專利名稱：視磺酸誘導(dǎo)基因Ⅰ及其編碼蛋白介導(dǎo)的信號(hào)通路的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及視磺酸誘導(dǎo)基因I及其編碼蛋白介導(dǎo)的信號(hào)通路的新用途。
背景技術(shù)：
視黃酸誘導(dǎo)基因I (RIG-1 ， Retinoic acid-Inducible Gene-1)最早在視黃 酸誘導(dǎo)分化急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia, APL)中發(fā)現(xiàn) 表達(dá)上調(diào)，并因此得名。人源RIG-I編碼基因(Genbank號(hào)NW—001839149)位于第9 號(hào)染色體，具有18個(gè)外顯子，編碼的蛋白有925個(gè)氨基酸；鼠源RIG-I編碼基因
(Genbank號(hào)麗j72689)位于第4號(hào)染色體，同樣具有18個(gè)外顯子，編碼的蛋白 則有926個(gè)氨基，與人源蛋白相似性達(dá)到81%。 2004年Yoneya腿等人發(fā)現(xiàn)RIG-1 分子在由dsRNA引起抗病毒信號(hào)通路中具有重要作用，從此RIG-1被廣泛認(rèn)為是先 天免疫反應(yīng)中獨(dú)立于TLR (ToU-likeRec印tor)、存在于細(xì)胞胞質(zhì)的dsRNA受體。 RIG-I屬于含DExD/H序列的RNA解旋酶家族，過(guò)表達(dá)后它通過(guò)其自身C端helicase 結(jié)構(gòu)域識(shí)別并結(jié)合病毒的dsRNA，位于C端兩個(gè)串聯(lián)的CARD (caspase recruitment domain)結(jié)構(gòu)域激活I(lǐng)RF3和NF- k B，向下游傳遞信號(hào)，引起下游IFN- e的激活， 從而發(fā)揮其抗病毒的生理功能。RIG-I被敲除后，細(xì)胞受到Sendai Virus、 NDV和 VSV等病毒感染后，不能再產(chǎn)生I型干擾素和炎性因子。
RIG-I除了可以被視黃酸和病毒所誘導(dǎo)，還可以被很多細(xì)胞因子所誘導(dǎo)IL-lb 可以在人的牙齦成纖維細(xì)胞里誘導(dǎo)RIG-1; IFN-y可以在人臍帶靜脈表皮細(xì)胞
(HUVEC)、平滑肌細(xì)胞(SMC)、乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)和膀胱上皮細(xì)胞(T24)中 誘導(dǎo)RIG-I; IFN-a和TNF-a聯(lián)合可以在肺表皮細(xì)胞(A549)中誘導(dǎo)RIG-1。 2005 年，Imaizumi等人報(bào)道LPS可以在表皮細(xì)胞(HUVEC)誘導(dǎo)RIG-1，并且過(guò)表達(dá)RIG-I 可以上調(diào)環(huán)氧化酶2 (cuclooxygenase-2, COX-2)的表達(dá)及激活其啟動(dòng)子區(qū)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供視磺酸誘導(dǎo)基因I及其編碼蛋白介導(dǎo)的信號(hào)通路的 新用途。
本發(fā)明所提供的一種新用途為視磺酸誘導(dǎo)基因I及其編碼蛋白介導(dǎo)的信號(hào)通 路在設(shè)計(jì)和/或篩選藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的另一種新用途為以視磺酸誘導(dǎo)基因I及其編碼蛋白介導(dǎo)的信 號(hào)通路為靶點(diǎn)的物質(zhì)在制備藥物中的應(yīng)用。
其中，所述藥物可為用于預(yù)防和/或治療炎癥相關(guān)疾病的藥物。 所述藥物具體可為用于預(yù)防和/或治療動(dòng)脈粥樣硬化疾病的藥物。 所述藥物具體為用于抑制白細(xì)胞介素-8因子表達(dá)的藥物。
所述以視磺酸誘導(dǎo)基因I及其編碼蛋白介導(dǎo)的信號(hào)通路為靶點(diǎn)的物質(zhì)為核酸。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種以視磺酸誘導(dǎo)基因I及其編碼蛋白介導(dǎo)的信
號(hào)通路為靶點(diǎn)的用于預(yù)防和/或治療炎癥相關(guān)疾病的藥物。
所述藥物的活性成分可為核酸或其它以視磺酸誘導(dǎo)基因I及其編碼蛋白介導(dǎo)
的信號(hào)通路為靶標(biāo)的任意活性成分。
上述任一所述核酸可為抑制所述視磺酸誘導(dǎo)基因I表達(dá)的小干擾RNA、表達(dá)所 述小干擾RNA的載體、表達(dá)抑制所述視磺酸誘導(dǎo)I型基因表達(dá)的shRNA的載體、與 所述視磺酸誘導(dǎo)I型基因發(fā)生同源重組且抑制所述視磺酸誘導(dǎo)I型基因表達(dá)的同 源序列或含有所述同源序列的載體。
上述任一所述shRNA可由莖I 、環(huán)和莖II構(gòu)成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)；所述莖I的序列為 5， AGUGGAAUCACGGAUUAGCTT3，，所述莖II的序列為5， GCUAAUCCGUGAUUCCACU3，； 所述shRNA的編碼DNA為
所述藥物可為用于抑制白細(xì)胞介素-8因子表達(dá)的藥物。 本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種炎癥相關(guān)疾病診斷試劑盒。 本發(fā)明所提供的炎癥相關(guān)疾病診斷試劑盒，包括檢測(cè)視磺酸誘導(dǎo)基因I或該基
因編碼的蛋白表達(dá)水平的物質(zhì)。
檢測(cè)視磺酸誘導(dǎo)基因I或該基因編碼的蛋白表達(dá)水平的物質(zhì)在制備炎癥相關(guān)
疾病診斷試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
其中，所述物質(zhì)可為用于擴(kuò)增視磺酸誘導(dǎo)基因I的RT-PCR引物和/或該基因編
碼蛋白的抗體。
實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明將視磺酸誘導(dǎo)基因I及其編碼蛋白介導(dǎo)的信號(hào)通路作為靶點(diǎn) 得到的藥物，通過(guò)下調(diào)和抑制RIG-I的表達(dá)或抑制和下調(diào)RIG-I信號(hào)通路分子，有 效的抑制了一些與炎癥性疾病相關(guān)的因子的表達(dá)，如IL-8因子，進(jìn)而降低了多種 炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)率和緩解了炎癥性疾病的病情。因此，將RIG-I及其介導(dǎo)的信號(hào)通路作為靶點(diǎn)進(jìn)行一系列炎癥性疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化等的預(yù)防和/或治療，為 藥物開(kāi)發(fā)提供了新思路，將在藥物制備及炎癥性疾病的預(yù)防和/或治療中廣泛應(yīng)用。


圖1為25-羥基膽固醇誘導(dǎo)RIG-1表達(dá)的結(jié)果。 圖2為高糖誘導(dǎo)RIG-I表達(dá)的結(jié)果。
圖3為轉(zhuǎn)染干涉質(zhì)粒的細(xì)胞中RIG-I的蛋白表達(dá)情況，以及干涉RI-1后的細(xì) 胞中RIG-I和IL-8的轉(zhuǎn)錄情況。
圖4為動(dòng)脈粥樣硬化病人外周血中巨噬細(xì)胞和正常人的外周血中巨噬細(xì)胞中 RIG-I的表達(dá)情況。
圖5為RIG-I介導(dǎo)的信號(hào)通路中的分子對(duì)IL-8的影響。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從市面公司購(gòu)買。 HUVEC為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，從離體的新生兒臍帶靜脈中分離得到。 THP-1為人單核細(xì)胞型淋巴瘤細(xì)胞，購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為 TIB-202。
RIG-I為視磺酸I型基因，IL-8為白細(xì)胞介素-8因子，25-HC為25羥基膽固醇。
佛波酯購(gòu)自美國(guó)merck公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為524400; pSUPER載體購(gòu)自美國(guó) OligoEngine公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為VEC-PRT-0001/0002。
實(shí)施例1、 25-羥基膽固醇和高濃度葡萄糖可以誘導(dǎo)RIG-I的表達(dá) (一)在HUVEC中25-HC誘導(dǎo)RIG-I的表達(dá)
從離體的新生兒臍帶靜脈中分離內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC，鋪板24小時(shí)后，用5ug/ml 25-HC (每孔加入5ug 25-HC)進(jìn)行刺激，4h、 8h、 16h、 24h后收樣，分別在RNA 和蛋白水平檢測(cè)RIG-I蛋白的誘導(dǎo)，同時(shí)在RNA水平檢測(cè)IL-8的誘導(dǎo)，以未經(jīng)任
何誘導(dǎo)的細(xì)胞作為對(duì)照。
RIG-1 RNA水平檢測(cè)方法為RT-PCR。
用trizol提取RNA， 反轉(zhuǎn)錄得到cDNA， 再用PCR檢測(cè)RIG-1的表達(dá)。所用引物序列為RIG-I:正義鏈， 5， -TCGGCGTTGGAGATGCTA-3';反義鏈，5， -TGGAAGAAGGCTTTGAGG-3，。結(jié)果如圖1A 所示，表明25-HC可以誘導(dǎo)RIG-I的轉(zhuǎn)錄。RIG-I蛋白水平檢測(cè)方法為western蛋白雜交。提取細(xì)胞總蛋白，SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜然后分步加入一抗二抗， 一抗為RIG-I抗體，購(gòu)自Alexis公司，貨號(hào) 是ALX-804-849。
最后顯色。結(jié)果如圖1B所示，表明25-HC可以誘導(dǎo)RIG-1蛋白 的表達(dá)。
IL-8 RNA水平檢測(cè)方法為RT-PCR。用trizol提取RNA， 反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再 用PCR檢測(cè)RIG-I的表達(dá)。所用引物序列為IL-8:正義鏈，5， TGTGGGTCTGTTGTAGGG 3，，反義鏈，5， GTGAGGTAAGATGGTGGC 3，。結(jié)果如圖1A 所示，表明25-HC可以誘導(dǎo)IL-8的轉(zhuǎn)錄。
以上結(jié)果表明，在HUVEC中，25-HC可以同時(shí)誘導(dǎo)RIG-I和IL-8的轉(zhuǎn)錄。
(二) 用佛波酯誘導(dǎo)單核細(xì)胞THP-1分化成巨噬細(xì)胞 本實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)方法是按照文獻(xiàn)(Optimized THP-1 differentiation is required
for the detection of responses to weak stimuli,Inflammation Research, 1023-3830， E. K, Park)中所述進(jìn)行的THP-1細(xì)胞用1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，佛波 酯類誘導(dǎo)72小時(shí)使THP-l細(xì)胞分化成為巨噬細(xì)胞。THP-1細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基中，加 入佛波酯類6h就開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞有圓形開(kāi)始轉(zhuǎn)變成為多角形，最后得到巨噬 細(xì)胞。
檢測(cè)分化出的巨噬細(xì)胞中的RIG-1和IL-8表達(dá)情況。
RIG-I RNA水平檢測(cè)方法同實(shí)驗(yàn)(一)中一致。結(jié)果如圖1C所示，表明在巨噬 細(xì)胞中，25-HC可以誘導(dǎo)RIG-I的轉(zhuǎn)錄。
RIG-I蛋白水平檢測(cè)方法同實(shí)驗(yàn)(一)中一致。結(jié)果如圖1D所示，表明在巨噬 細(xì)胞中，25-HC可以誘導(dǎo)RIG-I蛋白的表達(dá)。
IL-8 RNA水平檢測(cè)方法同實(shí)驗(yàn)(一)中一致。結(jié)果如圖1C所示，表明在巨噬 細(xì)胞中，25-HC可以誘導(dǎo)IL-8的轉(zhuǎn)錄。
以上結(jié)果表明，在巨噬細(xì)胞中，25-HC可以同時(shí)誘導(dǎo)RIG-I和IL-8的轉(zhuǎn)錄。
(三) 在HUVEC中高糖誘導(dǎo)RIG-I的表達(dá) 從離體的新生兒臍帶靜脈中分離內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC，鋪板12小時(shí)后，用30mM葡
萄糖進(jìn)行刺激，6h、 16h和24h后收樣，分別在RNA和蛋白水平檢測(cè)RIG-I蛋白的 誘導(dǎo)。
RIG-IRNA水平檢測(cè)方法同實(shí)驗(yàn)(一)中一致。結(jié)果如圖2A所示，表明高糖可 以誘導(dǎo)RIG-I的轉(zhuǎn)錄。RIG-I蛋白水平檢測(cè)方法同實(shí)驗(yàn)(一)中一致。結(jié)果如圖2B所示，表明高糖可 以誘導(dǎo)RIG-I蛋白的生成。
以上結(jié)果表明，在HUVEC中，高糖可以同時(shí)誘導(dǎo)RIG-1的表達(dá)。 實(shí)施例2、 RIG-1的表達(dá)與IL-8成正相關(guān) 一、HUVEC中RIG-I的表達(dá)與IL-8的表達(dá)呈正相關(guān) (一)通過(guò)小干擾RNA抑制HUVEC中RIG-I的表達(dá)
1、 干涉質(zhì)粒的構(gòu)建 (1)干涉質(zhì)粒的構(gòu)建
構(gòu)建方法在DNA合成公司合成干涉序列
接至pSUPER載體上，連接的限制性酶切位點(diǎn)是BglII和HindIII，得到重組載體 pSUPER/specific-RNA。
陽(yáng)性質(zhì)粒驗(yàn)證方法通過(guò)用EcoR I和Hind III雙切來(lái)鑒定陽(yáng)性克隆，經(jīng)過(guò) 雙切，陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒可以得到281bp的片段，而陰性克隆則只能得到大約227bp 的克隆。
2、 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
方法通過(guò)磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將重組載體pSUPER/specif ic-RNA轉(zhuǎn)染入HUVEC中。
3、 25 —羥基膽固醇誘導(dǎo)RIG-I.
上述成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后，用25 —羥基膽固醇對(duì)其進(jìn)行刺激，24小 時(shí)后，分別在RNA和蛋白水平檢測(cè)RIG-I蛋白的表達(dá)，同時(shí)在RNA水平檢測(cè)IL-8 的表達(dá)。以未經(jīng)任何轉(zhuǎn)染但經(jīng)同樣刺激的細(xì)胞、轉(zhuǎn)入no-specific-RNA (no-specific-RNA序歹ij: 5， -TTCTCCGAACGUGUCACGTTT-3，)也經(jīng)同樣刺激的細(xì)胞、 未經(jīng)任何轉(zhuǎn)染也未經(jīng)任何刺激的細(xì)胞為對(duì)照。
轉(zhuǎn)入no-specific-RNA序列的實(shí)驗(yàn)步驟同轉(zhuǎn)入干涉質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)步驟相同。 RIG-I RNA和蛋白水平檢測(cè)方法同實(shí)施例1中實(shí)驗(yàn)(一)中所述一致。 IL-8 RNA水平檢測(cè)方法同實(shí)施例1中實(shí)驗(yàn)(一)中所述一致。 RIG-I RNA水平檢測(cè)結(jié)果如圖3B所示，表明經(jīng)RNA干擾后，RIG-I的轉(zhuǎn)錄受到 很好的抑制，幾乎沒(méi)有轉(zhuǎn)錄發(fā)生。
RIG-I蛋白水平檢測(cè)結(jié)果如圖3A所示，表明經(jīng)RNA干擾后，RIG-I蛋白量與 正常細(xì)胞未經(jīng)25 —羥基膽固醇誘導(dǎo)時(shí)的量相同，很低。
IL-8 RNA水平檢測(cè)結(jié)果如圖3B所示，表明經(jīng)RNA干擾后，IL-8的轉(zhuǎn)錄受到很好的抑制，幾乎沒(méi)有轉(zhuǎn)錄發(fā)生；表明RIG-I的轉(zhuǎn)錄水平的降低直接導(dǎo)致IL-8的轉(zhuǎn) 錄水平降低。
圖3中，泳道1表示未經(jīng)任何轉(zhuǎn)染也未經(jīng)任何刺激的細(xì)胞，泳道2表示未經(jīng)任 何轉(zhuǎn)染但經(jīng)25 —羥基膽固醇誘導(dǎo)的細(xì)胞，泳道3表示轉(zhuǎn)入no-specif ic-RNA也經(jīng) 25 —羥基膽固醇誘導(dǎo)的細(xì)胞，泳道4表示成功轉(zhuǎn)染干涉質(zhì)粒并經(jīng)25 —羥基膽固醇誘 導(dǎo)的細(xì)胞
綜上結(jié)果表明，在HUVEC中，RIG-I的表達(dá)受到抑制后，25-羥基膽固醇誘導(dǎo) 的IL-8的表達(dá)也大大降低，RIG-1的轉(zhuǎn)錄水平的降低直接導(dǎo)致IL-8的轉(zhuǎn)錄水平降 低。
二、外周血巨噬細(xì)胞中RIG-1和IL-8的表達(dá)量
從離體的動(dòng)脈粥樣硬化病人的外周血中分離巨噬細(xì)胞、從離體的正常人的外周 血中分離巨噬細(xì)胞，分別提取細(xì)胞全蛋白和RNA，然后分別用RIG-1抗體以及RT-PCR 的方法檢測(cè)RIG-I表達(dá)量，用RT-PCR法檢測(cè)IL-8表達(dá)量。
RT-PCR檢測(cè)RIG-I轉(zhuǎn)錄水平的方法和引物都同實(shí)施例1。結(jié)果如圖4A所示， 第一泳道健康人的RIG-I表達(dá)很低，而標(biāo)號(hào)為"l， 2， 3， 4， 5"的五位病人的RIG-I 表達(dá)明顯偏高。
RT-PCR檢測(cè)IL-8表達(dá)量的方法為同實(shí)施例1。結(jié)果如圖4A所示，第一泳道健 康人的IL-8表達(dá)很低，而標(biāo)號(hào)為"1， 2， 3， 4， 5"的五位病人的IL-8表達(dá)明顯 偏高。
IL-8和RIG-I在所有病人中都比健康人中的表達(dá)偏高，體現(xiàn)一致性。
RIG-I抗體檢測(cè)RIG-1蛋白量的方法同實(shí)施例1， RIG-I抗體購(gòu)自Alexis公司， 貨號(hào)是ALX-804-849。結(jié)果如圖4B所示，第一泳道健康人的RIG-I表達(dá)很低，而 標(biāo)號(hào)為"1， 2， 3， 4， 5"的五位病人的泳道RIG-I表達(dá)明顯偏高。
圖4中，ct表示正常人的外周血中分離的巨噬細(xì)胞，泳道1表示1號(hào)病人樣品， 泳道2表示2號(hào)病人樣品，泳道3表示3號(hào)病人樣品，泳道4表示4號(hào)病人樣品， 泳道5表示5號(hào)病人樣品。
綜上結(jié)果表明，病人巨噬細(xì)胞中無(wú)論在基因水平還是蛋白水平都有高水平的 RIG-I量和IL-8量，而在正常人的外周血巨噬細(xì)胞其含量均很低；在病人中高水平 的RIG-1的含量和高表達(dá)的白介素8 (IL-8)成正比。
綜合實(shí)驗(yàn)一和二表明，抑制RIG-I基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，就可以阻止由RIG-I介
9導(dǎo)的對(duì)IL-8的誘導(dǎo)作用，表明在蛋白水平干預(yù)可以達(dá)到同樣的效果，RIG-I的表達(dá) 量直接影響到IL-8的表達(dá)量，兩者成正相關(guān)，RIG-I是產(chǎn)生IL-8的一個(gè)原因。
實(shí)施例3、 RIG-I介導(dǎo)的信號(hào)通路與IL-8的表達(dá)成正相關(guān)
pc薩3. 1 (-)載體購(gòu)自美國(guó)invitrogene公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為SKU謂55-20;
一、RIG-I介導(dǎo)的信號(hào)通路中的MAVS與IL-8的表達(dá)成正相關(guān)
MAVS是RIG-1介導(dǎo)的信號(hào)通路的下游接頭分子。
1、 MAVS基因的過(guò)表達(dá)可以激活I(lǐng)L-8
MAVS基因(Genbank number NM_020746)的來(lái)源通過(guò)PCR擴(kuò)增得到，模板 是鼠源MEF細(xì)胞的mRNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA，引物序列如下正義引物序列5' CTCGAGATCTGAGCAGCAATGCCGTT 3'，反義引物序列是5' AAGCTTTTCACTAGTGCAGACGCCGC 3'。
用限制性內(nèi)切酶Xho I和Hind III酶切上述擴(kuò)增產(chǎn)物和pcDNA 3. 1 (-)載體， 連接，將MAVS基因插入到pcDNA 3.1 (-)載體的Xho I和Hind III位點(diǎn)，篩選、 驗(yàn)證，得到含有MAVS基因的重組載體pcDNA3. 1 (-) /MAVS。
通過(guò)PEI-HUVEC轉(zhuǎn)染法將重組載體pcDNA3. 1 (-) /MAVS轉(zhuǎn)入HUVEC細(xì)胞中。 同時(shí)以轉(zhuǎn)入空載體pcDNA3. 1 (-)的HUVEC細(xì)胞為對(duì)照，空載體的轉(zhuǎn)入方法與重組 載體pcDNA3. 1 (-) /MAVS的轉(zhuǎn)入方法相同。
用實(shí)施例1中(一)所述方法檢測(cè)IL-8在轉(zhuǎn)入重組載體pcDNA3. 1 (-) /MAVS 的HUVEC細(xì)胞中的表達(dá)情況。
結(jié)果如圖5A所示，轉(zhuǎn)入MAVS基因的HUVEC細(xì)胞中，IL-8的表達(dá)增高；表明， MAVS基因的過(guò)表達(dá)可以激活I(lǐng)L-8。
圖5A中，泳道1表示轉(zhuǎn)入空載體pcDNA3. 1 (-)的HUVEC細(xì)胞，泳道4表示轉(zhuǎn) 入重組載體pcDNA3. 1 (-) /MAVS的HUVEC細(xì)胞。
2、 MAVS基因敲除后可以抑制GR0- a的表達(dá) GR0-a是小鼠體內(nèi)與人IL-8同源的基因。
將鼠源MEF細(xì)胞中MAVS基因敲除，敲除方法按照文獻(xiàn)"MAVS and MyD88 are essential for innate immunity but not cytotoxic T lymphocyte response against respiratory syncytial virus" (VijayG. Bhoj等，PNAS， September 9， 2008， doi: 10. 1073/pnas.0804717105
PNAS S印tember 16， 2008 vol. 105 no. 37 14046-14051)中所述進(jìn)行。用5ug/ml 25-HC (每孔加入5ug 25-HC)進(jìn)行刺激，16h后收樣，進(jìn)行檢測(cè)； 同時(shí)以未進(jìn)行基因敲除的正常鼠源MEF細(xì)胞為對(duì)照。
GRO- a RNA水平檢測(cè)用trizol提取RNA， 反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再用PCR檢測(cè) GR0- a的表達(dá)。所用弓I物序列為GR0- a :正義鏈，是5' ATGGCTGGGATTCACCTC 3',反義鏈?zhǔn)?'TCGCACAACACCCTTCTA3'。
結(jié)果如圖5B所示，結(jié)果表明，在MAVS基因敲除的鼠源MEF細(xì)胞中，25HC對(duì) GR0-a的誘導(dǎo)受到抑制，而在對(duì)照中，25HC對(duì)GR0-a有明顯的誘導(dǎo)作用。
圖5B中，泳道卜3表示未經(jīng)任何處理的正常鼠源MEF細(xì)胞，其中，泳道l為 未經(jīng)任何誘導(dǎo)，泳道2為經(jīng)25-HC誘導(dǎo)，泳道3為send virus(仙臺(tái)病毒，簡(jiǎn)寫(xiě)為 SV)誘導(dǎo)；泳道4-6表示敲除MAVS基因的鼠源MEF細(xì)胞，其中，泳道4為未經(jīng)任何 誘導(dǎo)，泳道5為經(jīng)25-HC誘導(dǎo)，泳道6為SV誘導(dǎo)。
綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RIG-1介導(dǎo)的信號(hào)通路中的MAVS與IL-8的表達(dá)成正 相關(guān)。
二、 RIG-1介導(dǎo)的信號(hào)通路中的TAK-1的表達(dá)與IL-8相關(guān)
TAK-1 DN是經(jīng)過(guò)突變改造失活的TAK-1基因，它的表達(dá)可以抑制正常的TAK-1 基因的功能，未突變的TAK-1基因的Genbank number為NM—001078361 ， TAK-1 DN 是將其蛋白的66位的lysine突變?yōu)樯彼帷?參考文獻(xiàn)Pellino3 Is a Novel Upstream Regulator of p38 MAPK and activates CREB in a p38—dependent Manner*, Marion P. Butler etal， THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 280， No. 30, Issue of July 29, pp. 27759 - 27768， 2005.)
TAK-1DN基因的來(lái)源通過(guò)PCR擴(kuò)增得到正常的TAK-1基因。具體方法是提取 鼠源MEF細(xì)胞的總RNA， 反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，然后以cDNA為模板PCR克隆得到正 常的TAK-1基因。所用引物序列為正義鏈5' CTCGAGGGCACCGTTCCCGGCCCCAC 3'， 反義鏈5， GAATTCCGGTCCCAGAGAATCATGAA 3'。
用限制性內(nèi)切酶Xho I和EcoR I酶切上述擴(kuò)增產(chǎn)物和pcDNA 3.1 (-)載體， 連接，將TAK-1基因插入到pcDNA3. 1 (-)載體的Xho I和EcoR I位點(diǎn)，篩選、驗(yàn)證， 得到含有TAK-1基因的重組載體pcDNA3. 1 (-)/TAK-1。在得到正常的TAK-1基因的 表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，再利用北京全式金生物公司的Easy Mutagenesis System的 產(chǎn)品將TAK-1基因突變失活得到失活型的TAK-1 DN表達(dá)載體pcDNA3. 1 (-)/TAK-1 DN 表達(dá)載體。轉(zhuǎn)染TAK-1 DN的細(xì)胞中IL-8的表達(dá)情況檢測(cè)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組載體 pcDNA3. 1 (-) /TAK-1 DN轉(zhuǎn)入HUVEC細(xì)胞中。同時(shí)以轉(zhuǎn)入空載體pcDNA3. 1 (-)的HUVEC 細(xì)胞為對(duì)照，空載體的轉(zhuǎn)入方法與重組載體pcDNA3. 1(-)/TAK-1 DN的轉(zhuǎn)入方法相 同。用5ug/ml 25-HC (每孔加入5ug 25-HC)進(jìn)行刺激，16h后收樣，進(jìn)行檢測(cè)； 用實(shí)施例1中(一)所述方法檢測(cè)IL-8在轉(zhuǎn)入重組載體pcDNA3. 1(-)/TAK-1 DN的 HUVEC細(xì)胞中的表達(dá)情況。
結(jié)果如圖5C所示，泳道1表示轉(zhuǎn)入空載體并未被25-HC誘導(dǎo)的細(xì)胞，泳道2 表示轉(zhuǎn)入空載體且被25-HC誘導(dǎo)的細(xì)胞，泳道3表示轉(zhuǎn)入重組載體 pcDNA3. 1 (-) /TAK-1 DN且被25-HC誘導(dǎo)的細(xì)胞；
過(guò)表達(dá)MAVS和TAK-1 DN的細(xì)胞中IL-8的表達(dá)情況檢測(cè)轉(zhuǎn)染TAK-1 DN通過(guò) PEI-HUVEC轉(zhuǎn)染法將重組載體pcDNA3. 1 (-)/TAK-1 DN轉(zhuǎn)入上述含有重組載體 pcDNA3. 1 (-) /MAVS的HUVEC細(xì)胞中，篩選驗(yàn)證得到同時(shí)含有重組載體 pc靈3. 1(-)/TAK-1 DN和重組載體pcDNA3. 1 (-) /MAVS的HUVEC細(xì)胞。用實(shí)施例 1中(一)所述方法檢測(cè)IL-8在轉(zhuǎn)入重組載體pcDNA3. 1 (-) /TAK-1 DN的HUVEC細(xì) 胞中的表達(dá)情況。
結(jié)果如圖5D所示，泳道l表示轉(zhuǎn)入空載體并未被25-HC誘導(dǎo)的細(xì)胞，泳道2 表示僅過(guò)表達(dá)MAVS的細(xì)胞，泳道3表示同時(shí)過(guò)表達(dá)MAVS和TAK-1 DN的細(xì)胞。
結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染TAK-1 DN之后，25HC誘導(dǎo)IL-8受到抑制；MAVS激活I(lǐng)L-8也 受到抑制。表明，TAK-1在25HC誘導(dǎo)IL-8的信號(hào)通路中起重要作用，它的突變 體可以特異性的抑制25HC對(duì)IL-8的誘導(dǎo)。
綜合以上證明，通過(guò)干預(yù)RIG-I及其信號(hào)通路分子，就可以起到抑制動(dòng)脈粥樣 硬化因素(如25羥基膽固醇，高糖等)誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，表明RIG-I信號(hào)通路中 的分子同樣可以作為靶點(diǎn)。
權(quán)利要求
1、視磺酸誘導(dǎo)基因I及其編碼蛋白介導(dǎo)的信號(hào)通路在設(shè)計(jì)和/或篩選藥物中的應(yīng)用。
2、 以視磺酸誘導(dǎo)基因I及其編碼的蛋白介導(dǎo)的信號(hào)通路為靶點(diǎn)的物質(zhì)在制備 藥物中的應(yīng)用。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物為用于預(yù)防和/或治療炎癥相關(guān)疾病的藥物。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物為用于預(yù)防和/或治療動(dòng)脈粥樣硬化疾病的藥物。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物為用于抑制白細(xì)胞介素-8因子表達(dá)的藥物。
6、 根據(jù)權(quán)利要求2-5中任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述以視磺酸誘導(dǎo)基因I及其編碼蛋白介導(dǎo)的信號(hào)通路為靶點(diǎn)的物質(zhì)為核酸。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述核酸為抑制所述視磺酸誘 導(dǎo)基因I表達(dá)的小干擾RNA、表達(dá)所述小干擾RNA的載體、表達(dá)抑制所述視磺酸誘 導(dǎo)基因I表達(dá)的shRNA的載體、與所述視磺酸誘導(dǎo)基因I發(fā)生同源重組且抑制所述 視磺酸誘導(dǎo)基因I表達(dá)的同源序列或含有所述同源序列的載體。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述shRNA由莖I、環(huán)和莖II 構(gòu)成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)；所述莖I的序列為5， AGUGGAAUCACGGAUUAGCTT3，，所述莖II的 序列為5' GCUAAUCCGUGAUUCCACU3'。
9、 一種以視磺酸誘導(dǎo)基因I及其編石馬蛋白介導(dǎo)的信號(hào)通路為靶點(diǎn)的用于預(yù)防 和/或治療炎癥相關(guān)疾病的藥物。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物，其特征在于所述藥物的活性成分為核酸。
11、 根據(jù)權(quán)利要求10所述的藥物，其特征在于所述核酸為抑制所述視磺酸 誘導(dǎo)基因I表達(dá)的小干擾RNA、表達(dá)所述小干擾RNA的載體、表達(dá)抑制所述視磺酸 誘導(dǎo)基因I表達(dá)的shRNA的載體、與所述視磺酸誘導(dǎo)基因I發(fā)生同源重組且抑制所 述視磺酸誘導(dǎo)基因I表達(dá)的同源序列或含有所述同源序列的載體。
12、 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的藥物，其特征在于所述shRNA由莖I、環(huán)和莖 II構(gòu)成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)；所述莖I的序列為5， AGUGGAAUCACGGAUUAGCTT3，，所述莖II的序列為5， GCUAAUCCGUGAUUCCACU3,。
13、 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的藥物，其特征在于所述藥物為用于抑制白細(xì)胞 介素-8因子表達(dá)的藥物。
14、 一種炎癥相關(guān)疾病診斷試劑盒，包括檢測(cè)視磺酸誘導(dǎo)基因I或該基因編碼 的蛋白表達(dá)水平的物質(zhì)。 .
15、 根據(jù)權(quán)利要求14所述的診斷試劑盒，其特征在于所述物質(zhì)為用于擴(kuò)增 視磺酸誘導(dǎo)基因I的RT-PCR引物和/或該基因編碼蛋白的抗體。
16、 檢測(cè)視磺酸誘導(dǎo)基因I或該基因編碼的蛋白表達(dá)水平的物質(zhì)在制備炎癥相 關(guān)疾病診斷試劑盒中的應(yīng)用。
17、 根據(jù)權(quán)利要求16所述的應(yīng)用，其特征在于所述物質(zhì)為用于擴(kuò)增視磺酸 誘導(dǎo)基因I的RT-PCR引物和/或該基因編碼的蛋白的抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了視磺酸誘導(dǎo)基因I及其編碼蛋白介導(dǎo)的信號(hào)通路的新用途。該新用途為視磺酸誘導(dǎo)基因I或視磺酸誘導(dǎo)基因I編碼的蛋白或該蛋白介導(dǎo)的信號(hào)通路在設(shè)計(jì)和/或篩選藥物中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明將RIG-I基因或RIG-I蛋白或RIG-I蛋白介導(dǎo)的信號(hào)通路作為靶點(diǎn)得到的藥物，通過(guò)下調(diào)或抑制RIG-I及其信號(hào)通路分子，有效的抑制了一些與炎癥性疾病相關(guān)的因子的表達(dá)，如IL-8因子、GRO-α因子，進(jìn)而降低了多種炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)率和緩解了炎癥性疾病的病情。因此，將RIG-I作為靶點(diǎn)進(jìn)行一系列炎癥性疾病的預(yù)防和/或治療，為藥物開(kāi)發(fā)提供了新思路，將在藥物制備及炎癥性疾病的預(yù)防和/或治療中廣泛應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P43/00GK101503736SQ20091007665
公開(kāi)日2009年8月12日 申請(qǐng)日期2009年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月12日
發(fā)明者鋒 王, 軍 顧 申請(qǐng)人:北京大學(xué)