專利名稱：一種構(gòu)建組織工程皮膚的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種構(gòu)建組織工程皮膚的方法。
背景技術(shù)：
皮膚是人體最大的器官，它由三部分即表皮層、真皮層和皮下層構(gòu)成。表皮層位于皮膚的最外層，厚度介于0.06-0.8mm之間，其微結(jié)構(gòu)由基底層、棘細(xì)胞層、顆粒細(xì)胞層和角質(zhì)層構(gòu)成。角質(zhì)層是表皮細(xì)胞分化的最后產(chǎn)物，其組成中75%-80%為蛋白質(zhì)，5%-15%為脂類，由10-15層細(xì)胞構(gòu)成厚度大約10pm的結(jié)構(gòu)。角質(zhì)層有著許多重要的生理功能，能夠有效阻擋外界毒性化合物對(duì)皮膚活性細(xì)胞的損傷，特別是對(duì)化妝品成分中潛在可能產(chǎn)生的細(xì)胞毒性有著極為重要的屏障作用。
組織工程皮膚經(jīng)歷了從表皮替代物、真皮替代物到雙層結(jié)構(gòu)的組織工程皮膚替代物的階段，其基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究有了廣泛的進(jìn)步。應(yīng)用研究涉及體內(nèi)應(yīng)用和體外應(yīng)用，體內(nèi)應(yīng)用集中在各種皮膚創(chuàng)傷的治療，體外主要運(yùn)用于化合物的毒性檢測(cè)，如化合物的腐蝕性、刺激性、光毒性、生殖毒性等的檢測(cè)。體外毒性檢測(cè)方面，歐洲替代方法驗(yàn)證中心(ECVAM)主導(dǎo)的對(duì)各種動(dòng)物替代方法進(jìn)行的驗(yàn)證工作是一項(xiàng)系統(tǒng)工程，引起了世界范圍的關(guān)注。以組織工程皮膚為例，進(jìn)行的化合物腐蝕性檢測(cè)目前只有EpiDerm和EpiSkin兩種產(chǎn)品通過驗(yàn)證，刺激性檢測(cè)目前僅有EpiSkin通過了驗(yàn)證。通過驗(yàn)證的組織工程皮膚產(chǎn)品數(shù)量之所以如此少，很大程度上是因?yàn)闃?gòu)建的組織工程皮膚與天然皮膚在結(jié)構(gòu)上相差甚遠(yuǎn)所致。因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)的不成熟，造成檢測(cè)化合物對(duì)活性細(xì)胞產(chǎn)生的毒性與其本身體內(nèi)產(chǎn)生毒性的數(shù)據(jù)不符，導(dǎo)致誤判率偏高，不能達(dá)到在功能檢測(cè)上要求的預(yù)測(cè)精確度。
目前，有關(guān)提高組織工程皮膚與天然皮膚在結(jié)構(gòu)上的相似性的研究較多，眾多研究均有力的證實(shí)組織工程皮膚構(gòu)建過程中的種子細(xì)胞與生物支架之間的相互作用對(duì)組織工程皮膚的結(jié)構(gòu)有著極為重要的影響。因此，在選擇生物支架材料上的一個(gè)基本原則是盡可能的接近或者模擬天然皮膚的細(xì)胞外基質(zhì)。而天然皮膚的真皮層主要是由成纖維細(xì)胞構(gòu)成的，其細(xì)胞外基質(zhì)也主要由成纖維細(xì)胞分泌得來。所以，培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞所分泌的細(xì)胞外基質(zhì)在組成和結(jié)構(gòu)上與天然皮膚非常類似。利用這種自分泌細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)建的組織工程皮膚在結(jié)構(gòu)上更接近天然皮膚的結(jié)構(gòu)，在化合物毒性預(yù)測(cè)的精確度和靈敏度上必然進(jìn)一步提高。經(jīng)檢索，有關(guān)利用自分泌細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)建組織工程皮膚的方法，至今尚未見有技術(shù)文獻(xiàn)公開。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用自分泌細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)建組織工程皮膚的方法。
一種構(gòu)建組織工程皮膚的方法，在所述構(gòu)建方法中，釆用成纖維細(xì)胞的自分泌細(xì)胞外基質(zhì)作為組織工程皮膚的生物支架。
本發(fā)明的方法，具體包括以下步驟-
(1) 將插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿放入細(xì)胞培養(yǎng)孔板中，將1~10乂105個(gè)人源成纖維細(xì)胞與l~3mL細(xì)胞培養(yǎng)液充分混合，得細(xì)胞懸液，將該細(xì)胞懸液滴加到插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿，在37'C，5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 30天，每周換液兩次，得成纖維細(xì)胞與自分泌細(xì)胞外基質(zhì)的復(fù)合物；
(2) 將步驟(1)得到的成纖維細(xì)胞與自分泌細(xì)胞外基質(zhì)的復(fù)合物浸泡在無菌PBS中，在37°C， 5%<302培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，使成纖維細(xì)胞饑餓而死亡，得不含活細(xì)胞的自分泌細(xì)胞外基質(zhì)；
(3) 將歩驟(2)得到的不含活細(xì)胞的自分泌細(xì)胞外基質(zhì)紫外線照射0.5 5h;
(4) 在歩驟(3)處理后的基質(zhì)上面添加l~10X105/mL人源表皮細(xì)胞懸液lmL，繼續(xù)培養(yǎng)lh后，添加培養(yǎng)液3 5mL，繼續(xù)培養(yǎng)5天，得到組織工程皮膚雛形；將所得到的組織工程皮膚維形進(jìn)行氣液面培養(yǎng)10 20天結(jié)束，即獲得利用自分泌細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)建的組織工程皮膚。
根據(jù)本發(fā)明的方法構(gòu)建組織工程皮膚，利用培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞所分泌的細(xì)胞外基質(zhì)作為生物支架，人源表皮細(xì)胞作為種子細(xì)胞，培養(yǎng)得到的組織工程皮膚更接近天然皮膚的結(jié)構(gòu)，利于提高化合物毒性的預(yù)測(cè)靈敏度和精確度。
本發(fā)明的方法具有以下優(yōu)點(diǎn) 一是方法簡(jiǎn)便，所有材料均以液體形式，便于產(chǎn)品的合成和規(guī)模生產(chǎn)；二是獲得的產(chǎn)品具有更接近天然皮膚的結(jié)構(gòu)，利于提高化合物毒性的預(yù)測(cè)靈敏度和精確度；三是產(chǎn)品不含有另外添加的生物材料，不會(huì)出現(xiàn)人畜共患病交叉感染的風(fēng)險(xiǎn)；四是獲得的產(chǎn)品便于質(zhì)量控制，縮小批次之間變異。
具體實(shí)施例方式
為進(jìn)一步說明本發(fā)明，結(jié)合以下實(shí)施例具體闡述-
實(shí)施例1:
一種利用自分泌細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)建組織工程皮膚的方法，包括以下步驟
(1)將插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿放入細(xì)胞培養(yǎng)孔板中，將1乂105個(gè)人源成纖維細(xì)胞與lmL細(xì)胞培養(yǎng)液充分混合，得細(xì)胞懸液，將該細(xì)胞懸液滴加到插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿，在37'C， 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天，每周換液兩次，得成纖維細(xì)胞與自分泌細(xì)胞外基質(zhì)的復(fù)合物；
(2) 將步驟(1)得到的成纖維細(xì)胞與自分泌細(xì)胞外基質(zhì)的復(fù)合物浸泡在無菌PBS中，在37°C， 5%(302培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，使成纖維細(xì)胞饑餓而死亡，得不含活細(xì)胞的自分泌細(xì)胞外基質(zhì)；
(3) 將歩驟(2)得到的不含活細(xì)胞的自分泌細(xì)胞外基質(zhì)紫外線照射lh;
(4) 在步驟(3)處理后的基質(zhì)上面添加1X10VmL人源表皮細(xì)胞懸液lmL，繼續(xù)培養(yǎng)lh后，添加培養(yǎng)液3 5mL，繼續(xù)培養(yǎng)5天，得到組織工程皮膚雛形；將所得到的組織工程皮膚雛形進(jìn)行氣液面培養(yǎng)10~20天結(jié)束，即獲得利用自分泌細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)建的組織工程皮膚。
實(shí)施例2:
一種利用自分泌細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)建組織工程皮膚的方法，包括以下步驟(1 )將插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿放入細(xì)胞培養(yǎng)孔板中，將5 X 105個(gè)人源成纖維細(xì)胞與2mL細(xì)胞培養(yǎng)液充分混合，得細(xì)胞懸液，將該細(xì)胞懸液滴加到插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿，在37'C， 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20天，每周換液兩次，得成纖維細(xì)胞與自分泌細(xì)胞外基質(zhì)的復(fù)合物；
(2) 將步驟(1)得到的成纖維細(xì)胞與自分泌細(xì)胞外基質(zhì)的復(fù)合物浸泡在無菌PBS中，在37°C， 5。/。C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，使成纖維細(xì)胞饑餓而死亡，得不含活細(xì)胞的自分泌細(xì)胞外基質(zhì)；
(3) 將步驟(2)得到的不含活細(xì)胞的自分泌細(xì)胞外基質(zhì)紫外線照射3h;
(4) 在步驟(3)處理后的基質(zhì)上面添加5X105/mL人源表皮細(xì)胞懸液lmL，繼續(xù)培養(yǎng)lh后，添加培養(yǎng)液3 5mL，繼續(xù)培養(yǎng)5天，得到組織工程皮膚雛形；將所得到的組織工程皮膚雛形進(jìn)行氣液面培養(yǎng)10~20天結(jié)束，即獲得利用自分泌細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)建的組織工程皮膚。、
實(shí)施例3:
一種利用自分泌細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)建組織工程皮膚的方法，包括以下步驟(1)將插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿放入細(xì)胞培養(yǎng)孔板中，將10X 105個(gè)人源成纖維細(xì)胞與3mL細(xì)胞培養(yǎng)液充分混合，得細(xì)胞懸液，將該細(xì)胞懸液滴加到插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿，在37°C，
55%<:02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30天，每周換液兩次，得成纖維細(xì)胞與自分泌細(xì)胞外基質(zhì)的復(fù)
合物；
(2) 將步驟(1)得到的成纖維細(xì)胞與自分泌細(xì)胞外基質(zhì)的復(fù)合物浸泡在無菌PBS中，在 37°C， 5%(:02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，使成纖維細(xì)胞饑餓而死亡，得不含活細(xì)胞的自分泌 細(xì)胞外基質(zhì)；
(3) 將步驟(2)得到的不含活細(xì)胞的自分泌細(xì)胞外基質(zhì)紫外線照射5h;
(4) 在步驟(3)處理后的基質(zhì)上面添加10X 105/mL人源表皮細(xì)胞懸液lmL，繼續(xù)培養(yǎng)lh 后，添加培養(yǎng)液3 5mL，繼續(xù)培養(yǎng)5天，得到組織工程皮膚雛形；將所得到的組織工 程皮膚雛形進(jìn)行氣液面培養(yǎng)10 20天結(jié)束，即獲得利用自分泌細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)建的組織 工程皮膚。
以上所述的實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行 限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通工程技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作 出的各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1、一種構(gòu)建組織工程皮膚的方法，其特征在于在所述構(gòu)建方法中，采用成纖維細(xì)胞的自分泌細(xì)胞外基質(zhì)作為組織工程皮膚的生物支架。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于包括以下步驟(1) 將插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿放入細(xì)胞培養(yǎng)孔板中，將l-10Xl()S個(gè)人源成纖維細(xì)胞與1 3mL 細(xì)胞培養(yǎng)液充分混合，得細(xì)胞懸液，將該細(xì)胞懸液滴加到插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿，在37'C， 5%<302培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 30天，每周換液兩次，得成纖維細(xì)胞與自分泌細(xì)胞外基質(zhì)的 復(fù)合物；(2) 將步驟(1)得到的成纖維細(xì)胞與自分泌細(xì)胞外基質(zhì)的復(fù)合物浸泡在無菌PBS中，在 37°C， 5%<302培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，使成纖維細(xì)胞饑餓而死亡，得不含活細(xì)胞的自分泌 細(xì)胞外基質(zhì)；(3) 將步驟(2)得到的不含活細(xì)胞的自分泌細(xì)胞外基質(zhì)紫外線照射0.5 5h;(4) 在步驟(3)處理后的基質(zhì)上面添加l~10X105/mL人源表皮細(xì)胞懸液lmL，繼續(xù)培養(yǎng) lh后，添加培養(yǎng)液3 5mL，繼續(xù)培養(yǎng)5天，得到組織工程皮膚雛形；將所得到的組織 工程皮膚雛形進(jìn)行氣液面培養(yǎng)10-20天結(jié)束，即獲得利用自分泌細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)建的組 織工程皮膚。
3、 權(quán)利要求1或2所述的方法構(gòu)建的組織工程皮膚。
全文摘要
一種構(gòu)建組織工程皮膚的方法，在所述構(gòu)建方法中，采用成纖維細(xì)胞的自分泌細(xì)胞外基質(zhì)作為組織工程皮膚的生物支架。本發(fā)明利用培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞所分泌的細(xì)胞外基質(zhì)作為生物支架，人源表皮細(xì)胞作為種子細(xì)胞，培養(yǎng)得到的組織工程皮膚更接近天然皮膚的結(jié)構(gòu)；本發(fā)明的方法具有以下優(yōu)點(diǎn)一是方法簡(jiǎn)便，所有材料均以液體形式，便于產(chǎn)品的合成和規(guī)模生產(chǎn)；二是獲得的產(chǎn)品具有更接近天然皮膚的結(jié)構(gòu)，利于提高化合物毒性的預(yù)測(cè)靈敏度和精確度；三是產(chǎn)品不含有另外添加的生物材料，不會(huì)出現(xiàn)人畜共患病交叉感染的風(fēng)險(xiǎn)；四是獲得的產(chǎn)品便于質(zhì)量控制，縮小批次之間變異。
文檔編號(hào)A61L27/60GK101485905SQ20091007835
公開日2009年7月22日 申請(qǐng)日期2009年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月26日
發(fā)明者楊曉冉, 王軍兵, 艷 程, 董益陽(yáng), 鄒運(yùn)動(dòng), 鄭洪艷 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院