專利名稱：一種普蘭林肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種普蘭林肽的制備方法，特別是一種采用收斂合成制備方法。

背景技術(shù)：
普蘭林肽(式I)是人工合成的胰淀素類似物，是穩(wěn)定的水溶性物質(zhì)，結(jié)構(gòu)特征為胰淀素25位的丙氨酸、28位和29位的絲氨酸用脯氨酸代替，普蘭林肽作用與胰淀素類似，通過減慢餐后胃排空速度而控制餐后血糖，作用維持約3h，但并不改變碳水化合物和其他營養(yǎng)物質(zhì)吸收的總量。同時(shí)，其抑制餐后胰高血糖素的分泌和引起飽腹感也可起到控制血糖的作用。其可抑制食欲，可能有降低體重的作用，其用于1型和2型成人糖尿病患者控制血糖，也是目前除胰島素外唯一可用于治療1型糖尿病的藥物。

WO-A-93/10146和US-A-5424394報(bào)道了一種采用固相合成法制備普蘭林肽的方法，選擇一個(gè)組成多肽羧基端的氨基酸固定在不溶性樹脂上，在此樹脂上將需要的單個(gè)的氨基酸依次通過共價(jià)鍵的方式偶聯(lián)上去來延長肽鏈，合成多肽。首先選擇將賴氨酸(Lys)固定在不溶性樹脂上，然后把需要的氨基酸依次偶聯(lián)上去，接著使肽鏈的2位和7位兩個(gè)半胱氨酸發(fā)生分子內(nèi)環(huán)合，得到二硫基橋鍵，最后脫除固定樹脂，依次類推，逐個(gè)將單個(gè)的氨基酸連接上去，最終制備得到普蘭林肽。很顯然對于包含37個(gè)氨基酸的普蘭林肽來說，該方法的合成路線很長，固相合成的純化方法是每步反應(yīng)后洗滌樹脂，來達(dá)到純化目的，而且普蘭林肽中有很多重復(fù)的氨基酸片段，需要多次重復(fù)偶聯(lián)，因此整個(gè)工藝操作繁瑣，收率極低，成本很高，不適合工業(yè)化。
WO2006/045603報(bào)道了另外一種利用固相合成法制備普蘭林肽的方法，首先選擇設(shè)計(jì)組成普蘭林肽的幾個(gè)組成合理的氨基酸殘基片段，然后通過收斂合成以共價(jià)鍵的形式將幾個(gè)片段合理的偶聯(lián)起來，制備得到普蘭林肽。該路線采用的收斂合成法是制備多肽化合物的有效方法，但收斂合成法的關(guān)鍵是找到合適的氨基酸片段和偶聯(lián)順序以克服偶聯(lián)困難，產(chǎn)物難以分離的問題以及偶聯(lián)反應(yīng)時(shí)末端手性碳原子的外消旋化。很顯然，包含37個(gè)氨基酸的普蘭林肽有很多可能的合成片段和偶聯(lián)順序，而目前的專利技術(shù)中沒有做詳細(xì)的研究報(bào)道，而且采用的片段，偶聯(lián)順序均較隨意，整個(gè)設(shè)計(jì)不太合理，合成分離困難，操作復(fù)雜，收率較低，而且成本較高，不適合工業(yè)化。
WO2009/003666報(bào)道了一種另外一種普蘭林肽的制備方法，
13 24 Ala-Asn-Phe-Leu-Val-His-Ser-Asn-Asn-Phe-Gly-OH (III) 25 37 Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr-NH2(IV) 該方法同樣是采用收斂合成法，共有6步反應(yīng)，設(shè)計(jì)制備普蘭林肽的三個(gè)合理的片段，即(I)、(III)和(IV)，同時(shí)采用如下偶聯(lián)順序先(III)和(IV)偶聯(lián)，再與(II)發(fā)生偶聯(lián)制備得到普蘭林肽，整個(gè)路線設(shè)計(jì)相對合理，操作簡單，但每個(gè)片段包含12個(gè)氨基酸片段，比較長，合成路線較長，每次洗脫樹脂損失嚴(yán)重，而且連接處氨基酸活性基團(tuán)，位阻較大，反應(yīng)效率較低，成本較高，不太適合工業(yè)化。
鑒于普蘭林肽及其鹽、特別是其醋酸鹽的藥學(xué)價(jià)值，有必要通過更有效的合成方法得到普蘭林肽，我們本著反應(yīng)步驟較少，原料易得，操作簡單，收率較高，處理“三廢”成本較低，適合工業(yè)化生產(chǎn)的原則，發(fā)明了一種普蘭林肽合成的新路線。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種普蘭林肽的制備方法，包含采用1-8，9-19，20-28，29-37的四個(gè)氨基酸殘基片段，通過收斂包含1-8，9-19，20-28，29-37的四個(gè)氨基酸殘基片段通過收斂合成，制備包含37個(gè)氨基酸序列的普蘭林肽。本制備方法采用的氨基酸片段長度合適，不僅降低了損失，減少了末端手性碳的異構(gòu)化，而且片段之間的連接氨基酸，結(jié)構(gòu)簡單，活性基團(tuán)單一，位阻較小，偶聯(lián)收率較高，易于純化。
更具體的講，本發(fā)明提供的普蘭林肽制備方法，首先通過固相合成法制備得到氨基酸殘基片段式(V)，(VI)，(VII)，(VIII)化合物
其中Boc，F(xiàn)moc，Trt，tBu，Pbf分別代表保護(hù)基。
首先將(VI)與(VII)偶聯(lián)得到(IX)
然后(IX)與(VIII)偶聯(lián)得到(X)
接著(X)與(V)偶聯(lián)得到(XI)
最后脫保護(hù)，純化得到藥用的一種多肽普蘭林肽。
按照本發(fā)明專利，四個(gè)氨基酸殘基片段(V)，(VI)，(VII)，(VIII)的合成以及偶聯(lián)順序構(gòu)成了其核心，使用該方法制備普蘭林肽的工藝起始原料易于獲得，步驟相對較短，反應(yīng)操作簡單，產(chǎn)品易于分離純化，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，經(jīng)過三批放大實(shí)驗(yàn)，整合成本，環(huán)保以及操作等方面考慮，確定為目前合成普蘭林肽的較佳合成方法，推進(jìn)了普蘭林肽的工業(yè)化生產(chǎn)。
實(shí)例說明 下面的實(shí)施例闡述了本發(fā)明。
實(shí)施例1式(V)化合物制備 Fmoc(Ala)-OH按照0.64mmol/g的量固定到80g的CTC不溶性樹脂上，以TCTU/6-Cl-HOBt/DIEA為反應(yīng)偶聯(lián)試劑，將待偶聯(lián)的氨基酸以2.5當(dāng)量的投料，先在0-5℃去活化，然后再轉(zhuǎn)入多肽合成儀，在20℃下偶聯(lián)反應(yīng)。每次偶聯(lián)完成以KSEISER TEST和HPLC檢測，偶聯(lián)完成后，在30℃下，用20％(wt)的piperidine的N-甲基吡咯烷酮中去除Fmoc保護(hù)基，然后在0℃下，在DMF溶劑中，用3當(dāng)量的碘合成2，7兩個(gè)半胱氨酸的二硫橋鍵，接著用1％的TFA的二氯甲烷溶液把合成的多肽從樹脂上洗脫下來，濃縮溶劑得到淡黃色油狀物，用水沉淀，抽濾，干燥得到162.3g白色粉末。
實(shí)施例2式(VI)化合物制備 Fmoc(Ser)-OH按照0.66mmol/g的量固定到80g的CTC不溶性樹脂上，以DIC/6-Cl-HOBt/DIEA為反應(yīng)偶聯(lián)試劑，將待偶聯(lián)的氨基酸以2.2-2.5當(dāng)量的投料，先在0-5℃去活化，然后再轉(zhuǎn)入多肽合成儀，在20℃下偶聯(lián)反應(yīng)。每次偶聯(lián)完成以KSEISER TEST和HPLC檢測，偶聯(lián)完成后，在30℃下，用20％(wt)的piperidine的N-甲基吡咯烷酮中去除Fmoc保護(hù)基，接接著用2％的TFA的二氯甲烷溶液把合成的多肽從樹脂上洗脫下來，濃縮溶劑得到淡黃色油狀物，用水沉淀，抽濾，干燥得到113.6g多肽粗品。
實(shí)施例3式(VII)化合物制備 Fmoc(Pro)-OH按照0.55mmol/g的量固定到150g的CTC不溶性樹脂上，以TCTU/6-Cl-HOBt/DIEA為反應(yīng)偶聯(lián)試劑，將待偶聯(lián)的氨基酸以2.5當(dāng)量的投料，先在0-5℃去活化，然后再轉(zhuǎn)入多肽合成儀，在20℃下偶聯(lián)反應(yīng)。每次偶聯(lián)完成以KSEISER TEST和HPLC檢測，偶聯(lián)完成后，在30℃下，用20％(wt)的piperidine的N-甲基吡咯烷酮中去除Fmoc保護(hù)基，接接著用3％的TFA的二氯甲烷溶液把合成的多肽從樹脂上洗脫下來，濃縮溶劑得到淡黃色油狀物，用水沉淀，抽濾，干燥得到119.26g白色粉末。
實(shí)施例4式(VIII)化合物制備 Fmoc(Gly)-OH按照0.56mmol/g的量固定到150g的CTC不溶性樹脂上，以TCTU/DIEA為反應(yīng)偶聯(lián)試劑，將待偶聯(lián)的氨基酸以2.5當(dāng)量的投料，先在0-5℃去活化，然后再轉(zhuǎn)入多肽合成儀，在20℃下偶聯(lián)反應(yīng)。每次偶聯(lián)完成以KSEISER TEST和HPLC檢測，偶聯(lián)完成后，在30℃下，用20％(wt)的piperidine的N-甲基吡咯烷酮中去除Fmoc保護(hù)基，接接著用5％的TFA的二氯甲烷溶液把合成的多肽從樹脂上洗脫下來，濃縮溶劑得到淡黃色油狀物，用水沉淀，抽濾，干燥得到121.4g白色粉末。
實(shí)施例5式(IX)化合物制備 將自制的(VI)化合物3.6g，先在0.31g 6-Cl-HOBt，0.63g TCTU和0.60g DIEA的52g DMF溶液中預(yù)活化10min，然后將3.2g自制的(VII)化合物的0.70g DIEA加入反應(yīng)體系，進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，30min后，補(bǔ)加0.1g 6-Cl-HOBt和0.2g TCTU，維持20℃下反應(yīng)3h，反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)混合物倒入0-5℃冷水中，有沉淀出現(xiàn)，抽濾，洗滌干燥，得到多肽5.63g。
實(shí)施例6式(X)化合物制備 將自制的(IX)化合物4.2g，先在0.42g 6-Cl-HOBt，0.72g TCTU和0.76g DIEA的70g DMF溶液中預(yù)活化10min，然后將3.3g自制的(VIII)化合物的0.5g DIEA加入反應(yīng)體系，進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，30min后，補(bǔ)加0.10g 6-Cl-HOBt和0.18g TCTU，維持40℃下反應(yīng)2h，反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)混合物倒入0-5℃冷水中，有沉淀出現(xiàn)，抽濾，洗滌干燥，得到多肽7.34g。
實(shí)施例7式(XI)的制備 將自制的(X)化合物6.94g，先在0.53g 6-Cl-HOBt，0.84g TCTU和0.91g DIEA的80g DMF溶液中預(yù)活化10min，然后將3.61g自制的(V)化合物的0.60g DIEA加入反應(yīng)體系，進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，30min后，補(bǔ)加0.10g 6-Cl-HOBt和0.18g TCTU，維持30℃下反應(yīng)3h，反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)混合物倒入0-5℃冷水中，有沉淀出現(xiàn)，抽濾，洗滌干燥，得到多肽10.24g。
實(shí)施例8普蘭林肽的制備 將實(shí)施例6制備的保護(hù)的普蘭林肽(XI)10.0g，溶解在100mlTFA，3ml三異丙基硅烷和3.0g苯酚中，維持20℃下反應(yīng)4h，加入600ml異丙醚，有大量沉淀出現(xiàn)，抽濾，干燥得到7.9g普蘭林肽粗品。將普蘭林肽粗品用HPLC純化柱子20*2.5cm，流速30ml/min；流動(dòng)相乙腈/1％乙酸；多肽流速8mg/ml.純化后得到普蘭林肽5.9g，純度97.3％。
權(quán)利要求
1.一種普蘭林肽(式I化合物)的制備方法，包括將式V、式VI、式VII、式VIII化合物的對接步驟，
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于式VI化合物與式VII化合物固相生成式IX化合物，
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征在于式IX化合物與式VIII化合物固相生成式X化合物
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于式X化合物與式V化合物固相生成式XI化合物
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征在于式XI化合物在三異丙基硅烷和苯酚中使用1％-5％TFA脫除保護(hù)基。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種普蘭林肽(式I化合物)的制備方法，包括將式V、式VI、式VII、式VIII化合物的對接步驟，普蘭林肽為一種極具藥理和治療特性的多肽類藥物。
文檔編號(hào)A61P3/10GK101824086SQ20091007913
公開日2010年9月8日 申請日期2009年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月4日
發(fā)明者馬永, 郭夏, 張志強(qiáng) 申請人:北京德眾萬全藥物技術(shù)開發(fā)有限公司