專利名稱：一種熊膽大分子提取物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種熊膽大分子提取物及其制備方法和用途，特別涉及一種具有抗丙 型肝炎病毒作用的熊膽大分子提取物及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
“肝炎”是由肝炎病毒所引起的，流行范圍廣，發(fā)病率高的一種傳染病，統(tǒng)稱為“病 毒性肝炎”。丙型肝炎(h印atitis C)最初被定義為輸血后非甲非乙型肝炎，1989年Choo 等成功地從受感染的黑猩猩血液中克隆出丙型肝炎病毒cDNA，從而確認其病原體為丙型肝 炎病毒(h印atitis C virus，HCV)。丙型肝炎是一種全球性分布的病毒性傳染疾病，其感染 面廣，傳染性強，且易慢性化，較之艾滋病能造成更多人的死亡，感染患者數(shù)量也已經(jīng)3倍 于艾滋病，達到全球人口約2% 3%，我國為0. 7% -3. 1%。HCV感染者80%可發(fā)展為慢 性肝炎，其中至少20%可發(fā)展為肝硬化，15%可轉(zhuǎn)移為肝癌。全球各地共有1. 7億人感染該 病毒，可造成永久性肝損害，甚至導(dǎo)致死亡。目前HCV尚無特效藥物，臨床上使用核苷類藥物利巴韋林(三氮唑核苷)、阿昔洛 韋(無環(huán)鳥苷)和更昔洛韋等。其中，利巴韋林作為核苷類老產(chǎn)品對丙肝病毒具有較強阻 斷復(fù)制作用。尤其使用干擾素與利巴韋林聯(lián)合治療丙型肝炎，雖有控制病情的效果，但不能 清除病毒，其持續(xù)性病毒應(yīng)答率(sustained virologic response rates, SVR)不理想，對 其完全有反應(yīng)者僅占50 %左右，對合并HIV感染者SVR更低，在30 %左右。此外，此類藥物 費用高，停藥易反跳，且毒副作用給患者帶來相當大的危害，因此尋找抗丙型肝炎的高效低 毒藥物是當務(wù)之急。近年來，隨著的對HCV病毒生命周期各復(fù)制環(huán)節(jié)的深入研究，發(fā)現(xiàn)了一些有前景 的藥物作用靶點。例如，HCV NS3 protease，它是HCV復(fù)制過程中必需的蛋白酶，該酶編碼 為絲氨酸蛋白酶和核苷三磷酸酶/解螺旋酶(NTPase/helicase)，它需要NS4A蛋白做為輔 因子，從而使活性達到最佳狀態(tài)。HCV NS3/4A protease是病毒復(fù)制及傳染病毒顆粒形成的 關(guān)鍵酶，是HCV抑制劑富有魅力的靶點。尋找和發(fā)現(xiàn)HCV NS3/4A protease抑制劑時發(fā)現(xiàn) 抗丙肝藥物的有效途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種具有抗丙型肝炎病毒(HCV NS3/4A protease抑制)作 用的熊膽大分子提取物；本發(fā)明另一個目的在于提供該大分子提取物的制備方法；本發(fā)明 的目的還在于提供了該提取物的用途。本發(fā)明目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)本發(fā)明熊膽大分子提取物制備方法包括如下步驟取熊膽粉加水溶解，配置成濃度為10 100mg/ml的熊膽水溶液，用10萬級分子 篩濾膜在離心力4000Xg條件下離心10 60分鐘，或直接取新鮮熊膽，用10萬級分子篩 濾膜在離心力4000Xg條件下離心1 2小時；過濾，取沉淀以水溶解，上樣于預(yù)處理好的Sephadex G100型葡聚糖凝膠柱，以水或緩沖溶液為洗脫溶劑分離，收集在280nm下有吸收 的洗脫部位，冷凍干燥，得熊膽大分子提取物。本發(fā)明熊膽大分子提取物制備方法優(yōu)選如下步驟取熊膽粉加水溶解，配置成濃度為50mg/ml的熊膽水溶液，用10萬級分子篩濾膜 在離心力4000 X g條件下離心30分鐘，或直接取新鮮熊膽，用10萬級分子篩濾膜在離心力 4000Xg條件下離心1. 5小時；過濾，取沉淀以水溶解，上樣于預(yù)處理好的S印hadex G100型 葡聚糖凝膠柱，以水或緩沖溶液為洗脫溶劑分離，收集在280nm下有吸收的洗脫部位，冷凍 干燥，得熊膽大分子提取物。本發(fā)明熊膽大分子提取物制備方法優(yōu)選如下步驟取熊膽粉加水溶解，配置成濃度為20mg/ml的熊膽水溶液，用10萬級分子篩濾膜 在離心力4000Xg條件下離心15分鐘，或直接取新鮮熊膽，用10萬級分子篩濾膜在離心力 4000Xg條件下離心1小時；過濾，取沉淀以水溶解，上樣于預(yù)處理好的S印hadex G100型 葡聚糖凝膠柱，以水或緩沖溶液為洗脫溶劑分離，收集在280nm下有吸收的洗脫部位，冷凍 干燥，得熊膽大分子提取物。本發(fā)明熊膽大分子提取物制備方法優(yōu)選如下步驟取熊膽粉加水溶解，配置成濃度為90mg/ml的熊膽水溶液，用10萬級分子篩濾膜 在離心力4000 X g條件下離心50分鐘，或直接取新鮮熊膽，用10萬級分子篩濾膜在離心力 4000Xg條件下離心2小時；過濾，取沉淀以水溶解，上樣于預(yù)處理好的S印hadex G100型 葡聚糖凝膠柱，以水或緩沖溶液為洗脫溶劑分離，收集在280nm下有吸收的洗脫部位，冷凍 干燥，得熊膽大分子提取物。其中，所述緩沖溶液為磷酸鹽緩沖液、枸櫞酸鹽緩沖液或醋酸鹽緩沖溶液；上述 10萬級分子篩濾膜可以用10萬級超濾膜代替；上述S印hadex G100型葡聚糖凝膠可以用 Sephadex G150型葡聚糖凝膠、S印hadex G200型葡聚糖凝膠、丙烯葡聚糖凝膠S-100或 DEAE-A50葡聚糖凝膠代替。取本發(fā)明熊膽大分子提取物加入常規(guī)輔料，按照常規(guī)工藝，制成臨床或藥學(xué)上可 接受的粉針劑、水針劑、氣霧劑、栓劑、洗劑、貼劑或膏劑等肌肉、靜脈、皮下及粘膜給藥劑 型，以及膠囊劑、片劑、緩釋劑或口服液體制劑。本發(fā)明是以熊膽大分子提取物及含有熊膽大分子提取物的復(fù)方制劑來治療丙型 肝炎的新方法，熊膽粉抗HCV NS3/4A protease作用的有效性，將會成為是抗HCV藥物研發(fā) 的一個新亮點，中藥的低毒副作用特點，也會使熊膽粉成為較安全的高效價藥物，避免醫(yī)源 性疾病的發(fā)生；它的研制成功將更會使全球約2% 3% HCV感染者，擺脫進一步惡化為慢 性肝炎、肝硬化及肝癌的困擾，擁有健康的體魄同時，使HCV從嚴重影響人類健康的傳染性 疾病譜中剔除。


圖1 在280nm監(jiān)測條件下不同葡聚糖凝膠對活性部位的分離效果比較。下面實驗例用于進一步說明但不限于本發(fā)明。實驗例1熊膽粉及其他動物膽汁抗丙型肝炎病毒(HCV) PR作用比較1、活性測定試劑
底物HCV NS3/4A蛋白酶底物，蛋白酶HCV NS3/4A蛋白酶
檢測器熒光檢測器(Ex/Em = 485/535nm)2、活性測定結(jié)果采用HCV PR活性測定方法，比較不同動物膽汁對于HCV PR的抑制作用，結(jié)果顯示 熊膽的IC5tl為0. 2ug/ml，這種高活性無論在中藥還是西藥中都是少有的，而其他動物膽汁 均無此作用或作用極弱(表1)。表1熊膽及其他動物膽汁對丙型肝炎病毒的抑制作用比較 實驗例2本發(fā)明熊膽大分子提取物抗HCV PR活性研究1、離心分離材料=Millipore分子篩濾膜(截流分子量范圍10萬級)樣品液熊膽粉不同分子量部位的水溶液，濃度為25mg/ml離心條件離心力4000 Xg條件下離心20分鐘。對離心分離或膜過濾分離得到的兩部位溶液分別凍干，按相同的方法進行活性測 定，見表2 表2離心分離不同部位抗HCV PR活性比較結(jié)果(100ug/ml) 測定結(jié)果表明，熊膽粉中抗HCV PR的活性部位的分子量范圍為大于10萬級的大 分子物質(zhì)。2、活性部位進一步分離(I)Sephadex GlOO型葡聚糖凝膠分離根據(jù)S印hadex GlOO型葡聚糖凝膠要求進行預(yù)處理后，裝柱；取熊膽粉加水溶解， 配置成濃度為20mg/ml的熊膽水溶液，用10萬級分子篩濾膜在離心力4000 Xg條件下離心 15分鐘，或直接取新鮮熊膽，用10萬級分子篩濾膜在離心力4000Xg條件下離心1小時； 過濾，取沉淀以水溶解，溶液上樣，以水為洗脫液進行洗脫，得到4個洗脫部位1、黃色，在 280nm處有強吸收；2、淡黃色，在280nm有弱吸收；3、近無色，在280nm處無吸收；4、無色，在280nm處無吸收?；钚圆课恢饕性谠?80nm處有強吸收的第1部位。見表3 表3不同洗脫部位抗HCV PR測定結(jié)果(100 u g/ml) (2)其他類型填料的分離作用分別采用CM-S印hadex、Sephadex G50、Sepharose 6B 和 S印hacrylS-300 為分離 柱填料，取熊膽粉加水溶解，配置成濃度為20mg/ml的熊膽水溶液，用10萬級分子篩濾膜在 離心力4000Xg條件下離心15分鐘，或直接取新鮮熊膽，用10萬級分子篩濾膜在離心力 4000Xg條件下離心1小時；過濾，取沉淀以水溶解，水溶液上樣，以水為洗脫液進行洗脫， 3ml/流分進行接收，280nm條件下監(jiān)測分離效能，結(jié)果表明四種介質(zhì)均不能實現(xiàn)進一步分 離的目的(附圖1)。下述實施例均能實現(xiàn)上述實驗例的效果。
具體實施例方式實施例1 水針劑的制備取熊膽粉加水溶解，配置成濃度為50mg/ml的熊膽水溶液，用10萬級分子篩濾膜 在離心力4000 X g條件下離心30分鐘，過濾，取沉淀以水溶解，上樣于預(yù)處理好的S印hadex G100型葡聚糖凝膠柱，以水為洗脫溶劑分離，收集在280nm下有吸收的洗脫部位，冷凍干 燥，得熊膽大分子提取物，加入常規(guī)輔料，按照常規(guī)工藝制成水針劑。實施例2 粉針劑的制備取熊膽粉加水溶解，配置成濃度為20mg/ml的熊膽水溶液，用10萬級分子篩濾膜 在離心力4000 X g條件下離心15分鐘，過濾，取沉淀以水溶解，上樣于預(yù)處理好的S印hadex G100型葡聚糖凝膠柱，以磷酸鹽緩沖液為洗脫溶劑分離，收集在280nm下有吸收的洗脫部 位，冷凍干燥，得熊膽大分子提取物，加入常規(guī)輔料，按照常規(guī)工藝，制成粉針劑。實施例3 氣霧劑的制備取熊膽粉加水溶解，配置成濃度為90mg/ml的熊膽水溶液，用10萬級分子篩濾膜 在離心力4000 X g條件下離心50分鐘，過濾，取沉淀以水溶解，上樣于預(yù)處理好的S印hadex G150型葡聚糖凝膠型葡聚糖凝膠柱，以枸櫞酸鹽緩沖液為洗脫溶劑分離，收集在280nm下 有吸收的洗脫部位，冷凍干燥，得熊膽大分子提取物，加入常規(guī)輔料，按照常規(guī)工藝，制成氣霧劑。實施例4 栓劑的制備取新鮮熊膽，用10萬級超濾膜在離心力4000 Xg條件下離心1小時；過濾，取沉淀 以水溶解，上樣于預(yù)處理好的S印hadex G100型葡聚糖凝膠柱，以水為洗脫溶劑分離，收集 在280nm下有吸收的洗脫部位，冷凍干燥，得熊膽大分子提取物，加入常規(guī)輔料，按照常規(guī)工藝制成栓劑。實施例5 洗劑的制備取新鮮熊膽，用10萬級分子篩濾膜在離心力4000 X g條件下離心2小時，過濾，取 沉淀；沉淀以水溶解，上樣于預(yù)處理好的S印hadex G200型葡聚糖凝膠柱，以醋酸鹽緩沖溶 液為洗脫溶劑分離，收集在280nm下有吸收的洗脫部位，冷凍干燥，得熊膽大分子提取物， 加入常規(guī)輔料，按照常規(guī)工藝，制成洗劑。實施例6:膏劑的制備取新鮮熊膽，用10萬級超濾膜在離心力4000 Xg條件下離心1. 5小時，過濾，取沉 淀；沉淀以水溶解，上樣于預(yù)處理好的丙烯葡聚糖凝膠S-100柱，以水為洗脫溶劑分離，收 集在280nm下有吸收的洗脫部位，冷凍干燥，得熊膽大分子提取物，加入常規(guī)輔料，按照常 規(guī)工藝，制成膏劑。實施例7 膠囊劑的制備取熊膽粉加水溶解，配置成濃度為50mg/ml的熊膽水溶液，用10萬級分子篩濾膜 在離心力4000Xg條件下離心30分鐘，過濾，取沉淀；沉淀以水溶解，上樣于預(yù)處理好的 DEAE-A50葡聚糖凝膠柱，以醋酸鹽緩沖溶液為洗脫溶劑分離，收集在280nm下有吸收的洗 脫部位，冷凍干燥，得熊膽大分子提取物，加入常規(guī)輔料，按照常規(guī)工藝制成膠囊劑。實施例8 口服液的制備取熊膽粉加水溶解，配置成濃度為20mg/ml的熊膽水溶液，用10萬級超濾膜在 離心力4000 X g條件下離心15分鐘，過濾，取沉淀；沉淀以水溶解，上樣于預(yù)處理好的 Sephadex G100型葡聚糖凝膠柱，以枸櫞酸鹽緩沖液為洗脫溶劑分離，收集在280nm下有 吸收的洗脫部位，冷凍干燥，得熊膽大分子提取物，加入常規(guī)輔料，按照常規(guī)工藝，制成口服液。
權(quán)利要求
一種具有抗丙型肝炎病毒作用的熊膽大分子提取物，其特征在于該熊膽大分子提取物由如下方法制成取熊膽粉加水溶解，配置成濃度為10～100mg/ml的熊膽水溶液，用10萬級分子篩濾膜在離心力4000×g條件下離心10～60分鐘，或直接取新鮮熊膽，用10萬級分子篩濾膜在離心力4000×g條件下離心1～2小時，過濾，取沉淀以水溶解，上樣于預(yù)處理好的Sephadex G100型葡聚糖凝膠柱，以水或緩沖溶液為洗脫溶劑分離，收集在280nm下有吸收的洗脫部位，冷凍干燥，得熊膽大分子提取物。
2.如權(quán)利要求1所述的熊膽大分子提取物，其特征在于該熊膽大分子提取物是由如下 方法制成取熊膽粉加水溶解，配置成濃度為50mg/ml的熊膽水溶液，用10萬級分子篩濾膜在 離心力4000Xg條件下離心30分鐘，或直接取新鮮熊膽，用10萬級分子篩濾膜在離心力 4000 X g條件下離心1. 5小時，過濾，取沉淀以水溶解，上樣于預(yù)處理好的S印hadex GlOO型 葡聚糖凝膠柱，以水或緩沖溶液為洗脫溶劑分離，收集在280nm下有吸收的洗脫部位，冷凍 干燥，得熊膽大分子提取物。
3.如權(quán)利要求1所述的熊膽大分子提取物，其特征在于該熊膽大分子提取物是由如下 方法制成取熊膽粉加水溶解，配置成濃度為20mg/ml的熊膽水溶液，用10萬級分子篩濾膜在 離心力4000Xg條件下離心15分鐘，或直接取新鮮熊膽，用10萬級分子篩濾膜在離心力 4000 X g條件下離心1小時，過濾，取沉淀以水溶解，上樣于預(yù)處理好的S印hadex GlOO型葡 聚糖凝膠柱，以水或緩沖溶液為洗脫溶劑分離，收集在280nm下有吸收的洗脫部位，冷凍干 燥，得熊膽大分子提取物。
4.如權(quán)利要求1所述的熊膽大分子提取物，其特征在于該熊膽大分子提取物是由如下 方法制成取熊膽粉加水溶解，配置成濃度為90mg/ml的熊膽水溶液，用10萬級分子篩濾膜在 離心力4000Xg條件下離心50分鐘，或直接取新鮮熊膽，用10萬級分子篩濾膜在離心力 4000 X g條件下離心2小時，過濾，取沉淀以水溶解，上樣于預(yù)處理好的S印hadex GlOO型葡 聚糖凝膠柱，以水或緩沖溶液為洗脫溶劑分離，收集在280nm下有吸收的洗脫部位，冷凍干 燥，得熊膽大分子提取物。
5.如權(quán)利要求1-4任一所述的熊膽大分子提取物，其特征在于其中所述的緩沖溶液為 磷酸鹽緩沖液、枸櫞酸鹽緩沖液或醋酸鹽緩沖溶液；10萬級分子篩濾膜為10萬級超濾膜； Sephadex GlOO型葡聚糖凝膠為S印hadeXG150型葡聚糖凝膠、Sephadex G200型葡聚糖凝 膠、丙烯葡聚糖凝膠S-100或DEAE-A50葡聚糖凝膠。
6.如權(quán)利要求1-4任一所述的熊膽大分子提取物，其特征在于取該熊膽大分子提取物 加入常規(guī)輔料，按照常規(guī)工藝，制成臨床或藥學(xué)上接受的粉針劑、水針劑、氣霧劑、栓劑、洗 齊U、貼劑、膏劑、膠囊劑、片劑、緩釋劑或口服液體制劑。
7.如權(quán)利要求5所述的熊膽大分子提取物，其特征在于取該熊膽大分子提取物加入 常規(guī)輔料，按照常規(guī)工藝，制成臨床或藥學(xué)上接受的粉針劑、水針劑、氣霧劑、栓劑、洗劑、貼 齊 、膏劑、膠囊劑、片劑、緩釋劑或口服液體制劑。
8.一種具有抗丙型肝炎病毒作用的熊膽大分子提取物制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟取熊膽粉加水溶解，配置成濃度為10 100mg/ml的熊膽水溶液，用10萬級分子篩 濾膜在離心力4000 Xg條件下離心10 60分鐘，或直接取新鮮熊膽，用10萬級分子篩濾 膜在離心力4000Xg條件下離心1 2小時，過濾，取沉淀以水溶解，上樣于預(yù)處理好的 Sephadex GlOO型葡聚糖凝膠柱，以水或緩沖溶液為洗脫溶劑分離，收集在280nm下有吸收 的洗脫部位，冷凍干燥，得熊膽大分子提取物。
9.如權(quán)利要求8所述的熊膽大分子提取物制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟取熊膽粉加水溶解，配置成濃度為50mg/ml的熊膽水溶液，用10萬級分子篩濾膜在 離心力4000Xg條件下離心30分鐘，或直接取新鮮熊膽，用10萬級分子篩濾膜在離心力 4000 X g條件下離心1. 5小時，過濾，取沉淀以水溶解，上樣于預(yù)處理好的S印hadex GlOO型 葡聚糖凝膠柱，以水或緩沖溶液為洗脫溶劑分離，收集在280nm下有吸收的洗脫部位，冷凍 干燥，得熊膽大分子提取物。
10.如權(quán)利要求8所述的熊膽大分子提取物的制備方法，其特征在于該方法包括如下 步驟取熊膽粉加水溶解，配置成濃度為20mg/ml的熊膽水溶液，用10萬級分子篩濾膜在 離心力4000Xg條件下離心15分鐘，或直接取新鮮熊膽，用10萬級分子篩濾膜在離心力 4000 X g條件下離心1小時，過濾，取沉淀以水溶解，上樣于預(yù)處理好的S印hadex GlOO型葡 聚糖凝膠柱，以水或緩沖溶液為洗脫溶劑分離，收集在280nm下有吸收的洗脫部位，冷凍干 燥，得熊膽大分子提取物。
11.如權(quán)利要求8所述的熊膽大分子提取物的制備方法，其特征在于該方法包括如下 步驟取熊膽粉加水溶解，配置成濃度為90mg/ml的熊膽水溶液，用10萬級分子篩濾膜在 離心力4000Xg條件下離心50分鐘，或直接取新鮮熊膽，用10萬級分子篩濾膜在離心力 4000 X g條件下離心2小時，過濾，取沉淀以水溶解，上樣于預(yù)處理好的S印hadex GlOO型葡 聚糖凝膠柱，以水或緩沖溶液為洗脫溶劑分離，收集在280nm下有吸收的洗脫部位，冷凍干 燥，得熊膽大分子提取物。
12.如權(quán)利要求8-11任一所述的熊膽大分子提取物的制備方法，其特征在于其中所述 的緩沖溶液為磷酸鹽緩沖液、枸櫞酸鹽緩沖液或醋酸鹽緩沖溶液；10萬級分子篩濾膜為10 萬級超濾膜；S印hadex GlOO型葡聚糖凝膠為S印hadex G150型葡聚糖凝膠、S印hadex G200 型葡聚糖凝膠、丙烯葡聚糖凝膠S-100或DEAE-A50葡聚糖凝膠。
13.如權(quán)利要求1-5任一所述的熊膽大分子提取物在制備具有抗丙型肝炎病毒作用的 藥物中的應(yīng)用。
14.熊膽在制備具有抗丙型肝炎病毒作用的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種熊膽大分子提取物，該提取物具有抗丙型肝炎病毒的作用。本發(fā)明熊膽大分子提取物，在提取過程中取熊膽粉以水溶解或新鮮熊膽，用10萬級分子篩濾膜或超濾膜離心，過濾，取沉淀，加水溶解，上葡聚糖凝膠柱，以水或緩沖溶液為洗脫溶劑分離，洗脫液冷凍干燥，得熊膽大分子提取物。實驗表明本發(fā)明熊膽大分子提取物具有抗丙型肝炎病毒的作用，可以用于治療丙型肝炎。
文檔編號A61P1/16GK101869577SQ20091008255
公開日2010年10月27日 申請日期2009年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月24日
發(fā)明者吳修紅, 孫暉, 王喜軍 申請人:王喜軍