專利名稱：一種低免疫原性葡激酶突變體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種免疫原性顯著降低的葡激酶突變體及其制備方法和應(yīng)用，屬于生 物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
天然葡激酶(staphylokinase，Sak)是來源于金黃色葡萄球菌的一種蛋白質(zhì)，由 136個氨基酸組成。Sak是一“間接型”纖溶酶原激活劑，它不能直接使纖溶酶原(Plg)轉(zhuǎn) 變?yōu)槔w溶酶(plasmin，Plm)，而是先與纖溶酶原按1 1比例結(jié)合形成無活性的復(fù)合物 Sak *plg，繼之在少量纖溶酶啟動下，纖溶酶原活性部位暴露，由單鏈變?yōu)殡p鏈的纖溶酶，形 成活性Sak-plm復(fù)合物，后者進一步激活纖溶酶原分子，使之轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶，纖溶酶溶解血 栓基質(zhì)纖維蛋白從而溶解血栓。在血漿中，Sak ·ρ1πι很快被α 2_抗纖溶酶抑制，不激活纖溶 系統(tǒng)；有血栓存在時Sak ·plm復(fù)合物與血栓中的纖維蛋白結(jié)合，α 2_抗纖溶酶對Sak-plm 復(fù)合物的抑制速度會下降100倍。臨床研究結(jié)果表明，它與美國治療急性心肌梗塞的標準 溶栓藥物阿特普酶有等同的溶栓療效，且葡激酶激活纖溶酶原的纖維蛋白特異性更強(Collen D. et al. NatureMedicine. 4. 279484(1998))。盡管葡激酶在臨床上表現(xiàn)出諸多優(yōu)點，但是它還存在明顯的缺點。葡激 酶是異體蛋白，在人體內(nèi)會產(chǎn)生免疫反應(yīng)，產(chǎn)生高滴度的中和抗體，甚至?xí)l(fā)生超敏反應(yīng)。 因此，降低葡激酶的免疫原性，已經(jīng)成為將其廣泛應(yīng)用于臨床亟待解決的問題。研究表明， Sak存在三個互不重疊的B細胞抗原決定簇，抗原表位1包括K74，E75，R77，抗原表位3包 括K35，E38，E80, E82，抗原表位2尚無具體定位，可能是一些與二聚體形成相關(guān)。Petra A.M.等對^kSTAR的T細胞表位進行了分析，篩選得到了 6個不同的免疫原性區(qū)域，其中 Sak的71-87氨基酸序列(C3區(qū))可刺激90%的T淋巴細胞克隆的特異性增殖(Warmerdam P. A. ,et al. J. Immunol.，2002，168 :155-161)。進一步研究發(fā)現(xiàn) C3 區(qū)肽段包含 Sl (72-82) 和S2 (75-8 二個重疊的T細胞表位序列，其中Y73、F76、L81位氨基酸為表位關(guān)鍵氨基 酸，將它們替換為A，則肽段Si、S2與HLA-DR的結(jié)合能力下降，但是葡激酶活性喪失；而將 該肽段中R77、E80替換為A，計算機擬合結(jié)果顯示S1、S2與HLA-DR相互作用的能量大為減 少，但活性僅維持在野生型葡激酶的50%左右(Petra A M et al. Thromo Heamonst,2002 ； 87(4) :666-673)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種免疫原性明顯降低同時又保留其纖溶活性的葡激酶突 變體及其制備方法。本發(fā)明的目的還在于提供一種所述葡激酶突變體在制備治療血栓栓塞疾病藥物 中的應(yīng)用。本發(fā)明的構(gòu)思是這樣的本發(fā)明選擇葡激酶第77位精氨酸(簡寫為R77)與第80 位的谷氨酸(簡寫為E80)作為突變位點，將它們分別替換為其它合適的氨基酸，希望所構(gòu)建的突變體的免疫原性大大降低，同時保留葡激酶的纖溶活性。具體地，本發(fā)明設(shè)計的突變 體&ik(R77N)是將野生型Sak的R77替換為天冬酰氨(簡寫為N)，或者&ik(R77K)是將野 生型Sak的R77替換為賴氨酸(簡寫為K)，Sak(R77Q)是將野生型Sak的R77替換為谷氨 酰氨(簡寫為Q) ；Sak(ESOA)是將野生型Sak的E80替換為丙氨酸(簡寫為A)，Sak(ESOS) 是將野生型Sak的E80替換為絲氨酸(簡寫為幻；Sak(R77K/E80A)是將野生型Sak的R77 和E80分別替換為K和A，Sak(R77K/E80S)是將野生型Sak的R77和E80分別替換為K和 S, Sak (R77N/E80A)是將野生型Mk的R77和E80分別替換為N和A，Sak (R77N/E80S)是將 野生型Mk的R77和E80分別替換為N和S，Sak (R77Q/E80A)是將野生型Mk的R77和E80 分別替換為Q和A，Sak(R77Q/E80S)是將野生型Sak的R77和E80分別替換為Q和S。本發(fā)明所述的低免疫原性葡激酶突變體的制備方法包括以下步驟(1)本發(fā)明選擇R77與E80作為突變位點，將R77分別突變?yōu)镹、K、Q，E80分別突變 為A、S,構(gòu)建兩個位點的單位點突變體和雙位點突變體，既去除葡激酶的T細胞抗原表位， 同時也去除其B細胞抗原表位，達到降低葡激酶的免疫原性的目標；(2)根據(jù)步驟⑴設(shè)計Sak突變體的分子結(jié)構(gòu)，并以野生型Mk的表達質(zhì)粒 PBV-Sak為模板，使用突變引物進行PCR擴增，直接得到表達質(zhì)粒，擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌， 篩選獲得Sak突變體的表達質(zhì)粒，核苷酸序列分析驗證是否發(fā)生預(yù)計位置的突變；(3) Sak突變體的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細胞得到各個突變體的工程菌，所使用的細 胞為大腸桿菌，菌株可以是DH5 α、JF1125、JM109、BL21等；通過升高培養(yǎng)溫度可以誘導(dǎo) Sak(R77Q), Sak (R77K), Sak(R77N), Sak (Ε80Α), Sak (E80S), Sak (R77N, Ε80Α)，Sak(R77N, E80S)，Sak (R77K, Ε80Α)，Sak (R77K, E80S)，Sak (R77Q, Ε80Α)，Sak (R77Q, E80S)突變體基因 的表達，表達產(chǎn)物以胞內(nèi)可溶性蛋白的形式存在； (4)發(fā)酵技術(shù)以M9CA培養(yǎng)基培養(yǎng)Sak突變體工程菌，發(fā)酵參數(shù)為溫度30_42°C， PH = 6. 5-7. 5，溫度30°C時培養(yǎng)菌體，在42°C時誘導(dǎo)表達目的蛋白；(5) Sak突變體工程菌發(fā)酵后離心收集菌體，超聲破碎菌體，離心，收集細菌裂解 液，用陽離子離子交換和凝膠過濾色譜法純化產(chǎn)品，色譜方法的順序為陽離子交換色譜、分 子篩色譜和陰離子交換色譜，冷凍干燥后得到產(chǎn)品。(6)與野生型Sak性質(zhì)比較表明，除Sak(R77N)突變體纖溶活性明顯降低外，其它 突變體的纖溶活性與野生型相當(dāng)或活性略有升高；將野生型Sak及其突變體免疫BALB/c小 鼠，測定小鼠體內(nèi)的IgG抗體水平，發(fā)現(xiàn)突變體誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗體的水平明顯下降，并且各 個突變體與野生型Sak所誘導(dǎo)抗體的結(jié)合能力明顯下降，表明突變后葡激酶的B細胞表位 得到了部分去除；進一步研究各個突變體刺激小鼠T淋巴細胞的增殖能力發(fā)現(xiàn)，與野生型 Sak相比，各個突變體刺激小鼠T淋巴細胞的增殖能力明顯下降，表明突變后葡激酶的T細 胞表位得到了部分去除；以上結(jié)果表明對R77與E80進行定點突變，將R77分別突變?yōu)镹、K、 Q，E80分別突變?yōu)锳、S,構(gòu)建兩個位點的單位點突變體和雙位點突變體，既去除了葡激酶的 T細胞抗原表位，同時也去除了其B細胞抗原表位，達到了降低葡激酶的免疫原性的目標。本發(fā)明取得的積極效果如下本發(fā)明使用PCR方法直接構(gòu)建所述葡激酶突變體的 表達，方法簡練；本發(fā)明所述的葡激酶突變體可以在大腸桿菌中得到高效表達，并且可以通 過連續(xù)的三步色譜層析高效純化出高純度目的蛋白；本發(fā)明所述的葡激酶突變體體外溶解 血栓主要基質(zhì)纖維蛋白的纖溶活性基本保持了野生型葡激酶纖溶活性，而且體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體的水平明顯下降，免疫原性顯著降低。


圖1為野生型Sak及各突變體在Balb/c小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的特異性抗體的相對量比 較(以野生型Mk誘導(dǎo)血清的吸光度值為100%，各個突變體的相對吸光度為各個突變體誘 導(dǎo)抗體的吸光度值與野生型Sak誘導(dǎo)血清的吸光度值的比值)。圖2為野生型Sak及其突變體與抗野生型Sak抗體結(jié)合能力的比較。圖3為野生型Sak及其突變體刺激小鼠T淋巴細胞特異性增殖能力的比較。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明。實施例1、突變體的設(shè)計本發(fā)明選擇R77與E80作為突變位點，將它們分別替換為其它合適的氨基酸，希望 所構(gòu)建的突變體的免疫原性大大降低，同時保留葡激酶的纖溶活性。本發(fā)明設(shè)計的突變體 Sak(R77N)是將野生型Sak的R77替換為N，或者&ik(R77K)是將野生型Sak的R77替換為 K，Sak(R77Q)是將野生型Sak的R77替換為Q ；Sak(E80A)是將野生型Sak的E80替換為 A，Sak(E80S)是將野生型Sak的E80替換為S ；Sak (R77K/E80A)是將野生型Sak的R77和 E80分別替換為K和A，Sak(R77K/E80S)是將野生型Sak的R77和E80分別替換為K和S， Sak (R77N/E80A)是將野生型Mk的R77和E80分別替換為N和A，Sak (R77N/E80S)是將野 生型Sak的R77和E80分別替換為N和S, Sak (R77Q/E80A)是將野生型Sak的R77和E80 分別替換為Q和A，Sak(R77Q/E80S)是將野生型Sak的R77和E80分別替換為Q和S。2、Sak突變體基因及原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建應(yīng)用基于PCR反應(yīng)原理的定點突變技術(shù)，以含野生型Sak基因的表達質(zhì)粒載體 PBV-Sak為模板，利用完全互補的含突變堿基的引物擴增表達載體，然后用Dpn I酶切消化 甲基化的模板DNA(PCR產(chǎn)物的線性載體不含甲基化位點，因而不被Dpn I酶消化)后直接 轉(zhuǎn)化處于感受態(tài)的大腸桿菌DH-5 α (由常規(guī)分子生物學(xué)方法制備)，選擇重組子接種含有 50-100mg/ml AMP的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)酶切鑒定和核苷酸序列分析證實已發(fā) 生設(shè)計的突變，序列分析由大連寶生物生物技術(shù)公司完成。所述寡核苷酸突變引物由上海生工生物工程公司合成。所述寡核苷酸突變引物的序列如下Sak(R77N)引物 1 :5’ -AGCATATAAAGAGTTTAACGTAGTTGAGCTCGATCCAAGCGCAAAG-3，；引物 2 5 ’ -CTTTGCGCTTGGATCGAGCTCAACTACGTTAAACTCTTTATATGCT-3 ’Sak(R77Q)引物 1 :5’ -AGCATATAAAGAGTTTCAGGTAGTTGAGCTCGATCCAAGCGCAAAG-3，；引物 2 :5’ -CTTTGCGCTTGGATCGAGCTCAACTACCTGAAACTCTTTATATGCT-3，；Sak (R77K)引物 1 :5’ -AGCATATAAAGAGTTTAAAGTAGTTGAGCTCGATCCAAGCGCAAAG-3，；
引物2 :5’-CTTTGCGCTTGGATCGAGCTCAACTACTTTAAACTCTTTATATGCT-3，；
Sak(E80A)
引物1 :5’-GAGTTTAGAGTAGTTGCTTTAGATCCAAGCGCTAAGATCGAAGTCAC-3’ ；
引物2 :5’-GTGACTTCGATCTTAGCGCTTGGATCTAAAGCAACTACTCTAAACTC-3 ；
Sak(E80S)
引物1 :5’-GAGTTTAGAGTAGTTTCTTTAGATCCAAGCGCTAAGATCGAAGTCAC-3’ ；
引物2 :5’-GTGACTTCGATCTTAGCGCTTGGATCTAAAGAAACTACTCTAAACTC-3’ ；
Sak(R77N,E80A)
引物1 :5’-GCATATAAAGAGTTTAACGTAGTTGCTTTAGATCCAAGCGCTAAGATCGAAGTC--3，；
引物2 :5’-GACTTCGATCTTAGCGCTTGGATCTAAAGCAACTACGTTAAACTCTTTATATGC--3，；
Sak(R77N,E80S)
引物1 :5’-GCATATAAAGAGTTTAACGTAGTTTCTTTAGATCCAAGCGCTAAGATCGAAGTC--3，；
引物2 :5’-GACTTCGATCTTAGCGCTTGGATCTAAAGAAACTACGTTAAACTCTTTATATGC--3，；
Sak(R77Q,E80A)
引物1 :5’-GCATATAAAGAGTTTCAGGTAGTTGCTTTAGATCCAAGCGCTAAGATCGAAGTC--3，；
引物2 :5’-GACTTCGATCTTAGCGCTTGGATCTAAAGCAACTACCTGAAACTCTTTATATGC--3，；
Sak(R77Q,E80S)
引物1 :5’-GCATATAAAGAGTTTCAGGTAGTTTCTTTAGATCCAAGCGCTAAGATCGAAGTC--3，；
引物2 :5’-GACTTCGATCTTAGCGCTTGGATCTAAAGAAACTACCTGAAACTCTTTATATGC--3，；
Sak(R77K,E80A)
引物1 :5’-GCATATAAAGAGTTTAAAGTAGTTGCTTTAGATCCAAGCGCTAAGATCGAAGTC--3，；
引物2 :5’-GACTTCGATCTTAGCGCTTGGATCTAAAGCAACTACTTTAAACTCTTTATATGC--3，；
Sak(R77K,E80S)
引物1 :5’-GCATATAAAGAGTTTAAAGTAGTTTCTTTAGATCCAAGCGCTAAGATCGAAGTC--3，；
引物2 :5’-GACTTCGATCTTAGCGCTTGGATCTAAAGAAACTACTTTAAACTCTTTATATGC--3，；
用上述篩選得到的突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5a，含有50-100mg/ml AMP的LB平
板篩選得到工程菌單克隆，單克隆接種搖瓶中的M9CA (Na2HPO4, KH2PO4, NaCl，MgSO4,葡萄糖， 酷蛋白水解物)液體培養(yǎng)基，首先在30°C用培養(yǎng)，后經(jīng)升溫到42°C誘導(dǎo)表達，18% SDS-PAGE 分析表達產(chǎn)物，經(jīng)考馬斯亮蘭染色，可見誘導(dǎo)后細菌裂解液在分子量約15. 5kD處有一濃集 條帶。取部分細菌裂解液滴于酪蛋白凝膠平板的小孔中，37°C孵育數(shù)小時，有明顯的溶圈， 可見表達產(chǎn)物具有纖溶活性。菌體經(jīng)超聲破碎后，突變體表達產(chǎn)物的15. 5kD條帶主要位于 上清中，說明突變體的表達產(chǎn)物以胞內(nèi)可溶形式存在。3、工程菌的誘導(dǎo)表達使用搖瓶篩選Sak(R77Q), Sak(R77K), Sak(R77N), Sak(E80A), Sak (E80S), Sak(R77Q, E80A)，Sak(R77Q, E80S)，Sak(R77K, E80A)，Sak(R77K, E80S)，Sak (R77N, E80A)， Sak (R77N, E80S)的高表達菌株作為工程菌，然后以2L發(fā)酵搖瓶于M9CA中進行低密度發(fā)酵， 30°C培養(yǎng)菌體，至OD6tltl值為1. 5時，42°C溫度誘導(dǎo)3小時，離心收集菌體，PBS洗滌后，-70 V
保存待用。2L發(fā)酵液得菌體15g左右，濕菌用PBS緩沖液按1 20 (W/V)重懸，超聲波破碎儀破碎，功率400W，每次20min循環(huán)破碎，共破碎3次。顯微鏡鏡檢確定細胞破碎完全。細胞 裂解液離心后收集上清。4、重組蛋白的分離純化SP-Sepharose FF層析柱(5. O X 30cm)先后用 10 倍柱床體積 0. IM pH5. 6NaAc_HAc 和0. 02M pH5. 6NaAc-HAc緩沖液平衡。將步驟3收集的上清液用0. 02M乙酸調(diào)pH至5. 6， 樣品以 5ml/min 流速上樣，0. 02M pH 5. 6NaAc_HAc 洗脫至基線，以 0. 02M pH 5. 6NaAc_HAc、 0-0. 3mol/L NaCl進行連續(xù)梯度洗脫，分部收集洗脫組分，18% SDS-PAGE鑒定目的蛋白分 布，合并含目的蛋白收集液，并將收集液的pH用0. 2M NA2HPO4調(diào)至7. 5 8. 5。用10 倍柱床體積 0. OlM Tris-HCl (pH8. 5)緩沖液平衡 S^hadex G-50 層 析柱O.5X100cm)，以3ml/min速度將上述調(diào)整好pH的收集液加入層析柱，0. OlM Tris-HCl (pH8. 5)緩沖液洗脫，流速3ml/min。分部收集洗脫組分，18% SDS-PAGE鑒定目的 蛋白分布，合并含目的蛋白收集液。Q-Sepharose FF層析柱(2. 5 X 30cm)，用 4-5 倍柱床體積的 0. 02M NaOH 除菌后，先 后用10倍柱床體積0. 2M TriS-HCl (ρΗ8· 5)和0. OlM Tris-HCl (ρΗ8· 5)緩沖液平衡；樣品以 ^il/min流速上樣，0. OlM Tris-HCl (pH8. 5)洗脫至基線，洗脫液中NaCl濃度分別為0. 05M, 0. ΙΟΜ,Ο. 20Μ，IM進行步進式梯度洗脫，收集含蛋白質(zhì)組分；HD-4電腦核酸蛋白監(jiān)測儀監(jiān)測 蛋白峰；SDS-PAGE分析收集組分目的蛋白分布，合并含目的蛋白的收集液。并以Bradford 法(Bio-Rad)測定蛋白濃度。純化后的目的蛋白分裝，冷凍干燥即為產(chǎn)品。5、樣品純度測定凍干的蛋白樣品進行18% SDS-PAGE，考馬斯亮蘭R-250染色，上樣10μ g蛋白為 單帶；凍干的蛋白樣品復(fù)溶后稀釋為1.0mg/ml，HPLC分析純度均達到97%以上。6、生物活性測定纖維蛋白平板溶圈法測定各葡激酶突變體的纖溶活性，主要過程如下瓊脂糖溶 于0. 02M pH 7. 4PB，加熱溶解，冷卻至60°C后與纖維蛋白原和凝血酶溶液混合，加入Ne^3* 纖溶酶原，混勻，澆灌于平板上。凝膠形成后用打孔器打直徑3-4mm小孔。在各孔中加等體 積葡激酶標準品或樣品，37°C濕盒保溫過夜。測定各孔溶圈直徑，以標準品活性的對數(shù)和溶 圈直徑的對數(shù)作標準曲線，計算樣品的活性單位。以Bradford法(Bio-Rad)測定蛋白濃度，計算可知，野生型葡激酶以及各突變體 的比活性如表1所示。表1纖維蛋白凝膠溶圈法測定Sak突變體的體外纖溶活性的結(jié)果樣品比活性(X104U/mg)
野生型Sak8.4
Sak(R77Q)9.4
Sak(R77K)7.8
Sak(R77N)4.6
Sak(E80A)10.9 Sak(E80S)10.1
Sak(R77N, E80A)7.1
Sak(R77N, E80S)7.1
Sak(R77K, E80A)8.7
Sak(R77K, E80S)10.3
Sak(R77Q, E80A)8.1
Sak(R77Q, E80S)10.2實驗結(jié)果表明，纖維蛋白是血栓的主要基質(zhì)，除&ik(R77N)纖溶活性明顯降低， Sak(R77N, E80A)、Sak(R77N, E80S)的纖溶活性略有降低外，其余突變體溶解纖維蛋白的活 性相當(dāng)或者優(yōu)于野生型葡激酶，說明它們的纖溶活性至少與野生型葡激酶相當(dāng)。7、野生型Sak及各突變體誘導(dǎo)Balb/c小鼠產(chǎn)生特異性抗體的能力60只6-8周的Balb/c小鼠隨機分成12組，每組5只。采用腹腔注射的方法，分別注 射(10μ g/200y 1)野生型 Sak, Sak (R77Q), Sak (R77K), Sak (R77N), Sak (E80A), Sak (E80S)， Sak(R77N, E80A)，Sak(R77N, E80S)，Sak(R77K, E80A)，Sak(R77K, E80S)，Sak(R77Q, E80A)， Sak(R77Q, E80S)，初次免疫記為第0天，以后在第14天和第28天進行加強免疫。第35天 取血，將制備好的血清分裝，-20°C保存。間接ELISA法分析野生型Sak及各突變體在小鼠體內(nèi)的抗體水平將野生型Sak 及各突變體樣品用包被緩沖液稀釋至ι μ g/ml, 100 μ 1/孔包被酶標板(每一樣品包被3 個復(fù)孔)，4°C濕盒過夜，PBST洗滌3次(3min/次)。每孔中分別加入封閉液(1 % BSA溶 液)100 μ 1，37°C濕盒溫育2h，PBST洗滌3次(3min/次)。用PBS將陰性小鼠血清和野生 型Sak及各突變體免疫后的小鼠血清分別稀釋5000倍，加入對應(yīng)的包被了野生型Sak及各 突變體的孔中(100μ 1/孔)，37°C濕盒溫育lh，PBST洗滌3次(3min/次)。每孔分別加入1 4000稀釋的HRP標記的大鼠抗小鼠IgG 100 μ 1，37°C濕盒溫育lh，PBST洗滌3次 (3min/次)。加入TMB-過氧化氫脲溶液100 μ 1，避光顯色15min，加入終止液50 μ 1終止 反應(yīng)，在酶標儀上檢測OD45tl值。以野生型Sak誘導(dǎo)血清的吸光度值為100%，各個突變體誘 導(dǎo)抗體的吸光度值與野生型Sak誘導(dǎo)血清的吸光度值比值得到相應(yīng)突變體產(chǎn)生抗體的相 對吸光度值。結(jié)果如附圖1所示，與野生型Sak對比，單位點突變體Mk(R77Q)，Sak(R77K), Sak(R77N)，Sak(E80A)，Sak(E80S)所誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體水平均顯著下降(ρ < 0. 05)， 其中突變體&ik(E80Q誘導(dǎo)的特異性抗體量最少。組合突變體中，Sak(R77Q，E80A)， Sak(R77Q,E80S)誘導(dǎo)的特異性抗體水平明顯降低(ρ < 0. 05)，與突變體Ε80Α、E80S相當(dāng)。8、各突變體與抗野生型Sak抗體反應(yīng)性的比較使用間接ELISA方法分別檢測小鼠抗野生型Sak抗血清與各突變體之間的抗體反 應(yīng)性。野生型Sak及其突變體稀釋到1 μ g/ml，100 μ 1/孔包被96孔板，4°C過夜；次日37°C 封閉池，然后小鼠抗野生型Sak抗血清作1 5000稀釋，加100 μ 1/孔到包被了野生型Mk 及其突變體的96孔板中，37°C溫育Ih ；大鼠抗小鼠IgG-HRP作1 4000稀釋，100 μ 1/孔， 37°C溫育lh。加入顯色液顯色15min后終止，在酶標板上檢測0D450值。結(jié)果如附圖2所示，等量的葡激酶突變體和野生型Sak與相同稀釋度的抗野生型 Sak抗血清反應(yīng)后，除突變體&ik(R77N)，Sak(R77K)，Sak(R77Q)的0D450值比野生型Sak 沒有明顯降低外，其它突變體的0D450值比野生型Sak均有顯著降低(ρ < 0. 05)，表明其 與小鼠抗野生型Sak抗血清的抗體反應(yīng)性顯著下降。這些結(jié)果說明Ε80突變后，葡激酶的 B細胞的抗原表位受到了破壞，而R77突變后葡激酶的B細胞的抗原表位沒有受到破壞。9、野生型Sak及各突變體刺激小鼠的T淋巴細胞特異性增殖的能力拉頸處死小鼠，無菌取脾，研磨制成脾細胞懸液。用RPMI 1840培養(yǎng)液洗滌3次后， 用含100ml/L小牛血清的RPMI1840培養(yǎng)液制成細胞懸液。T淋巴細胞增殖實驗按照如下方 法進行100 μ L濃度為2 X IO6細胞懸液加入96孔板中，每孔中加入100 μ L濃度為0. 1 μ g/ ml的野生型葡激酶或其突變體，陰性對照加入PB緩沖液，陽性對照加入ConA，置37°C 5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時；然后加入10 μ L濃度為5mg/mL的MTT溶液，37°C孵育6小時， 去除上清，沉淀使用二甲基亞砜溶解，測定550nm處吸光度。結(jié)果如附圖3所示，野生型Sak顯示較強的刺激T淋巴細胞增殖能力，單位點突變 體中，Sak(R77N)，Sak(E80A)，Sak(E80S)刺激T淋巴細胞增殖能力與野生型葡激酶相比顯 著下降(P < 0. 05)，尤其Sak(E80S)降低尤為顯著(ρ < 0. 01)。組合突變體中，Sak (R77Q， Ε80Α)，Sak(R77Q, E80S)，Sak(R77K, E80A)，Sak(R77K, E80S)刺激 T 淋巴細胞增殖能力與野 生型葡激酶相比下降均非常顯著(P < 0. 01)，說明這些突變體中的T細胞抗原表位得到了 有效去除。從以上結(jié)果可以看出，所構(gòu)建的突變體中Sak (E80A)，Sak (E80S)，Sak (R77Q， E80A)，Sak(R77Q, E80S)纖溶活性沒有發(fā)生與野生型葡激酶相比相當(dāng)或略有升高，T細胞抗 原表位和B細胞抗原表位得到了去除，在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)抗體的水平與野生型葡激酶相比明 顯下降，免疫原性與野生型葡激酶相比明顯降低。以上實驗證明本發(fā)明所述的葡激酶突變體免疫原性顯著降低，但是溶解血栓的纖 溶活性卻得到了保留，可以用于制備治療血栓栓塞疾病藥物。
9
權(quán)利要求
1.一種低免疫原性葡激酶突變體，其特征在于該突變體Mk (R77N)是將野生型Sak的 R77替換為天冬酰氨(簡寫為N)，或者&ik(R77K)是將野生型Sak的R77替換為賴氨酸(簡 寫為K)，Sak(R77Q)是將野生型Sak的R77替換為谷氨酰氨(簡寫為Q) ；Sak(ESOA)是將野 生型Sak的E80替換為丙氨酸(簡寫為A)，Sak (E80S)是將野生型Sak的E80替換為絲氨酸 (簡寫為S) ；Sak(R77K/E80A)是將野生型Sak的R77和E80分別替換為K和A，Sak(R77K/ E80S)是將野生型Sak的R77和E80分別替換為K和S，Sak (R77N/E80A)是將野生型Sak的 R77和E80分別替換為N和A，Sak (R77N/E80S)是將野生型Sak的R77和E80分別替換為 N 和 S, Sak (R77Q/E80A)是將野生型 Sak 的 R77 和 E80 分別替換為 Q 和 A, Sak (R77Q/E80S) 是將野生型Mk的R77和E80分別替換為Q和S。
2.一種低免疫原性葡激酶突變體的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)選擇R77與E80作為突變位點，將R77分別突變?yōu)镹、K、Q，E80分別突變?yōu)锳、S，構(gòu) 建兩個位點的單位點突變體和雙位點突變體，既去除葡激酶的T細胞抗原表位，同時也去 除其B細胞抗原表位；(2)根據(jù)步驟(1)設(shè)計Sak突變體的分子結(jié)構(gòu)，并以野生型Sak的表達質(zhì)粒pBV-Sak為 模板，使用突變引物進行PCR擴增，直接得到表達質(zhì)粒，擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選獲得 Sak突變體的的表達質(zhì)粒，核苷酸序列分析驗證是否發(fā)生預(yù)計位置的突變；(3)Sak突變體的的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細胞得到各個突變體的工程菌，所使用的細胞為 大腸桿菌，菌株可以是DH5a、JF1125、JM109、BL21等；通過升高溫度可以誘導(dǎo)&ik(R77Q)， Sak(R77K), Sak(R77N), Sak(E80A), Sak(E80S), Sak(R77N, E80A), Sak(R77N, E80S)， Sak (R77K, E80A)，Sak (R77K, E80S)，Sak (R77Q, E80A)，Sak (R77Q, E80S)突變體基因的表達， 表達產(chǎn)物以胞內(nèi)可溶性蛋白的形式存在；(4)發(fā)酵技術(shù)以M9CA培養(yǎng)基培養(yǎng)工程菌，發(fā)酵參數(shù)為溫度30-42°C，pH= 6. 5-7. 5 ； 溫度30°C時培養(yǎng)菌體，在42°C時誘導(dǎo)表達目的蛋白；(5)工程菌發(fā)酵后離心收集菌體，超聲破碎菌體，離心，收集細菌裂解液，用陽離子離子 交換和凝膠過濾色譜法純化產(chǎn)品，色譜方法的順序為陽離子交換色譜、分子篩色譜和陰離 子交換色譜，冷凍干燥后得到產(chǎn)品。
3.一種低免疫原性葡激酶突變體的應(yīng)用，其特征在于用于制備治療血栓栓塞疾病藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種低免疫原性的重組葡激酶突變體的蛋白結(jié)構(gòu)和制備方法。本發(fā)明涉及了低免疫原性的重組葡激酶突變體的分子結(jié)構(gòu)，通過PCR定點突變技術(shù)直接得到重組葡激酶突變體的表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達，破碎菌體，離心收集上清，然后通過連續(xù)三步色譜層析純化出蛋白質(zhì)純品，冷凍干燥后得到產(chǎn)品。所得葡激酶突變體免疫原性顯著降低，但其溶解血栓的纖溶活性卻得到了保留，可以用于制備治療血栓栓塞疾病藥物。
文檔編號A61K38/49GK102108351SQ20091007518
公開日2011年6月29日 申請日期2009年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月19日
發(fā)明者徐瑞光, 賀進田, 賈鍇, 陳希 申請人:河北師范大學(xué)