨床53例病人使用證實(shí)，本發(fā)明所得到的灌注液的近期有效率達(dá)到100%,<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>本發(fā)明(代號(hào)為PGF)與現(xiàn)有常用的抗癌藥物體外對(duì)臨床病歷膀胱癌患者細(xì)胞的藥敏對(duì)比實(shí)驗(yàn)見附圖7所示意，在研究中申請(qǐng)人還發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所述的灌注液對(duì)卵巢癌細(xì)胞也具有顯著的生長抑制及誘導(dǎo)凋亡作用。本實(shí)驗(yàn)以人卵巢癌細(xì)胞株SK0V3為靶細(xì)胞，采用細(xì)胞培養(yǎng)法，流式細(xì)胞儀檢測技術(shù)，電子顯微鏡技術(shù)分析得出本發(fā)明所述的灌注液對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長抑制及誘導(dǎo)凋亡作用機(jī)制。以下為實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析1、材料主要試劑卵巢癌細(xì)胞株SKOV3由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所免疫室惠贈(zèng)。1640培養(yǎng)基購自Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，細(xì)胞凋亡試劑盒購自美國BD公司，RNasin與PI購自美國sigma公司，蘇木購自山西省藥材公司。儀器美國B-D公司的流式細(xì)胞檢測儀型號(hào)FACSCalibur，日本投射式電子顯微鏡。所使用的藥物為本發(fā)明所述的提取物灌注液。以人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3作為耙細(xì)胞，通過繪制生長曲線觀察PGF對(duì)細(xì)胞增殖的影響，電鏡觀察細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)差異，流式檢測細(xì)胞的凋亡作用及周期阻滯。方法1、稱取1000克粉碎后的蘇木，2、加入4000克的純化水，室溫下浸泡12-24小時(shí)，3、煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；再加入3000克的純化水并煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；再加入3000克的純化水并煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液;合并三次得到的提取液,減壓濃縮至1500克，4、將濃縮液在-2(TC下冷凍結(jié)冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀，5、上步驟得到的濃縮液再加熱煮沸，然后將其在-2(TC下冷凍結(jié)冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀，6、上步驟得到的濃縮液再加熱煮沸，然后將其在-2(TC下冷凍結(jié)冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀然后加熱濃縮得到最后的蘇木提取濃縮液1000克。結(jié)果及結(jié)論結(jié)果(1):將SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)，選兩瓶SKOV3細(xì)胞分對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組的藥物濃度為50ng/ml，藥物作用16小時(shí)后，消化收集于EP管中，離心1000轉(zhuǎn)/5分，棄上清。放入戊二醛固定液中4。C固定1小時(shí)，將團(tuán)塊取出，整塊再放入固定液中1小時(shí)，之后將團(tuán)塊放入緩沖液中，常規(guī)電鏡包埋，切片，觀察細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)。如圖3左側(cè)圖所示意，經(jīng)臺(tái)盼蘭染色后，光鏡下見細(xì)胞胞質(zhì)減少，核固縮、深染，電鏡下見染色質(zhì)凝集成新月形緊貼與核膜周邊，核膜結(jié)構(gòu)不清，細(xì)胞核碎裂，呈團(tuán)塊狀或顆粒狀，可見凋亡小體形成。結(jié)果(2)細(xì)胞計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞生長曲線取對(duì)數(shù)生長期SKOV3細(xì)胞，消化、加入RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1X10Vml,分別接種于9個(gè)25ml培養(yǎng)瓶，每瓶3ml。培養(yǎng)24小時(shí)使細(xì)胞貼壁。24小時(shí)后，其中一瓶為對(duì)照不加PGF，其余每瓶加入0.6mlPGF，從上午九點(diǎn)開始每小時(shí)消化一瓶細(xì)胞、離心1000轉(zhuǎn)/5分、臺(tái)盼蘭染色，計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，每瓶細(xì)胞計(jì)數(shù)三次，取三次的平均值，繪制生長曲線。見圖4細(xì)胞計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞生長曲線從九點(diǎn)至十七點(diǎn)計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)結(jié)果見下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>SKOV3細(xì)胞在同一藥物濃度下隨作用時(shí)間的延長死亡率明顯升高。結(jié)果(3),如圖5所示意，電鏡觀察顯微結(jié)構(gòu)左側(cè)對(duì)照組細(xì)胞體積較大，核大，核仁明顯，染色質(zhì)粗細(xì)不一，部分核呈空泡，核分裂多見，核膜結(jié)構(gòu)清晰。右側(cè)實(shí)驗(yàn)組部分細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮成塊狀，有些染色質(zhì)聚集在核膜邊緣或貼近核膜，染色質(zhì)逐漸發(fā)生斷裂，部分核膜逐漸崩解，有些染色質(zhì)呈分葉狀或形成粗細(xì)不均勻的碎塊并相互分離，不均勻的分散于細(xì)胞質(zhì)中，有些細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡，呈現(xiàn)出凋亡的典型變化。結(jié)果(4)，流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布情況選用生長良好的細(xì)胞加入PGF液，使?jié)舛确謩e達(dá)到0，25ug/ml,50ug/ml，100ug/ml，200ug/ml加藥后培養(yǎng)19小時(shí)，消化收集細(xì)胞，離心(1000轉(zhuǎn)/4分)PBS洗兩次，尼龍篩過濾成單細(xì)胞懸液，加入凋亡試劑AnnexinV-FITC避光十五分后上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡情況。另選一組細(xì)胞，分別加入PGF,使藥物濃度分別達(dá)到0，25ug/ml，50ug/ml，100ug/ml，200ug/ml。加藥后培養(yǎng)16h，胰酶消化收集細(xì)胞，冰預(yù)冷PBS洗滌兩次，2ml70。/。冷乙醇固定過夜。PBS洗滌，過濾，10ug/mlRNAase室溫孵育15分，加入濃度為50ug/ml的PI避光染色15分，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布。細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布流式分析結(jié)果顯示PGF能使細(xì)胞發(fā)生凋亡和阻止，25ug/ml,50ug/ml，100ug/ml,200ug/ml的PGF處理SKOV3細(xì)胞后隨著藥物濃度的升高，細(xì)胞的生長逐漸受到抑制，凋亡率明顯增加；^期細(xì)胞明顯增加，S期細(xì)胞明顯減少，與對(duì)照組相比，差異顯著。不同濃度PGF作用于SKOV3細(xì)胞后，均有細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，且隨藥物濃度的增加凋亡率增加平行對(duì)照組早期凋亡率0.93%，晚期凋亡率2.73%，總凋亡率為3.66%。25ug/ml組早期凋亡率2.97%，晚期凋亡率6.55%，總凋亡率為9.52°/。。50ug/ml早期凋亡率1.69°/。，晚期凋亡率8.71%，總凋亡率為10.40%。100ug/ml早期凋亡率7.57%，晚期凋亡率30.93%，總凋亡率為38.50%。200ug/ml早期凋亡率10.35%,晚期凋亡率60.73%，總凋亡率為71.08%。體外培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)不同濃度的PGF處理后，細(xì)胞生長明顯受到抑制。流式細(xì)胞儀分析證實(shí)細(xì)胞凋亡率隨PGF濃度的增高而增加。結(jié)果見下表及附圖6:<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>體外培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)不同濃度的PGF處理后，細(xì)胞生長明顯受到抑制。流式細(xì)胞儀分析證實(shí)細(xì)胞周期的G1期隨PGF濃度的增高而增加。見下表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明未加PGF的對(duì)照組，卵巢癌細(xì)胞生長良好，加入不同劑量PGF對(duì)SK0V3細(xì)胞的生長都具有明顯的抑制作用，PGF具有顯著抑制SK0V3細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡作用。流式檢測細(xì)胞凋亡率其對(duì)卵巢癌細(xì)胞的殺傷作用是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑實(shí)現(xiàn)的。并且隨著藥物濃度的增加細(xì)胞的早及中晚期凋亡率都明顯升高，以中晚期凋亡最為明顯，在低劑量濃度下早期凋亡率的改變不明顯，只有中晚期凋亡率變化較大，在高劑量濃度下早期凋亡增加，但其幅度遠(yuǎn)小于中晚期凋亡。對(duì)照組凋亡率與實(shí)驗(yàn)組凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞周期的檢測顯示卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3對(duì)蘇木素具有藥物敏感性，其對(duì)卵巢癌細(xì)胞的殺傷作用可能和抑制細(xì)胞的DNA合成有關(guān)。Gl期即為DNA合成前期，為進(jìn)入S期準(zhǔn)備必要的基本條件，其中最主要的是RNA和蛋白質(zhì)的合成。Gl期隨著藥物濃度的增加而增加，說明PGF對(duì)細(xì)胞的作用主要在于抑制細(xì)胞的DAN合成前期。圖1為本提取液的紫外光燈(365nm)下薄層檢視圖象(從左到右依次為l樣品l、2蘇木對(duì)照藥材、3樣品2、4陰性、5樣品3、6陰性、7樣品1、8蘇木對(duì)照藥材、9樣品2、10樣品3)圖2為日光下檢視圖譜象圖3為實(shí)驗(yàn)組PGF培養(yǎng)30分和對(duì)照組PBS培養(yǎng)30分對(duì)比照片圖4生長曲線圖5左為正常生長的卵巢癌細(xì)胞照片，右為經(jīng)過本發(fā)明提取物處理后的卵巢癌細(xì)胞照片圖6a為對(duì)照組，圖6b為25ug/ml組，圖6c為50ug/ml組，圖6d為100ug/ml組，圖6e為200ug/ml組圖7為本發(fā)明藥物與各類抗癌藥物體外對(duì)臨床病例膀胱癌患者細(xì)胞的藥敏對(duì)比實(shí)驗(yàn)具體實(shí)施例方式實(shí)施例l，一種具有抗腫瘤功能的灌洗液的制備方法，步驟包括，1、稱取1000克粉碎后的蘇木，原料藥物必須確定品種及來源，干燥，粉碎成直徑1-2毫米長1-3厘米碎塊，2、加入3000克的純化水，室溫下浸泡12-24小時(shí)，3、煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；再加入2000克的純化水并煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；再加入2000克的純化水并煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；合并三次得到的提取液，減壓濃縮至1000克，4、將濃縮液在-2(TC下冷凍結(jié)冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀，5、上步驟得到的濃縮液再加熱煮沸，然后將其在-2(TC下冷凍結(jié)冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀，6、上步驟得到的濃縮液再加熱煮沸，然后將其在-2(TC下冷凍結(jié)冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀然后加熱濃縮得到蘇木提取濃縮液700克。7、再減壓濃縮得到固體干燥物，可以作為藥物成品用注射用水稀釋后作為臨床使用。實(shí)施例2，一種具有抗腫瘤功能的灌洗液的制備方法，步驟包括，1、稱取1000克粉碎后的蘇木，原料藥物必須確定品種及來源，干燥，粉碎成直徑1-2毫米長1-3厘米碎塊，2、加入4000克的純化水，室溫下浸泡12-24小時(shí)，3、煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；再加入3000克的純化水并煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；再加入3000克的純化水并煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；合并三次得到的提取液，減壓濃縮至1500克，4、將濃縮液在-2(TC下冷凍結(jié)冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀，5、上步驟得到的濃縮液再加熱煮沸，然后將其在-2crc下冷凍結(jié)冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀，6、上步驟得到的濃縮液再加熱煮沸，然后將其在-20'C下冷凍結(jié)冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀然后加熱濃縮得到濃蘇木提取濃縮液1000克。7、再加純化水4000ml，灌裝，每瓶裝40ml，充填氮?dú)馊鄯猓?15'C高壓滅菌60分鐘。實(shí)施例3，一種具有抗腫瘤功能的灌洗液的制備方法，步驟包括，1、稱取1000克粉碎后的蘇木，原料藥物必須確定品種及來源，干燥，粉碎成直徑1-2毫米長1-3厘米碎塊，2、加入3500克的純化水，室溫下浸泡12-24小時(shí)，3、煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；再加入2500克的純化水并煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；再加入2500克的純化水并煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；合并三次得到的提取液，減壓濃縮至1200克，4、將濃縮液在-2(TC下冷凍結(jié)冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀，5、上步驟得到的濃縮液再加熱煮沸，然后將其在-20。C下冷凍結(jié)冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀，6、上步驟得到的濃縮液再加熱煮沸，然后將其在-2(TC下冷凍結(jié)冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀然后加熱濃縮得到蘇木提取濃縮液850克。7、減壓濃縮，干燥，滅菌，分裝。使用時(shí)以4(TC注射用水配制成含量為0.2%的溶液使用。權(quán)利要求1、一種具有抗腫瘤功能的灌洗液的制備方法，其特征在于步驟包括，(1)、稱取一定量粉碎后的蘇木，(2)、加入3-5倍量的純化水，室溫下浸泡12-24小時(shí)，(3)、煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；再加入2-3倍量的純化水并煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；再加入2-3倍量的純化水并煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；合并三次得到的提取液，減壓濃縮至加水總量的12-16％，(4)、將濃縮液在-20℃下冷凍結(jié)冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀，(5)、上步驟得到的濃縮液再加熱煮沸，然后將其在-20℃下冷凍結(jié)冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀，(6)、上步驟得到的濃縮液再加熱煮沸，然后將其在-20℃下冷凍結(jié)冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀并加熱濃縮最后得到加水總量10％的蘇木提取濃縮液。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗腫瘤功能的灌洗液的制備方法，其特征在于步驟包括，(1)、稱取一定量粉碎后的蘇木，(2)、加入4倍量的純化水，室溫下浸泡12-24小時(shí)，(3)、煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；再加入3倍量的純化水并煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；再加入3倍量的純化水并煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；合并三次得到的提取液，減壓濃縮至加水總量的15%，(4)、將濃縮液在-2(TC下冷凍結(jié)冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀，(5)、上步驟得到的濃縮液再加熱煮沸，然后將其在-2(TC下冷凍結(jié)冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀，(6)、上步驟得到的濃縮液再加熱煮沸，然后將其在-2(TC下冷凍結(jié)冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀并加熱濃縮最后得到加水總量10%的蘇木提取濃縮液。全文摘要本發(fā)明涉及一種蘇木提取物的制備方法，具體為一種具有抗腫瘤功能的灌洗液的制備方法。解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的具有特定效果的蘇木提取的問題。步驟包括，稱取一定量粉碎后的蘇木，加入3-5倍量的純化水，室溫下浸泡12-24小時(shí)，煮沸30分鐘分離出提取液；再加入水并煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；再純化水并煮沸保持30分鐘提取，然后分離出提取液；合并三次得到的提取液，減壓濃縮至加水總量的12-16％，將濃縮液在-20℃下冷凍結(jié)冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀，上步驟得到的濃縮液再加熱煮沸，然后將其在-20℃下冷凍結(jié)冰，然后取出在室溫下自然融化，過濾去掉沉淀。得到的產(chǎn)物具有顯著的抗腫瘤效果。文檔編號(hào)A61P35/00GK101683380SQ20091007434公開日2010年3月31日申請(qǐng)日期2009年5月11日優(yōu)先權(quán)日2009年5月11日發(fā)明者任連生,蕻張,王國平申請(qǐng)人:山西省腫瘤醫(yī)院