專利名稱：表達(dá)促凋亡基因的靶向增殖的重組腺病毒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種表達(dá)促凋亡基因的靶向增殖的重組腺病毒及其應(yīng)用，特別涉及含 有該重組腺病毒的耙向抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物。
背景技術(shù)：
生物體的一切生命活動(dòng)，從出生、成長(zhǎng)、衰老到出現(xiàn)疾病直至死亡都與基因有關(guān)， 基因調(diào)控著細(xì)胞的各種功能。人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到腫瘤是基因異常引起的，惡性腫瘤發(fā)病 率、死亡率較高，已經(jīng)成為危害人類生命的第一位殺手，這使得腫瘤基因治療的研究
成為近20年來(lái)基因治療的熱點(diǎn)。
常用于腫瘤基因治療臨床試驗(yàn)的目的基因有抑癌基因、自殺基因、耐藥基因、反 義基因等。目前研究較多的是重組腺病毒p53，美國(guó)自1995年以來(lái)即開(kāi)始了重組腺病
毒p53制品的臨床試驗(yàn)，并已完成了I、 n期臨床試驗(yàn)及部分in期臨床試驗(yàn)。我國(guó)目
前已有"今又生"上市(由正常人腫瘤抑制基因p53和改構(gòu)的5型腺病毒基因重組 而成)，獲得了國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的新藥證書、準(zhǔn)字號(hào)生產(chǎn)批文、藥品GMP 證書，是世界首個(gè)獲準(zhǔn)上市的基因治療藥物?；蛑委煵粌H作為一個(gè)新的生物醫(yī)學(xué)概 念而為人們所接受，而且作為一種新的治療手段和方法已被廣大研究人員和臨床工作 者所實(shí)踐。到目前為止所進(jìn)行的不少研究表明，基因治療實(shí)驗(yàn)是安全、有效和易于操 作的。
TFAR19(TF-1 cell ap叩tosis-related gene 19)是最近發(fā)現(xiàn)的一種新的凋亡調(diào) 控基因，國(guó)際人類基因命名委員會(huì)將其命名為PDCD5 (programmed cell death 5)，其 編碼的蛋白主要定位于細(xì)胞內(nèi)，在人類50余種組織中廣泛分布。目前，國(guó)內(nèi)外已有 多家實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)PDCD5在疾病情況下，特別是在腫瘤如肝癌、乳腺癌及胃癌中的表達(dá) 明顯下降，PDCD5的低表達(dá)與胃癌的不良預(yù)后相關(guān)，而針對(duì)PDCD5的siRNA能減弱Bax 過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的HeLa、 HEK293和293T細(xì)胞凋亡，說(shuō)明低表達(dá)PDCD5賦予這些細(xì)胞一定 的抗凋亡能力。
阮國(guó)瑞等從mRNA及蛋白水平證實(shí)了 PDCD5在白血病病人骨髓細(xì)胞中低表達(dá)，在 國(guó)際上率先發(fā)現(xiàn)急性髓性白血病(acute myeloid leukemia, AML)病人比慢性髓性 白血病(chronic myeloid leukemia, CML)病人表達(dá)更低的PDCD5， CML病人尤其是 加速/急變期的CML病人，PDCD5表達(dá)量與BCR-ABL表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。馬曦等進(jìn)一步的 研究表明，CML病人PDCD5基因5'調(diào)節(jié)區(qū)2個(gè)SNPs位點(diǎn)影響啟動(dòng)子活性并與CML易感性有關(guān)，擁有(—27G/—11A)這2個(gè)SNPs位點(diǎn)的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性減低，并且不能被 凋亡誘導(dǎo)因素所上調(diào)。利用酵母雙雜交系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)PDCD5可結(jié)合多個(gè)重要的分子如 HTATIP、 EEF1G、 KIAA1377、 RIF1等，其中組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶HTATIP (histone acetyltransf erase Tat interactive protein 60 kD ， HTATIP， TIP60)不僅在染 色質(zhì)基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮重要作用，具有ATP酶、DNA解旋酶及與DNA結(jié)合的活性，而且， 在DNA雙鏈斷裂修復(fù)和凋亡中發(fā)揮重要功能，由于CML病人PDCD5表達(dá)降低，擁有5' 調(diào)節(jié)區(qū)2個(gè)SNPs位點(diǎn)(—27G/_11A )的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性減低，并且不能被凋亡誘導(dǎo) 因素所上調(diào)，因而推測(cè)，CML病人低表達(dá)或異常表達(dá)的PDCD5與TIP60結(jié)合的能力可 能受到影響，從而，可能進(jìn)一步影響到TIP60發(fā)揮的染色質(zhì)基因轉(zhuǎn)錄、DNA雙鏈斷裂 修復(fù)和凋亡等等重要功能，BCR-ABL表達(dá)量增加的CML病人PDCD5表達(dá)量進(jìn)一步降低， 不僅使這些細(xì)胞抗凋亡能力增強(qiáng)，也可能增加了基因組內(nèi)在不穩(wěn)定性。說(shuō)明低表達(dá) PDCD5可能在AML、 CML病理機(jī)制或疾病進(jìn)展中起一定作用。
阮國(guó)瑞等的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以腺病毒為載體的PDCD5基因治療能增強(qiáng)低劑量伊達(dá) 比星等化療藥物的作用，PDCD5在降低化療藥毒副作用方面具潛在的應(yīng)用價(jià)值(Ruan GR, Zhao HS, Chang Y， Li 幾，Qin YZ, Liu YR， Chen SS, Huang XJ. Adenovirus-mediated PDCD5 Gene Transfer Sensitizes K562 Cells to Apoptosis Induced by Idarubicin in vitro and in vivo. 4do/ z^ 57'5". 2008 May; 13(5) :641-8， 4i7)。阮國(guó)瑞等得到了重組腺病毒Ad-PDCD5， Ad-PDCD5是攜帶PDCD5基因的非 增殖性腺病毒(專利200610012154. 8; Ruan GR， Zhao HS, Chang Y, Li JL， Qin YZ， Liu YR, Chen SS， Huang XJ. Adenovirus-mediated PDCD5 Gene Transfer Sensitizes K562 Cells to Apoptosis Induced by Idarubicin in vitro and in vivo. /iD0/ fas7's. 2008 May;13(5)'.64卜8)，具有與化療藥物協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和/或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞 凋亡的功能，但其性能有待進(jìn)一步增強(qiáng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種表達(dá)促凋亡基因的靶向增殖的重組腺病毒及其應(yīng)用。 本發(fā)明提供的重組腺病毒是攜帶PDCD5基因(TFAR19基因)表達(dá)盒的重組腺病毒，
所述PDCD5基因表達(dá)盒自上游至下游依次包括如下組件啟動(dòng)子、人PDCD5 (TFAR19)
的c,A和終止子。
所述PDCD5基因表達(dá)盒中，所述啟動(dòng)子具體可為小鼠CMV啟動(dòng)子，所述終止子具 體可為TGA終止子。
所述PDCD5基因表達(dá)盒還可包括SV40polyA信號(hào)序列；所述SV40polyA信號(hào)序列 位于所述終止子的下游。所述重組腺病毒可將所述PDCD5基因表達(dá)盒插入SG600病毒基因組得到。 所述的重組腺病毒具體可將重組表達(dá)載體pPE3-FllB-PDCD5與pSG600共轉(zhuǎn)染哺 乳動(dòng)物細(xì)胞得到；
所述pPE3-FllB-PDCD5是pENTRll-PDCD5和pPE3-FllB-RC重組得到的；所述 pENTRll-PDCD5是將I和船t I酶切pClonl5-PDCD5得到的小片段與々e I和Abt I酶切pENTRll-Linker得到的大片段連接得到的；所述pClonl5-PDCD5是將PDCD5 基因插入pClonl5得到的。
所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞具體可為293細(xì)胞。所述PDCD5基因具體可為用及》W I酶切 pDC316-PDCD5 (pDC316-TFAR19)得到的小片段。
本發(fā)明還保護(hù)一種重組表達(dá)載體pPE3-FllB-PDCD5，所述pPE3-FllB-PDCD5是 pENTRll-PDCD5和pPE3-FllB-RC重組得到的；所述pENTRl 1-PDCD5是將jgel和 I酶切pClonl5-PDCD5得到的小片段與 I和淑I酶切pENTRll-Linker得到的 大片段連接得到的；所述pClonl5-PDCD5是將PDCD5基因插入pClonl5得到的。
所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞具體可為293細(xì)胞。所述PDCD5基因具體可為用I酶切 pDC316-PDCD5 (pDC316-TFAR19)得到的小片段。
本發(fā)明還保護(hù)一種藥物，它的活性成分為所述的重組腺病毒；所述藥物為如下l) 和/或2)和/或3)和/或4)的藥物
1) 抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物；
2) 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物；
3) 抑制腫瘤生長(zhǎng)的藥物；
4) 治療癌癥的藥物。
所述腫瘤細(xì)胞具體可為白血病細(xì)胞系細(xì)胞，如K562細(xì)胞、MEG-Ol細(xì)胞、Dami細(xì) 胞、NB4細(xì)胞或6T-CEM細(xì)胞。所述腫瘤具體可為白血病。所述癌癥具體可為白血病。
本發(fā)明構(gòu)建得到了SG611-PDCD5重組腺病毒，并進(jìn)行了鑒定，擴(kuò)增，純化，滴度 測(cè)定。以Ad5FllB-hTERTp重組腺病毒(又叫SG611重組腺病毒，未攜帶PDCD5的增殖 性腺病毒)為對(duì)照，體外及裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)單用SG611-PDCD5重組腺病毒對(duì)白血病 細(xì)胞系的K562細(xì)胞、MEG-01細(xì)胞、Dami細(xì)胞、NB4細(xì)胞和6T-CEM細(xì)胞生長(zhǎng)具直接的 抑制作用。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的重組腺病毒可應(yīng)用于靶向抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和/或誘 導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和/或抑制腫瘤生長(zhǎng)的藥物，有望成為一種新型的治療癌癥的藥物。


圖1為pClonl5-PDCD5的構(gòu)建流程圖。 圖2為pENTRll-PDCD5的構(gòu)建流程圖。
6圖3為pPE3-FllB-PDCD5的構(gòu)建流程圖。 圖4為SG611-PDCD5的構(gòu)建流程圖。 圖5為pDC316-PDCD5的酶切電泳圖。 圖6為pClonl5-PDCD5的酶切電泳圖。 圖7為pENTRll-PDCD5的酶切鑒定圖。 圖8為pPE3-FllB-PDCD5的酶切鑒定圖。 圖9為用引物VT669和VT670擴(kuò)增11型Fiber的鑒定圖。 圖10為用引物VT326和VT327擴(kuò)增TERTp的鑒定圖。 圖11為用引物VT631和VT632擴(kuò)增HRER+CMV的鑒定圖。 圖12為用引物VT079和VT076擴(kuò)增野毒的鑒定圖。 圖13為用引物VT298和VT299擴(kuò)增缺失的鑒定圖。 圖14為用引物VT633和VT634擴(kuò)增PDCD5基因的鑒定圖。 圖15為用引物10054和59928擴(kuò)增野毒的鑒定圖。 圖16為SG611-PDCD5感染白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞后PDCD5的表達(dá)量。 圖17為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SG611-EGFP感染K562細(xì)胞的感染效率。 圖18為MTT法檢測(cè)SG611-PDCD5對(duì)K562細(xì)胞的殺傷作用。 圖19為MTT法檢測(cè)SG611-PDCD5對(duì)Dami細(xì)胞的殺傷作用。 圖20為MTT法檢測(cè)SG611-PDCD5對(duì)NB4細(xì)胞的殺傷作用。 圖21為MTT法檢測(cè)SG611-PDCD5對(duì)6T-CEM細(xì)胞的殺傷作用。 圖22為MTT法檢測(cè)SG611-PDCD5對(duì)MEG-01細(xì)胞的殺傷作用。 圖23為SG611-PDCD5對(duì)K562細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)瘤體生長(zhǎng)的抑制作用。
具體實(shí)施例方式
以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明， 均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。
質(zhì)粒pClon15、 pENTRl 1-Linker、 pPE3-F11B-RC ( + )購(gòu)自加拿大tnicrobix公司 (Invitrgoen公司代理)。
pDC316-PDCD5質(zhì)粒是攜帶PDCD5基因的pDC316質(zhì)粒，參考文獻(xiàn)專利 200610012154.8; Liu H T, Wang Y G, Zhang Y M， et al. TRAR19, a novel apoptosis-related gene cloned from human leukemia cell line TF_1, could enhance邵optosis of some tumor cells induced by growth factor withdrawal. Biochem Biophy Res Commun， 1999; 254: 203—210。
7Ad-PDCD5是攜帶PDCD5基因的非增殖性腺病毒，參考文獻(xiàn)專利200610012154. 8; Ruan GR， Zhao HS， Chang Y， Li JL， Qin YZ, Liu YR， Chen SS, Huang X丄 Adenovirus—mediated PDCD5 Gene Transfer Sensitizes K562 Cells to Apoptosis Induced by Idarubicin in vitro and in vivo. 4D。/^asis. 2008 May ;13 (5) :641-8。
SG611-EGFP即PDCD5基因被增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因(Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP)取代的增殖性重組腺病毒，制備方法同SG611-PDCD5。
SG611為不含PDCD5基因的增殖性重組腺病毒對(duì)照，制備方法同SG611-PDCD5。
所有的內(nèi)切酶均購(gòu)自NEB公司。
Taq酶申能博彩公司。
DNA連接酶SolutionI: TakaRa公司。
蛋白酶K、 RNA酶PR0MEGA公司。
胎牛血清、小牛血清、DMEM: GIBC0BRL公司。
瓊脂糖、溴化乙錠GENE公司。
瓊脂粉、胰蛋白胨、酵母提取物UNIPATH公司。
膠回收試劑盒QIAGEN公司。
PCR產(chǎn)物回收試劑盒QIAGEN公司。
質(zhì)粒DNA制備試劑盒QIAGEN公司。
病毒DNA提取試劑盒QIAGEN公司。
LipofectAmine2000試劑盒GIBC0 BRL公司。
實(shí)施例l、重組腺病毒的制備 一、pClonl5-PDCD5的構(gòu)建和鑒定 圖1為pClonl5-PDCD5的構(gòu)建流程圖。 1、 pClonl5-PDCD5的構(gòu)建
將pClonl5用^^ 1酶切(37t水浴6h)后，1. 2%瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試 劑盒(QIAquick Gel Extraction)回收3396bp的pClonl5線性化條帶。
pDC316-PDCD5用I酶切(37。C水浴6h)后，1. 2%瓊脂糖凝膠電泳，用膠回 收試劑盒(QIAquick Gel Extraction)回收423bp的PDCD5基因，酶切后的電泳圖 見(jiàn)圖5。圖5中，1: PDCD5基因；M: marker。
將2ul pClonl5線性化條帶和8ul PDCD5基因在10ul Solution I中12。C連接 12h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，鋪瓊脂板(含AMP)后，37。C生化培 養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10-12h。挑取生長(zhǎng)的細(xì)菌單克隆，在含氨芐青霉素的LB溶液中，37'C搖
8床擴(kuò)增12h。共獲得了 8個(gè)抗生素陽(yáng)性克隆。
2、 pClonl5-PDCD5的鑒定
抽提陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒DNA酶切鑒定(37t水浴反應(yīng)lh， 1.2%瓊脂糖凝膠電泳)。
酶切體系A(chǔ)(^bo7 I酶切)鑒定結(jié)果ltt、 2#、 3#、 5#、 6#質(zhì)粒有3396bp和423bp 兩條帶。酶切體系B 酶切)鑒定結(jié)果2#、 5#、 6#質(zhì)粒有3452bp和367bp
兩條帶。酶切體系C (iXoI酶切)鑒定結(jié)果2tt、 5#、 6#質(zhì)粒有591bp和3228bp兩 條帶。根據(jù)以上三個(gè)酶切體系的鑒定結(jié)果，選擇2#、 5#、 6tt質(zhì)粒進(jìn)一步鑒定。酶切體 系D I禾Q 3柳# I雙酶切)鑒定結(jié)果2#、 6tt質(zhì)粒有367bp、 765bp、 1118bp和
1569bp四條帶。酶切體系E"WII和雙酶切)鑒定結(jié)果2#、 6#質(zhì)粒有340bp、 367bp、 741bp和2371bp四條帶。酶切體系F (i5^ I和尸W I雙酶切)鑒定結(jié)果2#、 6井質(zhì)粒有752bp、 1118bp和1949bp三條帶。結(jié)果表明，2#、 6#質(zhì)粒鑒定正確。
選擇2tt質(zhì)粒進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，將2#質(zhì)粒命名為pClonl5-PDCD5。
二、 pENTRll-PDCD5的構(gòu)建和鑒定
圖2為pENTRll-PDCD5的構(gòu)建流程圖。
1、 pENTRll-PDCD5的構(gòu)建
將2ul pClonl5-PDCD5用如I和淑I雙酶切(37。C水浴8h)得到的1159bp 條帶(酶切電泳圖見(jiàn)圖6，圖6中，M:marker; l:目的條帶)和8ul pENTRll-Linker 命e I和I雙酶切(37。C水浴8h)得到的2319 bp片段在10ul Solution I中12 'C連接12h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，鋪瓊脂板(含卡那霉素) 后，37'C生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10-12h。挑取生長(zhǎng)的細(xì)菌單克隆，在含卡那霉素的LB溶 液中，37X:搖床擴(kuò)增12h。共獲得了 5個(gè)抗生素陽(yáng)性克隆。
2、 pENTRll-PDCD5的鑒定
抽提陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒DNA酶切鑒定(37。C水浴反應(yīng)lh， 1.2%瓊脂糖凝膠電泳)。 酶切體系G (fco7 I酶切)鑒定結(jié)果1#、 3#、 4#、 5#質(zhì)粒有204bp、 423bp和 2851bp三條帶。酶切體系H (ife/^I酶切)鑒定結(jié)果1#、 3#、 4tt、 5#質(zhì)粒有197bp、 367bp和2914bp三條帶。根據(jù)以上兩個(gè)酶切體系的鑒定結(jié)果選擇ltt、 3tt、 4#、 5tt質(zhì) 粒進(jìn)一步鑒定。酶切體系I (J力o I和尸"I雙酶切)鑒定結(jié)果1#、 3tt、 4tt、 5#質(zhì) 粒有350bp、 241bp、 358bp、 126bp和2403bp五條帶。酶切體系J (vT/w I和順e I 雙酶切)鑒定結(jié)果1#、 3#、 4#、 5tt質(zhì)粒有475bp、 195bp、 482bp和2326bp四條帶。 酶切體系K (^ge I和Abf I雙酶切)鑒定結(jié)果ltt、 3tt、 4tt、 5tt質(zhì)粒有1159bp和2319bp 兩條帶。酶切體系L (Pst I酶切)鑒定結(jié)果1#質(zhì)粒有725和2753兩條帶。
選擇ltt質(zhì)粒提中樣，用以上酶切體系G、 H、 I、 J、 K、 L再次進(jìn)行鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖7。圖7中，Ml: lOObp DNA Ladder (NEB); M2: A DNAAfibo7 1+歷/7(/III (MBI); 1:
酶切體系G; 2:酶切體系H; 3:酶切體系I; 4:酶切體系J; 5:酶切體系K; 6:酶
切體系L。再次驗(yàn)證了 1#質(zhì)粒為目的質(zhì)粒，將其命名為pENTR11-PDCD5。
三、 pPE3-FllB-PDCD5的獲得和鑒定
圖3為pPE3-F11B-PDCD5的構(gòu)建流程圖。
1、 pPE3-FllB-PDCD5的獲得
將1.5ul pENTR11-PDCD5、 1. 5ul pPE3-F11B-RC ( + )、 5. 0ul 1XTE、 2. 0ul LR (Gateway LR Clonase II enzyme mix， Invitrogen公司)混合，25。C水浴12h后，
加入lul蛋白酶K， 37'C水浴IO分鐘后，轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，鋪瓊脂板 (含AMP)后，37。C生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10-12h。挑取生長(zhǎng)的細(xì)菌單克隆，在含氨芐青
霉素的LB溶液中，37"C搖床擴(kuò)增12h。共獲得了6個(gè)抗生素陽(yáng)性克隆。
2、 pPE3-FllB-PDCD5的鑒定
抽提陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒DNA酶切鑒定(37"C水浴反應(yīng)lh， 1. 2%瓊脂糖凝膠電泳)。 酶切體系M (&e I酶切)鑒定結(jié)果2#、 3#、 5#、 6tt質(zhì)粒有3083bp、 1716bp、 18bp和32147bp四條帶。根據(jù)酶切結(jié)果選擇2tt、 3#、 5#、 6共質(zhì)粒進(jìn)一步鑒定。酶切 體系N (i7wl酶切)鑒定結(jié)果2#、 3#、 5#、 6tt質(zhì)粒有4908、 2466、 1445、 595、 14500、 4995、 387、 591、 358和6719十條帶。酶切體系0 (尸acl酶切)鑒定結(jié)果2#、 3#、 5#、 6#質(zhì)粒有1022、 284和35658三條帶。酶切體系P (&7I酶切)鑒定結(jié)果2tt、 3共、5tt、 6tt質(zhì)粒有4183、 6006、 379、 6903、 13190、 193和6110七條帶。
選擇2tt質(zhì)粒提中樣，用以上酶切體系M、 N、 0、 P再次進(jìn)行鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖8。 圖8中，A和B分別為采用不同曝光率強(qiáng)度的電泳圖照片。圖8中，M: ADNA/fcMI+沿7^
III(MBI); 1:酶切體系M; 2:酶切體系0; 3:酶切體系P; 4:酶切體系N。再次驗(yàn)
證了 2tt質(zhì)粒為目的質(zhì)粒，將其命名為pPE3-FllB-PDCD5。
pPE3-F11B-PDCD5質(zhì)粒攜帶有人PDCD5基因的表達(dá)盒，該表達(dá)盒包括啟動(dòng)子、人 PDCD5的全長(zhǎng)cDNA、終止子和SV40 polyA信號(hào)序列。
四、 重組腺病毒的獲得和鑒定 構(gòu)建流程圖見(jiàn)圖4。
1、重組腺病毒的獲得
用Lipof ectamine 2000試劑盒，將質(zhì)粒pPE3-FllB-PDCD5與pSG600共轉(zhuǎn)染至293 細(xì)胞，具體方法按試劑盒說(shuō)明操作。轉(zhuǎn)染后9 14 d細(xì)胞出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過(guò)3次病毒 空斑純化，得到4株重組腺病毒毒株。
pSG600為攜帶SG600病毒基因結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒，SG600病毒為經(jīng)以下基因修飾的腺病毒以hTERTp代替病毒Ela啟動(dòng)子；hTERT轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游添加3個(gè)E-box結(jié)；病 毒Ela區(qū)的CR2基因部分(nt923-946)缺失；缺失Elb啟動(dòng)子，代之以5個(gè)缺氧誘導(dǎo)因 子結(jié)合位點(diǎn)的缺氧增強(qiáng)子(HRE) 。 (Xinghua Wang， Changqing Su， Hui Cao， Kui Li， Jie Chen, Lixin Jiang, Qi Zhang, Xiaobing Wu， Xiaoyuan Jia， YongjingLiu， WeiguoWang， Xinyuan Liu， Mengchao Wu， and Qijun Qi肌 A novel triple-regulated oncolytic adenovirus carrying p53 gene exerts potent antitumor efficacy on common human solid cancers. Mol Cancer Ther 2008;7(6) 1598-1603.)(北京大學(xué)人民醫(yī)院)。 2、重組腺病毒的鑒定
應(yīng)用QIAGEN DNA Blood Mini Kit (QIAGEN)提取4株重組腺病毒的DNA，進(jìn)行 PCR鑒定，陰性對(duì)照反應(yīng)管內(nèi)不加模板進(jìn)行PCR。
(1) 用引物VT669和VT670擴(kuò)增11型Fiber VT669: 5' -CAA CCA CAG GCG GAT CTC TAC -3'; VT670: 5' -GTT CCA GGA CCA AGT TAT ACG -3'。
擴(kuò)增體系(20. 0ul):病毒DNA 2. Oul， VT669引物0. 5ul， VT670引物0.5ul， Taq酶0.5ul， Tag酶Buffer 2. 0ul， dNTP 0. 5ul， H20 14. Oul。
擴(kuò)增條件95°c 3rain; 95°C 40sec， 46°C 40sec， 72°C 240sec， 35個(gè)循環(huán)；72 °C lOmin。
結(jié)果見(jiàn)圖9。圖9中，M: ADNA/EcoRI+HindlII(MBI); N:陰性對(duì)照；1-4: 4#毒株。
1#-4#毒株均可以擴(kuò)增出731bp的11型Fiber片段。
(2) 用引物VT326和VT327擴(kuò)增TERTp VT326: 5' -GAT CTC ACA GAC GCC CAG GA-3'; VT327: 5' -TCC TCG TCG TCA CTG GGT GGA-3'。
擴(kuò)增體系(20. 0ul):病毒DNA 2.0ul， VT326引物0. 5ul， VT327引物0. 5ul， Taq酶0. 5ul， Tag酶Buffer 2. 0ul， dNTP 0. 5ul， H20 14. Oul 。
擴(kuò)增條件95°c 3min; 95°C 40sec， 46°C 40sec， 72°C 240sec， 35個(gè)循環(huán)；72 °C lOmin。
結(jié)果見(jiàn)圖10。圖10中，M: ADNA/EcoRI+Hind III(MBI); N:陰性對(duì)照;1-4: 1#-4# 毒株。
1#-4tt毒株都能擴(kuò)增出730bp的TERTp片段。
(3) 用引物VT631和VT632擴(kuò)增服ER+CMV啟動(dòng)子 VT631: 5' -GCGGCCGCAGGCCTACCAAGAGGAC-3';VT632: 5' -Act agt gat ctg acg gtt cac taa ac-3'。
擴(kuò)增體系(20.0ul):病毒DNA 2.0ul， VT631引物0.5ul， VT632引物0.5ul， Taq酶0. 5ul， Tag酶Buffer 2. Oul， dNTP 0.5ul， H20 14. Oul。
擴(kuò)增條件95°C 3min; 95°C 40sec， 56°C 40sec， 72°C 240sec， 35個(gè)循環(huán)；72 °C 10min。
結(jié)果見(jiàn)圖11。圖11中，M: ADNA/EcoRI+Hind III(MBI); N:陰性對(duì)照；1-4: ltt-4# 毒株。
1#-4#毒株都能擴(kuò)增出270bp的服ER+C匿啟動(dòng)子片段。
(4) 用引物VT079和VT076擴(kuò)增野生型腺病毒 VT076: 5' -TCA CCT GTG TCT AGA GAA TGC-3'; VT079: 5' -GGC CAG AAA ATC CAG CAG GTA-3'。
擴(kuò)增體系(20. Oul):病毒DNA 2. Oul， VT076引物0. 5ul， VT079引物0. 5ul， T叫酶0. 5ul， Tag酶Buffer 2. Oul， dNTP 0.5ul， H20 14. Oul 。
擴(kuò)增條件95°C 3min; 95°C 40sec， 56°C 40sec， 72°C 240sec， 35個(gè)循環(huán)；72 °C lOmin。
結(jié)果見(jiàn)圖12。圖12中，M: ADNA/EcoRI+Hind III(MBI); N:陰性對(duì)照;1-4: 1#-4#
毒株o
1#-4#毒株均能擴(kuò)增出946bp片段，說(shuō)明含有病毒基因結(jié)構(gòu)，SG600與 pPE3-F11B-PDCD5在293細(xì)胞內(nèi)重組成功。
(5) 用引物VT298和VT299擴(kuò)增缺失
VT298: 5' -GCA TTC TCT AGA CAC AGG TG-3'; VT299: 5' -ACC TGC CAC GAG GCT GGC-3'。
擴(kuò)增體系(20. Oul):病毒DNA 2. Oul， VT298引物0. 5ul， VT299引物0. 5ul， Taq酶0. 5ul， Tag酶Buffer 2. Oul， dNTP 0.5ul， H20 14. Oul 。
擴(kuò)增條件95°C 3min; 95°C 40sec， 56°C 40sec， 72°C 240sec， 35個(gè)循環(huán)；72 °C lOmin。
結(jié)果見(jiàn)圖13。圖13中，M: ADNA/EcoRI+Hind III(MBI); N:陰性對(duì)照；1-4: 1#-4# 毒株。
Itt-4tt毒株的CR2成功缺失了 E1A中結(jié)合Rb的CR2基序，所以擴(kuò)出非特異條帶。
(6) 用引物VT633和VT634擴(kuò)增PDCD5基因 VT633: 5' -Act agt gat taa get cga gtc tg-3'; VT634- 5' —gat tat ggc gga cga gga get tg-3'擴(kuò)增體系(20.0ul):病毒DNA 2. Oul， VT633引物0. 5ul， VT634引物0.5ul， Taq酶0.5ul， Tag酶Buffer 2. Oul， dNTP 0. 5ul， H20 14. Oul 。
擴(kuò)增條件95°C 3min; 95°C 40sec， 46°C 40sec， 72°C 240sec， 35個(gè)循環(huán)；72 。C 10min。
結(jié)果見(jiàn)圖14。圖14中，M: ADNA/EcoRI+Hind III(MBI); N:陰性對(duì)照;1-4: l共-4tt 毒株。
1#-4#毒株擴(kuò)增出417bp的PDCD5基因。 (7)用引物10054和59928擴(kuò)增野生型腺病毒 10054: 5' —GGG CGT AAC CGA GTA AGA TTT G-3;; 59928: 5' -TGG AAG ATT ATC AGC CAG TAC-3''。
擴(kuò)增體系(20,0ul):病毒DNA 2.0ul， 10054引物0. 5ul， 59928引物0.5ul， Taq酶0.5ul， Tag酶Buffer 2.0ul， dNTP 0.5ul， H20 14. Oul 。
擴(kuò)增條件95°C 3min; 95°C 40sec, 56°C 40sec， 72°C 240sec， 35個(gè)循環(huán)；72 °C 10min。
結(jié)果見(jiàn)圖15。圖15中，M: ADNA/EcoRI+Hind III(MBI); N:陰性對(duì)照;1-4: 1#-4tt 毒株。
l共-4tt毒株能擴(kuò)增出660bp片段，說(shuō)明SG600與PPE3-F11B-PDCD5在293細(xì)胞內(nèi)重組。
以上鑒定結(jié)果表明，1共-4#毒株均為可作為目的重組腺病毒，選擇lft毒株進(jìn)行后 續(xù)試驗(yàn)，將1#毒株命名為SG611-PDCD5。 五、病毒的擴(kuò)增、純化和滴度測(cè)定
將SG611-PDCD5在293細(xì)胞中反復(fù)擴(kuò)增，生產(chǎn)50個(gè)75cW培養(yǎng)瓶病毒；通過(guò)氯化銫梯 度離心法純化病毒，收獲的病毒進(jìn)行質(zhì)檢，高效液相色譜法測(cè)二者純度均達(dá)到98%以 上；采用半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(50% tissue culture infectious dose , TCID50 ) 法測(cè)定SG611-PDCD5效價(jià)，病毒滴度為2. 91X 101()TCID50/ml。
實(shí)施例2、 SG611-PDCD5感染K562細(xì)胞后PDCD5的表達(dá)量
實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)不同M0I的SG611-PDCD5感染K562細(xì)胞(上海坤肯生物化工有 限公司；中國(guó)細(xì)胞庫(kù)典藏細(xì)胞中心細(xì)胞目錄QK10269)后PDCD5的表達(dá)水平。取對(duì)數(shù) 生長(zhǎng)期K562細(xì)胞，以8X107孔接種于六孔板，分別進(jìn)行以下四個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)三 個(gè)復(fù)孔
處理一至處理三分別以M0I=1的劑量感染SG611-PDCD5、 SG611-EGFP或
13Ad-PDCD5;處理四(對(duì)照)用等量生理鹽水作為對(duì)照。
感染后每天同一時(shí)間收獲半量細(xì)胞常規(guī)提取總RNA并經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用TaqMan技術(shù)在ABI 7500 Sequence Detection System (App lied B iosys2teras, USA)完成實(shí)時(shí)定量RT-PCR。 PCR引物序列、反應(yīng)體系及PCR條件參見(jiàn)文獻(xiàn)(Ruan GR， QinYZ, Chen SS， Li幾，Ma X， Chang Y， Wang YZ, Fu JT， Liu YR. Abnormal expressionof the programmed cell death 5 gene in acute and chronic myeloid leukemia.
紐2006 S??；30(9) :1159-65.)。實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增后的ABL及PDCD5的Ct值分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程進(jìn)行計(jì)算，以PDCD5/ABL比值代表PDCD5表達(dá)的相對(duì)水平。
結(jié)果如圖16所示，以未感染病毒的K562細(xì)胞(對(duì)照)的PDCD5/ABL水平為1，MOI為1時(shí)，與感染SG611-EGFP或Ad-PDCD5相比，K562細(xì)胞感染SG611-PDCD5后PDCD5的表達(dá)水平隨時(shí)間延長(zhǎng)而不斷升高，第4、 5、 6、 7、 8、 9天PDCD5/ABL比值分別為3. 53±0. 65、 11.45±1. 75、 33. 14±11.43、 39. 23±16. 85、 70. 12±3. 13及168. 32±32. 13。
實(shí)施例3、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SG611-EGFP對(duì)K562細(xì)胞的感染效率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2X10Vml，以4ml (8Xl(f細(xì)胞)/孔接種于六孔板，分別進(jìn)行以下四個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)三個(gè)復(fù)孔
處理一至處理三分別以,1=1、 5、 10的劑量感染SG611-EGFP;處理四(對(duì)照)
用等量生理鹽水作為對(duì)照。
感染后24、 48、 72、 96、 120小時(shí)后各收集細(xì)胞一次，每組均收集三復(fù)孔細(xì)胞混合，用PBS洗滌2次后，上流式細(xì)胞儀(FACSort型，美國(guó)Becton Dickinson公司)檢測(cè)并計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率，激發(fā)光為488nm，檢測(cè)光為530nm。
結(jié)果如圖17所示，隨著M0I增加，SG611-EGFP病毒感染K562細(xì)胞后，其感染效率依次增加。感染24小時(shí)后，MOI- 1、5、10的感染效率分別為6. 39%、46. 47%及71. 16%。感染72小時(shí)后，M0I=1、 5、 10的感染效率分別為31.29%、 91.27%、和93. 96%。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，感染效率也逐漸升高。M0I為1時(shí)，在第24、 48、 72、 96、 120小時(shí)的感染效率分別為6. 39%、 7. 41%、 31. 29%、 62. 16%和83. 8%。 M0I為5時(shí)，在第24、 48、72、 96、 120小時(shí)的感染效率分別為46. 47%、 55. 44%、 91. 27%、 95. 38%和97. 74%。 M0I為10時(shí)，在第24、 48、 72、 96、 120小時(shí)的感染效率分別為71. 16%、 83. 80%、 93. 96%、98. 08%和98. 68%。
實(shí)施例4、 MTT法檢測(cè)SG611-PDCD5對(duì)K562細(xì)胞的殺傷作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為lX106/ml，以40iil/管(4X1(T細(xì)胞/孔)在10ml離心管內(nèi)分別以不同MOI感染SG61卜PDCD5、 Ad-PDCD5或SG611病毒液，同時(shí)設(shè)生理鹽水參照組。感染最初兩小時(shí)每20-30分鐘輕輕混勻，感染2小時(shí)后補(bǔ)充含2%FBS (GIBCO公司)的RPMI1640液至1200 ix 1,以300 u 1/孔(1X10'細(xì)胞/孔)接種于24孔板培養(yǎng)。分別于第3、 5和6天補(bǔ)充300wl、 600 u 1禾B 1200 ii 1含2。/。FBS的RPMI1640培養(yǎng)液。感染后第7天加入MTT工作液(5mg/ml)，每孔20ul，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后，加入200 yl 10%SDS-0. 01M HC1溶解細(xì)胞。570 nm波長(zhǎng)(Bio-Rad650型酶標(biāo)儀)下測(cè)定吸光度(A)值，參考波長(zhǎng)630nm。每組病毒液每個(gè)MO工設(shè)3個(gè)復(fù)孔求平均值。細(xì)胞存活率(cell viability)以該孔的吸光度與參照孔吸光度的比值(百分?jǐn)?shù))計(jì)算。
結(jié)果如圖18所示，感染7天后，MOI為l、 10、 20、 40、 80時(shí),感染SG611-PDCD5的K562細(xì)胞隨著MOI升高其細(xì)胞存活率明顯降低，其存活率分別為94%、 72%、 6%、1%和0%，其中MOI為20、 40、 80時(shí)，感染SG611-PDCD5組與感染Ad-PDCD5或SG611組相比，細(xì)胞存活率降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差別(尸值均小于O.Ol)。
實(shí)施例5、 MTT法檢測(cè)SG611-PDCD5對(duì)Dami細(xì)胞的殺傷作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Danii細(xì)胞(上海坤肯生物化工有限公司，中國(guó)細(xì)胞庫(kù)典藏細(xì)胞中心細(xì)胞目錄QK10058)，調(diào)整細(xì)胞濃度為lX107ml，以50iil/孔(5Xl(f細(xì)胞/孔)接種細(xì)胞至96孔板，分別以不同MOI感染SG611-PDCD5、 Ad-PDCD5或SG611病毒液，同時(shí)設(shè)生理鹽水參照組。2h后補(bǔ)充含10呢FBS (GIBCO)的RPMI1640液至100y 1/孔。于感染后96h加入MTT工作液(5mg/ml)，每孔20ul，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后，加入80ul 10%SDS-0.01M HC1溶解細(xì)胞。570 nm波長(zhǎng)(Bio-Rad650型酶標(biāo)儀)下測(cè)定吸光度(A)值，參考波長(zhǎng)630nm。每組病毒液每個(gè)MOI設(shè)3個(gè)復(fù)孔求平均值。細(xì)胞存活率(cellviability)以該孔的吸光度與參照孔吸光度的比值(百分?jǐn)?shù))計(jì)算。
結(jié)果如圖19所示，感染96h后，M01為10、 40、 80、 160、 320時(shí)，感染SG611-PDCD5的Dami細(xì)胞隨著MOI升高細(xì)胞存活率明顯降低，其存活率分別為10.45%、 5.22%、3. 80%、 5. 22%和4. 75%，與感染Ad-PDCD5或SG611的Dami細(xì)胞相比，細(xì)胞存活率的降低幅度均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差別(尸值均小于0. 01)。
實(shí)施例6、 MTT法檢測(cè)SG611-PDCD5對(duì)NB4細(xì)胞的殺傷作用NB4細(xì)胞上海坤肯生物化工有限公司，中國(guó)細(xì)胞庫(kù)典藏細(xì)胞中心細(xì)胞目錄QK10271。實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例5。
結(jié)果如圖20所示，感染96h后，MOI為10、40、80、 160和320時(shí)，感染SG611-PDCD5的NB4細(xì)胞隨著M0I升高細(xì)胞存活率明顯降低，其存活率分別為96.21%、 61.75%、34. 12%、 16. 04%和6. 82%,其中MOI為40、 80、 160和320時(shí)，感染SG611-PDCD5組與感染Ad-PDCD5或SG611組相比，細(xì)胞存活率的降低幅度均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差別(尸值均小于0. 01)。
實(shí)施例7、 MTT法檢測(cè)SG611-PDCD5對(duì)6T-CEM細(xì)胞的殺傷作用6T-CEM細(xì)胞上海坤肯生物化工有限公司，中國(guó)細(xì)胞庫(kù)典藏細(xì)胞中心細(xì)胞目錄QK10007。
實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例5。
結(jié)果如圖21所示，感染96h后，M0I為20、 80和320時(shí)，感染SG611-PDCD5的6T-CEM細(xì)胞隨著M0I升高細(xì)胞存活率明顯降低，其存活率分別為76. 05%、 77. 92%和0%，其中M0I為320時(shí)，感染SG611-PDCD5組與感染Ad-PDCD5或SG611組相比，細(xì)胞存活率降低幅度有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差別(戶值小于0. 01)。
實(shí)施例8、 MTT法檢測(cè)SG611-PDCD5對(duì)MEG-01細(xì)胞的殺傷作用MEG-Ol細(xì)胞上海坤肯生物化工有限公司，中國(guó)細(xì)胞庫(kù)典藏細(xì)胞中心細(xì)胞目錄QK10748。
實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例4。
結(jié)果如圖22所示，感染7天后，M0I為1、 10、 20、 40、 80時(shí)，感染SG611-PDCD5的MEG-01細(xì)胞隨著M0I升高細(xì)胞存活率明顯降低，其存活率分別為87%、 79%、 53%、8%和0. 98%，其中M0I為40、 80時(shí)，感染SG611-PDCD5組與感染Ad-PDCD5或SG611組相比，細(xì)胞存活率降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差別(尸值均小于O.Ol)。
實(shí)施例9、 SG611-PDCD5對(duì)K562細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)瘤體生長(zhǎng)的抑制作用采用4-5周齡雌性BALB/C裸鼠(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。接種K562細(xì)胞前，每只裸鼠連續(xù)兩天腹腔注射100mg/kg的環(huán)磷酰胺注射液。大量培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562細(xì)胞，臺(tái)盼蘭活細(xì)胞計(jì)數(shù)后，離心收集，用無(wú)血清RPMI 1640洗滌。K562細(xì)胞以1.5X107個(gè)/點(diǎn)接種裸鼠腋窩皮下，每日觀察裸鼠瘤體生長(zhǎng)情況，當(dāng)用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤直徑達(dá)5-7鵬時(shí)將動(dòng)物分為4組SG611組(n二6)、SG611-PDCD5組(n:6)、 Ad-PDCD5組(n=5)和對(duì)照組(生理鹽水組，『5)。 Ad-PDCD5組、SG611組
16和SG611-PDCD5組分別以2X 109pfu/ral病毒液100 n 1局部注射瘤體內(nèi)，隔天一次， 共5次，每只小鼠總共注射lX109pfu。隔天觀察一次腫瘤大小，運(yùn)用游標(biāo)卡尺測(cè)量 腫瘤長(zhǎng)徑和短徑，按下列公式計(jì)算腫瘤體積L X I2 X 0.52 (L:腫瘤最大徑，I: 腫瘤最小徑)。
結(jié)果如圖23所示，與對(duì)照組相比，Ad-PDCD5組瘤體生長(zhǎng)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(第28天 時(shí)，尸>0.05)。與Ad-PDCD5組相比，自注射藥物后第14天起SG611-PDCD5組瘤體生 長(zhǎng)受抑(第14、 16、 18天時(shí)，尸值均小于0.05;第20、 22、 24、 26、 28天時(shí)，尸值 均小于0.01)。SG611組瘤體生長(zhǎng)較Ad-PDCD5組緩慢，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(第28天時(shí)，尸 〉0.05)。與SG611組相比，SG611-PDCD5組較SG611抑瘤效應(yīng)明顯，自第24天起，差 異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(第24、 26和28天尸值分別為0. 00485、 0. 00443和0. 00284)。注射 藥物后第28天對(duì)照組、Ad-PDCD5、 SG611和SG611-PDCD5組的腫瘤平均體積(mm3)分 別為2223. 19. 4±916. 81、 2080. 75±1068. 27、 1264. 46±545. 55和371. 22±113. 15。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SG611-PDCD5對(duì)K562細(xì)胞裸鼠體內(nèi)瘤體生長(zhǎng)有一定的抑制作用。
17序列表
<110〉北京大學(xué)人民醫(yī)院
<120〉表達(dá)促凋亡基因的靶向增殖的重組腺病毒及其應(yīng)用
<130> CGGNARY92060 〈140〉 200910077912.8 <■ 14
〈210> 1
〈211〉 21
<212> 腿 〈213〉人工序列
〈220〉 〈223>
<400> 1
caaccacagg cggatctcta c 21
〈210> 2
<211> 21
〈212〉 DNA <213>人工序列
〈220〉 <223>
〈400> 2
gttccaggac caagttatac g 21
〈210〉 3
<211> 20
〈212> DNA 〈213〉人工序列
〈220〉 <223>
〈400〉 3
gatctcacag acgcccagga 20
〈210> 4
<211> 21
〈212> 腿 <213>人工序列
〈220> <223>
〈400〉 4
tcctcgtcgt cactgggtgg a 21 <210> 5
18<formula>formula see original document page 19</formula><210> 10
〈211〉 18
〈212> DNA <213>人工序列
〈220〉 〈223>
〈400> 10
acctgccacg aggctggc 18
<210> 11
<211> 23
〈212> 腿 〈213〉人工序列
<220> 〈223〉
<400> 11
actagtgatt aagctcgagt ctg 23
<210> 12
<211> 23
〈212〉 ■ 〈213〉人工序列
〈220> <223>
<400> 12
gattatggcg gacgaggagc ttg 23
<210> 13
<211〉 22
<212> DNA
〈213〉 人工序列
〈220〉 <223〉
<400〉 13
gggcgtaacc gagtaagatt tg 22
〈210〉 14
<211> 21
〈212〉 腿 〈213〉人工序列
<220〉 <223>
<400> 14
tggaagatta tcagccagta c 2權(quán)利要求
1、包括PDCD5基因表達(dá)盒的重組腺病毒，所述PDCD5基因表達(dá)盒自上游至下游依次包括如下組件啟動(dòng)子、人PDCD5的cDNA和終止子。
2、 如權(quán)利要求1所述的重組腺病毒，其特征在于所述PDCD5基因表達(dá)盒中， 所述啟動(dòng)子為小鼠CMV啟動(dòng)子，所述終止子為TGA終止子。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組腺病毒，其特征在于所述PDCD5基因表達(dá) 盒還包括SV40polyA信號(hào)序列；所述SV40polyA信號(hào)序列位于所述終止子的下游。
4、 如權(quán)利要求1至3中任一所述的重組腺病毒，其特征在于所述重組腺病毒 是將所述PDCD5基因表達(dá)盒插入SG600病毒基因組得到的。
5、 如權(quán)利要求4中所述的重組腺病毒，其特征在于所述重組腺病毒是將重組 表達(dá)載體pPE3-FllB-PDCD5與pSG600共轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞得到；所述pPE3-FllB-PDCD5是pENTRll-PDCD5禾P pPE3-FllB-RC重組得到的；所述 pENTRll-PDCD5是將力ge I禾卩I酶切pClonl5-PDCD5得到的小片段與I禾P Afet I酶切pENTRll-Linker得到的大片段連接得到的；所述pClonl5-PDCD5是將PDCD5 基因插入pClonl5得到的。
6、 如權(quán)利要求5所述的重組腺病毒，其特征在于所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為293細(xì) 胞；所述PDCD5基因?yàn)橛胒co/ I酶切pDC316-PDCD5得到的小片段。
7、 重組表達(dá)載體pPE3-F11B-PDCD5，所述pPE3-F11B-PDCD5是pENTRll-PDCD5 和pPE3-F11B-RC重組得到的；所述pENTRll-PDCD5是將I和#W I酶切 pClonl5-PDCD5得到的小片段與^《e I和I酶切pENTRll-Linker得到的大片段 連接得到的；所述pClonl5-PDCD5是將PDCD5基因插入pClonl5得到的。
8、如權(quán)利要求7所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述PDCD5基因?yàn)橛谩阞oWI 酶切pDC316-PDCD5得到的小片段。
9、 一種藥物，它的活性成分為權(quán)利要求1-6中任一所述的重組腺病毒；所述藥 物為如下l)和/或2)和/或3)和/或4)的藥物1) 抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物；2) 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物；3) 抑制腫瘤生長(zhǎng)的藥物；4) 治療癌癥的藥物。
10、 如權(quán)利要求9所述的藥物，其特征在于所述腫瘤細(xì)胞為白血病細(xì)胞系細(xì)胞； 所述腫瘤細(xì)胞為K562細(xì)胞、MEG-01細(xì)胞、Dami細(xì)胞、NB4細(xì)胞或6T-CEM細(xì)胞；所述腫瘤為白血?。凰霭┌Y為白血病。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種表達(dá)促凋亡基因的靶向增殖的重組腺病毒及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了包括PDCD5基因表達(dá)盒的重組腺病毒，PDCD5基因表達(dá)盒自上游至下游依次包括啟動(dòng)子、人PDCD5的cDNA和終止子。本發(fā)明構(gòu)建得到的SG611-PDCD5重組腺病毒，是應(yīng)用了人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子和缺氧反應(yīng)啟動(dòng)子雙調(diào)控的減毒增殖型腺病毒。以未攜帶PDCD5的增殖性腺病毒為對(duì)照，體外及裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)單用SG611-PDCD5重組腺病毒對(duì)白血病細(xì)胞系K562、MEG-01、Dami、NB4及6T-CEM細(xì)胞生長(zhǎng)具直接的抑制作用。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的重組腺病毒可應(yīng)用于靶向抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和/或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和/或抑制腫瘤生長(zhǎng)的藥物，有望成為一種新型的治療癌癥的藥物。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101497876SQ20091007791
公開(kāi)日2009年8月5日 申請(qǐng)日期2009年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月3日
發(fā)明者吳紅平, 艷 常, 李琳芳, 李金蘭, 牛繼紅, 敏 謝, 錢其軍, 阮國(guó)瑞, 陳珊珊, 馬大龍, 黃曉軍 申請(qǐng)人:北京大學(xué)人民醫(yī)院