專利名稱：：膠枝霉素c的制備方法及其應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術領域：
，具體而言，涉及化合物膠枝霉素C^liocladicillinC)的制備方法，以及化合物膠枝霉素C在制備抗腫瘤活性的藥物中的應用。本發(fā)明還涉及用于發(fā)酵制備膠枝霉素C的粘帚霉屬(Gliocladiumsp.)菌株6.102CGMCCNo.2673。
背景技術：
：惡性腫瘤是目前危害人類健康的主要疾病之一。在第18屆國際抗癌聯(lián)盟大會上，世界衛(wèi)生組織的一項研究報告表明，今后20年，新發(fā)腫瘤患者人數將由目前每年1000萬增加到1500萬，每年因惡性腫瘤而死亡的人數也將由600萬增至1000萬。據國家衛(wèi)生部統(tǒng)計，20世紀90年代我國腫瘤發(fā)病率已上升為127/10萬。近年來我國每年新增腫瘤患者160萬170萬，總數估計在450萬左右。在惡性腫瘤的三大療法中，藥物治療占有重要的地位。在合成的化學類抗腫瘤藥物中絕大多數都是以天然抗腫瘤活性成分為先導化合物的。[參見，《中國腫瘤》2007，16，705-708]據報道，19841995年，天然產物占上市抗腫瘤藥的60%以上；1983年以前在美國上市以及19831994年全世界批準廣泛使用的92種抗腫瘤藥中，約62種來源于天然產物；19951999年，3個天然產物的衍生物作為新抗腫瘤藥上市，由此可見，天然產物是結構新穎和作用獨特的抗腫瘤化合物的重要來源。[參見，《中國抗生素雜志》2004，29，636-640]本發(fā)明涉及的膠枝霉素C(Gli0CladiCillinC)結構式如下式(I)所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>該化合物是本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)并且命名的新結構化合物，同時是首次報道其抗腫瘤活性。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供一種利用微生物發(fā)酵制備膠枝霉素C的方法，以及提供膠枝霉素C在制備抗腫瘤藥物中的應用。本發(fā)明人在微生物次生代謝產物活性化合物的高通量篩選基礎上，發(fā)現(xiàn)了生產菌株粘帚霉屬菌株6.102(CGMCCNo.2673，于2008年9月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，中國北京朝陽區(qū)大屯路中科院微生物研究所，100101))的固體發(fā)酵提取物具有抗腫瘤活性；通過活性跟蹤指導下的進一步分離純化，制備并鑒定了該活性化合物膠枝霉素C。通過對化合物進行抗腫瘤活性評價，發(fā)現(xiàn)其具有顯著的抗腫瘤活性。具體而言，本
發(fā)明內容如下本發(fā)明提供一種利用粘帚霉屬菌株6.102發(fā)酵制備式(I)所示的膠枝霉素C的方法，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>所述方法的特征在于包括下列步驟a)將粘帚霉屬菌株6.102進行固體發(fā)酵；b)在步驟a)的固體發(fā)酵以后，向培養(yǎng)產物中加入有機溶劑提取，得到提取液，將所述提取液減壓蒸餾，得到粗提物；c)將所述粗提物進行減壓硅膠柱層析和凝膠色譜分離而得到活性組分溶液，將所述活性組分溶液用高效液相色譜分離得到式(I)的化合物。其中膠枝霉素C的生產菌株是粘帚霉屬菌株6.102，該菌株分離自采集于西藏林芝地區(qū)的冬蟲夏草樣品，并于2008年9月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)(中國北京朝陽區(qū)大屯路中科院微生物研究所，100101)，保藏編號為2673。粘帚霉屬菌株6.102屬于子囊菌門(Ascomycota)，肉座菌目(Hypocreales)，肉座菌禾斗(Hypoceraceae)，粘帚霉屬(Gliocladiumsp.)。在如上所述的本發(fā)明方法中，本領域技術人員應當理解步驟b)中所用的有機溶劑包括多種不溶于水的在室溫下是液態(tài)的有機溶劑，諸如氯仿、乙酸乙酯、苯、甲苯、二甲苯等，優(yōu)選地，所述有機溶劑是乙酸乙酯。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的膠枝霉素C具有良好的在體外抑制腫瘤細胞生長的活性。所述腫瘤細胞包括子宮頸癌HeLa細胞和肝癌!fepG2細胞，另外，對肺癌A549細胞也有一定的抑制活性。本發(fā)明還提供了式(I)所示的化合物膠枝霉素C在制備抗腫瘤活性的藥物中的用途。本發(fā)明還提供式(I)的化合物膠枝霉素C在制備抗腫瘤活性的試劑盒中的用途。所述腫瘤包括，但不限于，子宮頸癌、肝癌、和肺癌等。本領域技術人員應當理解，可以利用藥劑生產領域中的常規(guī)技術將式(I)的化合物膠枝霉素C用于生產抗腫瘤活性的試劑盒，該試劑盒中的有效成分是式(I)的化合物膠枝霉素C，并且還可以包括藥用載體等。本領域的技術人員還應該理解，當用于抗腫瘤治療時，本發(fā)明的膠枝霉素C可以單獨使用，或者與其它抗腫瘤活性藥物組合使用。綜上所述，本發(fā)明提供了利用粘帚霉屬菌株6.102發(fā)酵制備膠枝霉素C的方法，并提供了膠枝霉素C在制備抗腫瘤活性的藥物中的用途。與文獻報道的其它抗腫瘤化合物相比，化合物膠枝霉素C具有顯著抗腫瘤活性的效果。本發(fā)明為研究與開發(fā)新的抗腫瘤藥物提供了候選化合物。圖1顯示膠枝霉素C的1HNMR光譜圖(500MHz，CDCl3)；圖2顯示膠枝霉素C的13CWR光譜圖(500MHz，⑶Cl3)。圖3顯示膠枝霉素C體外抑制HeLa細胞增殖的生長抑制曲線，從圖中計算的IC5tl值為0.679μg/mL。圖4顯示膠枝霉素C體外抑制H印G2細胞增殖的生長抑制曲線，從圖中計算的IC5tl值為0.285μg/mL。具體實施例方式以下通過實施例來進一步闡明本發(fā)明。但是應該理解，所述實施例只是舉例說明的目的，并不意欲限制本發(fā)明的范圍和精神。實施例1:粘帚霉屬菌株6.102的分離粘帚霉屬菌株6.102分離自西藏冬蟲夏草，具體是分離自冬蟲夏草的中部部分(即幼蟲和子座的交界處)。并于2008年9月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)(中國北京朝陽區(qū)大屯路中科院微生物研究所，100101)，保藏編號為2673。粘帚霉屬菌株6.102屬于子囊菌門(Ascomycota)，肉座菌目(Hypocreales)，肉座菌禾斗(Hypoceraceae)，粘帚霉屬(Gliocladiumsp.)。分離方法如下將新鮮冬蟲夏草的中部部分(即幼蟲和子座的交界處)切下，用2%的次氯酸鈉溶液進行表面消毒3分鐘，然后用無菌水沖洗組織把次氯酸鈉溶液除去。將潔凈的組織放入研缽中，加入適量無菌水進行研磨。將研磨好的組織液涂布在添加了抗生素的PDA培養(yǎng)基平板上(所加抗生素種類和濃度分別為鏈霉素lOOppm，四環(huán)素50ppm)。在25°C條件下培養(yǎng)直到菌落長出，挑取單菌落進行純培養(yǎng)，即完成菌種的分離。粘帚霉屬菌株6.102的生物學特征如下1.形態(tài)特征在PDA培養(yǎng)基上菌落為絮狀，產孢瓶梗，3-5輪生，背面產生淺黃色色素；產生氣生菌絲，菌絲直徑為1.5-2.5微米，多分隔，無色透明，可以形成菌絲束；分生孢子梗直立；分生孢子橢圓形，大小為2.8-3.5x3.9-6.2微米，相互粘結成團，孢子團淺褐色；未見有性型，無子座和子囊殼包裹。2.在固體培養(yǎng)基上的生長特征本發(fā)明中采用大米固體發(fā)酵，粘帚霉屬菌株6.102在大米培養(yǎng)基中會產生黃色菌絲，同時產生黃色色素。3.生理生化特征在用PDA平板培養(yǎng)時，在培養(yǎng)基中會產生黃色色素。在液體種子培養(yǎng)時會產生黃色色素，使培養(yǎng)液呈黃色。4.碳源利用所用碳源為葡萄糖。實施例2化合物膠枝霉素C的制備材料馬鈴薯、大米為市售，本發(fā)明所用的其他試劑均為分析純級別，一般的生物化學試劑公司均有銷售。a.粘帚霉屬菌株6.102的固體發(fā)酵粘帚霉屬菌株6.102的活化PDA培養(yǎng)基馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，水1000mL，121°C高壓蒸汽滅菌30分鐘，制成試管斜面，挑取菌絲體接種于試管斜面上，25°C培養(yǎng)7天；粘帚霉屬菌株6·102的固體發(fā)酵制備大米培養(yǎng)基將IOOg大米和IOOmL水加入500mL三角瓶中，浸泡過夜，121°C高壓蒸汽滅菌30分鐘，冷卻待用；將制備好的菌懸液(孢子濃度為1XIO6個/mL)5mL接種于該大米培養(yǎng)基上，在25°C無菌培養(yǎng)間培養(yǎng)40天。b.膠枝霉素C的提取待發(fā)酵完畢，把大米培養(yǎng)物用鐵勺粉碎，按照乙酸乙酯與粉碎后培養(yǎng)物的體積比例為11，將乙酸乙酯加入盛有粉碎后培養(yǎng)物的三角瓶中提取三次，將有機溶劑減壓蒸餾至干燥，得到10.Og粗提物。c.粗提物的分離純化將粗提物用二氯甲烷-甲醇體系(詳細的體積比分別為100%二氯甲烷；二氯甲烷甲醇=2001；1001；501；251；101；100%甲醇)進行常壓硅膠柱層析，按照極性由小到大的順序將粗提物分成20個組分，在活性跟蹤指導下，發(fā)現(xiàn)在二氯甲烷甲醇=2001作為流動相洗脫得到的組分(命名為組分1)有抗腫瘤活性，收集活性洗脫組分1(400mg)。將活性組分1通過凝膠色譜分離，凝膠柱填料為S印hadexLH-20(購自GEHealthcareBio-SciencesAB公司)，流動相是甲醇，將組分1分成10個亞組分，然后，再通過活性跟蹤分別測試這10個組分的抗腫瘤活性，得到150mg活性組分1-2。將活性組分1-2通過HPLC純化而得到2.Omg活性化合物膠枝霉素C，其中HPLC的條件是采用安捷倫(Agilent)1100型半制備高壓液相色譜儀，安捷倫C18反相半制備色譜柱(10μm、IOx250mm)，流速2.OmL/分鐘，用甲醇和水作為流動相，制備條件70%甲醇/水等度洗脫5分鐘，70%-90%甲醇/水梯度洗脫25分鐘，得到膠枝霉素C的保留時間tK=16.8分鐘。實施例3化合物膠枝霉素C的物化分析實施例2中步驟c得到的化合物膠枝霉素C具有下述理化性質形狀為白色粉末；分子式為C32H32N6O7S4;分子量為740(據ESI-MS)；紫外UV數據(用乙腈作溶劑)最大吸收波長λ·=203nm(310000)，298nm(33000)。膠枝霉素C的質譜和紅外光譜數據見表1，氫譜和碳譜數據見表2/HNMR譜圖見圖1，13CNMR譜圖見圖2。其中紅外光譜由北京大學化學學院提供測試，核磁共振譜由中國醫(yī)學科學院藥物研究所提供測試。表1.化合物膠枝霉素C的物化常數<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2.化合物膠枝霉素C的氫譜和碳譜數據(CDCl3)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>s-單峰；d-雙峰；t_三型峰；m-多重峰通過將上述核磁共振氫譜、碳譜數據，質譜數據，與文獻中所報道的“Inhibitionofc-fosProto-oncogeneInductionbySch52900andSch52901,NovelDiketopiperazinesProducedbyGliocladiumsp.，，(抗生素雜志，1995,48,1440-1445)中化合物Sch52900的數據相比較，發(fā)現(xiàn)該化合物的結構和化合物Sch52900的結構非常類似，但是側鏈的取代基不同，證實得到的產物是一種新的化合物，將其命名為膠枝霉素C。綜上，10.Og粗提物經過分離純化而得到2.Omg純化合物膠枝霉素C，其純度為90%以上，收率為0.2%。實施例4采用MTT法檢測膠枝霉素C對于腫瘤細胞的抑制活性1.試驗用試劑將在實施例3中分離純化的膠枝霉素C用二甲基亞砜(DMSO)作為溶劑分別配制濃度為0.4,2,10，40mg/mL的待測溶液；陽性對照物為5-氟尿嘧啶(購自上海邦成化工有限公司)，其是一種公認的抗腫瘤試劑。本實驗所用腫瘤細胞株為子宮頸癌HeLa細胞株(ATCCCCL-2)和肝癌!fepG2細胞株(ATCCHB-8065)(即，所述細胞均來源于美國典型培養(yǎng)物收藏中心ATCC)。染色液為MTT(噻唑藍)，購自美國Sigma公司。2.試驗方法(1)將腫瘤細胞培養(yǎng)于96孔板中，每孔細胞數為IO4個，DMEM培養(yǎng)基(購自invitrogen公司，貨號12100-046，使用前按說明書加適當體積的水配制成液體培養(yǎng)基滅菌待用)100微升。(2)將腫瘤細胞在37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-18小時后，輕輕倒掉液體培養(yǎng)基，用PBS洗滌1次，加入適當濃度的化合物溶液，37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4小時。(3)培養(yǎng)結束后，用新鮮DMEM培養(yǎng)基替換化合物溶液，再在37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時；(4)培養(yǎng)結束后，每個孔中加入50微升(濃度為0.5毫克/毫升)的MTT(噻唑藍)溶液，在37°C,5%CO2條件下培養(yǎng)3小時；(5)除去培養(yǎng)基和MTT溶液，在每孔中加入200微升DMSO溶液，在37°C條件下放置1小時；(6)使用微量平板ELISA讀數儀(SUNRISE-basicTECAN，TECANAustriaGmbh,Austria)讀取培養(yǎng)后的混合物在570nm下的光吸收值OD57tl；(7)以未處理細胞的吸收值相對于初始值的增長為增殖率100%，計算膠枝霉素C的IC5tl值。其中IC5tl表示導致50%細胞增殖抑制的藥物濃度。實驗結果需要通過三次獨立實驗決定。3.試驗結果本發(fā)明制備的化合物膠枝霉素C對HeLa細胞和H印G2細胞的體外增殖抑制的IC5tl值分別為0.679μg/mL(圖3)和0.285μg/mL(圖4)。陽性對照物5-氟尿嘧啶對HeLa細胞和H印G2細胞的IC5tl均為5μg/mL(未顯示抑制曲線)。結果表明，本發(fā)明的化合物膠枝霉素C對HeLa細胞和HepG2細胞的體外抑制活性分別約是5-氟尿嘧啶抑制活性的7.36倍和17.5倍，可見本發(fā)明的膠枝霉素C具有良好的抑制腫瘤細胞生長的活性，可用于制備抗腫瘤活性的藥物和試劑盒。另外，本發(fā)明的膠枝霉素C對肺癌A549細胞(ATCCCCL-185)也有一定的抑制活性(數據未顯示)。因此，所述腫瘤包括子宮頸癌、肝癌、和肺癌。本領域的技術人員應該理解，當用于抗腫瘤治療時，本發(fā)明的膠枝霉素C可以單獨使用，或者與其它抗腫瘤活性藥物組合使用。應該理解，盡管參考其示例性的實施方案，已經對本發(fā)明進行具體地顯示和描述，但是本領域的普通技術人員應該理解，可以在不背離由后附的權利要求所定義的本發(fā)明的精神和范圍的條件下，對其進行各種形式和細節(jié)的變化。權利要求粘帚霉屬(Gliocladiumsp.)菌株6.102CGMCCNo.2673。2.一種化合物膠枝霉素C^liocladicillinC)，其特征在于a.所述膠枝霉素C具有下式(I)的分子式<image>imageseeoriginaldocumentpage2</image>b.所述膠枝霉素C的物化常數為形狀白色粉末；分子式=C32H32N6O7S4；分子量740(據ESI-MS)；紫外UV數據(乙腈作溶劑)最大吸收波長Amax=203nm(310000),298nm(33000)。3.一種利用權利要求1的菌株發(fā)酵制備權利要求2的化合物膠枝霉素C的方法，所述方法包括下列步驟a)將權利要求1所述的粘帚霉屬菌株6.102CGMCCNo.2673進行固體發(fā)酵；b)在步驟a)的固體發(fā)酵以后，向培養(yǎng)產物中加入有機溶劑提取，得到提取液，將所述提取液減壓蒸餾，得到粗提物；c)將所述粗提物進行減壓硅膠柱層析和凝膠色譜分離而得到活性組分溶液，將所述活性組分溶液用高效液相色譜分離得到權利要求2的化合物膠枝霉素C。4.權利要求3所述的方法，其中步驟b)中所用的有機溶劑是乙酸乙酯。5.權利要求2的化合物膠枝霉素C的應用，其能夠抑制腫瘤細胞的增殖。6.權利要求5所述的應用，其中所述腫瘤細胞包括HeLa細胞、HepG2細胞、和A549細胞。7.權利要求2的化合物膠枝霉素C在制備抗腫瘤活性的藥物中的應用。8.權利要求2的化合物膠枝霉素C在制備抗腫瘤活性的試劑盒中的應用。9.權利要求7或8所述的應用，其中所述腫瘤包括子宮頸癌、肝癌、和肺癌。10.一種抗腫瘤活性的試劑盒，其包括治療有效量的權利要求2的化合物膠枝霉素C，以及藥用載體等。全文摘要本發(fā)明涉及膠枝霉素C(GliocladicillinC)的制備方法及其應用。將真菌粘帚霉屬(Gliocladiumsp.)菌株6.102CGMCCNo.2673進行固體發(fā)酵，對發(fā)酵產物進行分離純化獲得活性化合物，并通過應用質譜、核磁共振波譜、紅外光譜等技術證實該活性化合物為膠枝霉素C。本發(fā)明還提供了膠枝霉素C在制備抗腫瘤活性的藥物中的用途。文檔編號A61P35/00GK101805699SQ20091007730公開日2010年8月18日申請日期2009年2月17日優(yōu)先權日2009年2月17日發(fā)明者劉杏忠,劉述春,葉昕,車永勝,郭慧娟,陳亞麗申請人:中國科學院微生物研究所