專利名稱：甾體皂苷化合物及其制備方法與應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及留 體皂苷化合物及其制備方法與應用。
背景技術(shù)：
據(jù)《全國中藥匯編.上冊》、《實用中草藥彩色圖鑒》第二冊、《常用中藥鑒定大全》 中記載，蒺藜，別名刺蒺藜，為蒺藜科植物蒺藜Tribulus terrestris Linn.的干燥果實。目 前關(guān)于蒺藜總皂苷的藥理藥效研究報道較多，但未見對其單一成分的藥理研究。經(jīng)文獻調(diào) 研，蒺藜總皂苷主要有下列藥理活性(中國野生植物資源Vol.22No.4Aug.2003)1.對心血管系統(tǒng)的作用蒺藜總皂苷對缺氧再給氧、缺血再灌注心肌有保護作用，認為與提高機體內(nèi)源性 抗氧化能力、降低脂質(zhì)的氧化有關(guān)。臨床及實驗藥理學都證明蒺藜皂苷改善心功能、縮小心 肌梗塞面積、緩解心絞痛的癥狀、延長心絞痛的發(fā)作間期、減少心絞痛的發(fā)作次數(shù)，對陳舊 性心肌梗塞伴左室功能異常者亦能減輕其胸悶、氣促、和心悸等癥狀，增加左室收縮功能和 排血量。2.對腦血管系統(tǒng)的作用蒺藜皂苷對腦動脈硬化癥和腦血栓形成的后遺癥有較好的療效，研究顯示其能增 加腦缺血部位的血供，起到改善腦循環(huán)、保護缺血腦組織的作用。環(huán)腺苷酸(cAMP)在各種 生理過程中擔任很重要的第二信使的任務。抑制鈣依賴性的磷酸二脂酶(PDE)而使cAMP 含量升高是腦血管、冠狀動脈和外周血管擴張的一個重要機理?，F(xiàn)國內(nèi)外已將測定某化合 物對PDE是否有抑制作用作為尋找治療心血管疾病的初篩實驗。國內(nèi)外研究表明從植物中 分離得到的許多留體皂苷對PDE有抑制活性。國內(nèi)有人用蒺藜皂苷灌喂兔，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能升 高血漿cGMP和cAMP的含量。但蒺藜皂苷是否通過抑制PDE活性而增加cAMP的含量，從而 達到防治心腦血管疾病的作用目前還沒有系統(tǒng)的闡述。3.性強壯作用國內(nèi)外學者研究發(fā)現(xiàn)，蒺藜總皂苷能促進精產(chǎn)生，增加性欲；促進雌性大鼠發(fā)情， 提高生殖能力；臨床研究發(fā)現(xiàn)可增加男人的精子數(shù)及活力，治療男性性功能低下，增加女人 卵巢的功能，并可預防更年期綜合癥。最近研究顯示皂苷的上述作用可能與其能提高體內(nèi) 性激素的含量有關(guān)。國外學者經(jīng)臨床研究發(fā)現(xiàn)從蒺藜中提取的單一成份皂苷——原薯蕷皂 甙(protodioscin)能增強性欲，提高性功能。原薯蕷皂苷可能是在體內(nèi)通過代謝轉(zhuǎn)化成脫 氫表雄酮(dehydro印iandrosterone)而起上述作用的。進一步研究發(fā)現(xiàn)，生活在不同環(huán)境 中的蒺藜，不一定都含有這一活性成分。4.強心及強壯作用刺蒺藜中的皂苷具有顯著的強心作用。前蘇聯(lián)用蒺藜莖葉總皂苷制成制劑 “Tribusponin”，表明其具有較強的抗動脈硬化作用，其效果優(yōu)于已知的抗動脈硬化藥物。 其強壯作用機強度與人參皂苷頗為相似。蒺藜莖葉總皂苷還具有顯著的抗心肌缺血，抗心 肌梗塞，抗血小板聚集，降低膽固醇，保肝，提高免疫功能等作用。
5.調(diào)節(jié)機體內(nèi)某些微量元素的含量有報道顯示蒺藜皂苷可調(diào)節(jié)機體內(nèi)某些微 量元素的含量。6.抗衰老作用蒺藜總皂苷對d-半乳糖所致的小鼠亞急性衰老模型動物的體重減輕、脾臟及胸 腺萎縮有抑制作用，并降低其膽固醇及血糖水平，延長大鼠的游泳時間，增加幼年小鼠的肝 及胸腺的重量，對老年小鼠皮內(nèi)色素顆粒的沉著和聚集呈明顯的改善趨勢；在臨床上也發(fā) 現(xiàn)蒺藜皂苷增強肌體自然殺傷細胞活性，可用來防治老年人免疫功能降低。

7.調(diào)節(jié)血脂動物及臨床實驗均顯示蒺藜皂苷有調(diào)節(jié)血脂的作用，可降低血清甘油三脂、膽固 醇、低密度脂蛋白膽固醇，提高HDL/LDL的比值，升高卵磷脂膽固醇的值，具有阻止動脈、心 臟、肝臟的脂質(zhì)的沉著作用。8.蒺藜皂苷的抗菌、抑癌作用在研究中還發(fā)現(xiàn)蒺藜醇提物中的蒺藜總皂苷可顯著抑制人乳腺髓樣細胞 (Bcap-37)的增殖。最近國外學者從總皂苷中分離出7種單體皂苷，E*Be-dird等研究了 它們對4種人體腫瘤細胞(黑色素瘤細胞SK-MEL、口腔上皮細胞KB、乳腺癌細胞BT549、卵 巢癌細胞SK-0V-3)的作用。研究發(fā)現(xiàn)3種螺留醇皂苷(spirostanolsaponin)具有顯著的 抑制癌作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種具有抑制腫瘤作用的留體皂苷化合物。本發(fā)明所提供的甾體皂苷化合物，具有如下I式或II式所示的結(jié)構(gòu) I式所示的化合物的分子式為C61HiqqO3 ，名稱為3-0-{ β -D-xylopyranosyl-(1 — 3 )-[β -D~xy 1 opyranosy 1 (1 一2)] -β -D-glucopyranosyl (1 一4)-[ α -L-rhamnopyranosyl (1 — 2 )]-β -D-galactopyranosy}-26-0-β -D-glucopyranosyl-l-5a-furost-20(22) -en-(25R)-3 β，26-diol(l)。II式所示的化合物2的分子式為C62Hiq2O32,名稱為3-0- { β -D-xylopyranosyl (1 一 3) - [ β -D-xylopyranosyl (1 一 2) ] - β -D-glucopy ranosyl (1 一 4) - [ α -L-rhamnopyranosy 1 (1 一 2) ] - β -D-galactopyranosy} -26-0- β -D-glucop yranosyl-5a-furost-12-one-(25R)-22-methoxy-3β，26-diol。本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備上述留體皂苷化合物的方法。本發(fā)明所提供的制備上述留體皂苷化合物的方法，包括如下步驟用提取劑提取 刺蒺藜，得到提取液，再進行高效液相色譜分離，得到所述I式和/或II式所示的化合物； 所述高效液相色譜分離包括如下步驟用乙腈和水體積比為35 65的混合溶液作流動相， 流動相的流速為4ml/min ；收集保留時間為(9. 79810. 798)min的洗脫峰，得到I式所示化 合物；收集保留時間為(13. 423-14. 423)min的洗脫峰，得到II式所示化合物。所述高效液相色譜分離中所用的固相介質(zhì)具體可為ODS(十八烷基硅烷鍵合硅膠 填料Octadecyl silyl)，孔徑5um。所述提取劑可為60%-80% (體積百分含量)乙醇的 水溶液，優(yōu)選為70%乙醇溶液。所述方法中，在所述得到提取液后、所述進行高效液相色譜分離前，還可包括用大 孔吸附樹脂純化的步驟，洗脫方式為依次用水與乙醇的體積比為(100 0)、(80 20)、 (70 30)、(50 50)、(90 10)、(95 5)、(0 100)的混合溶液作為洗脫緩沖液進行 梯度洗脫，收集水與乙醇的體積比80 20的洗脫緩沖液對應的洗脫液。所述方法中，在所述大孔吸附樹脂純化后、所述進行高效液相色譜分離前，還可包 括用葡聚糖凝膠純化的步驟，所用的洗脫緩沖液為三氯甲烷與甲醇體積比為1 1的混合 液。所述葡聚糖凝膠具體可為S印hadex LH-20。所述方法中，在所述用葡聚糖凝膠純化后、所述進行高效液相色譜分離前，包括用 十八烷基硅烷鍵合硅膠純化的步驟，洗脫方式為依次用甲醇與水的體積比為(0 100)、 (80 20)、(50 50)、(100 0)的混合溶液作為洗脫緩沖液進行梯度洗脫，收集體積比 為50 50的洗脫緩沖液對應的洗脫液。
在所述用提取劑提取刺蒺藜的方法中，得到提取液后，還可包括將所述提取液減 壓蒸餾的步驟；在所述用大孔吸附樹脂純化的方法中和/或所述用葡聚糖凝膠純化方法中 和/或所述用十八烷基硅烷鍵合硅膠純化的方法中，在洗脫后，還可包括對得到的洗脫液 減壓蒸餾的步驟。本發(fā)明的另一個 目的是提供一種抗腫瘤藥物。本發(fā)明所提供的抗腫瘤藥物，其活性成份為上述留體皂苷化合物中的至少一種。所述腫瘤可為肝癌、肺癌或乳腺癌，具體可為NCI-H46細胞(肺癌細胞)、SF-268 細胞、MCF-7細胞、!fepG2細胞。I式和/或II式所示的化合物在制備抗腫瘤藥物中的應用也屬于本發(fā)明的保護 范圍。同樣，其中所述腫瘤可為肝癌、肺癌、乳腺癌，具體可為NCI-H46細胞、SF-268細胞、 MCF-7細胞、!fepG2細胞。實驗證明，本發(fā)明的兩種留體皂苷化合物抑制腫瘤的效果好，并且可抑制多種腫 瘤，I式所示化合物對NCI-H46細胞、SF-268細胞、MCF-7細胞、!fepG2細胞的半數(shù)抑制濃度 依次為9. 26,7. 53,6. 18、11. 3，II式所示化合物對NCI-H46細胞、SF-268細胞、MCF-7細胞、 HepG2細胞的半數(shù)抑制濃度依次為4. 31,3. 47,3. 98,6. 66。本發(fā)明的制備上述留體皂苷化 合物的方法，操作簡單，成本低，產(chǎn)率高，實驗證明，2. 5kg刺蒺藜可產(chǎn)生55. 8mg I式所示化 合物和18.4mgII式所示化合物。因此，本發(fā)明化合物在腫瘤的預防和/或治療中將有廣闊 的應用前景。


圖1為化合物1的結(jié)構(gòu)式圖。圖2為化合物2的結(jié)構(gòu)式圖。圖3為高效液相色譜分離圖譜。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、甾體皂苷化合物的制備刺蒺藜購自廣東省深圳中藥研究中心，產(chǎn)品目錄號為TT2002061211。一、制備1、取2. 5kg刺蒺藜并粉碎，用55L 70%乙醇進行提取(乙醇水=70 30，體積 比)。提取步驟如下25°C (室溫)冷浸12小時，過濾，取上清為提取液I，收集殘渣，計作 殘渣I ；再將殘渣I用55L 70%乙醇進行提取，提取條件同上，得到提取液II，殘渣II。將 提取液I和提取液II合并，得到總提取液。將總提取液在40°C水溫的條件下減壓蒸餾，得到450. 6g初浸膏。2、將450. Ig初浸膏用水溶解，用DlOl大孔吸附樹脂柱(6. 5 X 25cm)進行純化，用 水乙醇=(100 0)、(80 20)、(70 30)、(50 50)、(90 10)、(95 5)、(0 100) (體積比)的洗脫緩沖液進行梯度洗脫；收集水與乙醇體積比為80 20的洗脫緩沖液對 應的洗脫液，再從洗脫液中取樣點在同一塊薄層板上，根據(jù)薄層板結(jié)果將相似結(jié)果的餾分減壓蒸餾，得到餾分提取物I，共得到9. 68g餾分提取物I。3、將9. 68g餾分提取物I用20%乙醇溶液(水乙醇=80 20，體積比)溶解， 得到的溶液用Sephadex LH-20柱(Pharmacia Biochem. 3X 10cm)進行純化，以三氯甲烷 甲醇=50 50 (體積比)的混合溶液作為洗脫緩沖液進行洗脫，收集洗脫液，得到餾分提 取物II ；將上述全部餾分提取物II在40°C的水溫下減壓蒸餾濃縮，得到濃縮物3. 03g。4、將3. 03g濃縮物再用十八烷基硅烷鍵合硅膠
進行純化，以甲醇水=(0 100)、(80 20)、(50 50)、(100 0)(體積 比)的洗脫緩沖液進行梯度洗脫。收集體積比為50 50的洗脫緩沖液對應的洗脫液，將 洗脫液在40°C水溫的條件下減壓蒸餾濃縮。得到濃縮物1. 21g。5、將1. 21g濃縮物用高效液相色譜分離。高壓液相柱為Fluofix(INW 125、NE0S公司、10 X 250mm)；其中填充的固相介質(zhì)是 0DS(十八烷基硅烷鍵合硅膠填料Octadecylsilyl)，孔徑5um ；自動進樣器進樣，進樣量lOOul ；梯度洗脫緩沖液為流動相的組成為乙腈與水的混合溶液(乙腈水=35 65， 體積比)；流速 4ml/min(25°C )；用示差HPLC監(jiān)測。收集保持時間為9. 798-10. 798min (最高峰的保持時間為10. 298min)(圖3中1) 的單峰溶液餾分，在40°C的溫度下減壓蒸餾，得到白色粉末狀的化合物1 (55. 8mg)；收集保持時間為13. 423-14. 423min (最高峰的保持時間為13. 923min)(圖3中2) 的單峰溶液餾分，在40°C的溫度下減壓蒸餾，得到無色針狀結(jié)晶狀的化合物2(18. 4mg)。二、檢測將化合物1和化合物2依次分別進行如下檢測1、溶點檢測將樣品結(jié)晶或者粉末放在展薄片上，然后將展薄片放到溶點儀上邊 加熱邊觀察溫度變化，至樣品溶化。2、比旋度的檢測偏振光透過1dm且每1ml中含有旋光性物質(zhì)lg的溶液。3、[HR-T0F-MS]是ESI測試時產(chǎn)生高分辨離子峰數(shù)據(jù)?？梢哉业脚c化合物的碎片 峰和與化合物結(jié)合的一些離子信號峰信息。4、質(zhì)譜檢測質(zhì)譜檢測化合物分子量，采用了電噴霧電離(electrospray ionization, ESI)質(zhì)譜檢測。ESI的實驗條件相對簡單且在大氣壓環(huán)境下工作，分離條件 和分離化合物高效液相色譜(HPLC)條件一致。流動相的組成為乙腈與水的混合溶液(乙 腈水=35 65，體積比)；流速4ml/min。5、核磁共振檢測以氘代吡啶為溶劑、已TMS為零點、測定的共振頻率為400MHz。制備及檢測的實驗均設3次重復。結(jié)果如下化合物1 白色粉末，熔點[mp]215-217°C ；旋光[a]g5_38. 2° (H20，c 0. 68)； [HR-T0F-MS] 1335. 6185 [M+Na+H]+ ；ESI-MS 1311. 4 [M-H]1335. 3[M+Na]+ ；分子式 C61H100030 ；核磁數(shù)據(jù)見表1和2?；衔? 無色針狀結(jié)晶，熔點[mp]220_222°C ；旋光[a]g5_25.2。(H20，c 0. 56) ； [HR-T0F-MS] 1381. 6250[M+Na]+ ；ESI-MS 1357. 6 [M-H]-, 1381. 6 [M+Na]+ ；分子式C62H102 032 ；核磁數(shù)據(jù)見表1和2。 表1、化合物1和化合物2的碳譜測定結(jié)果
表2、化合物1和化合物2的氫譜測定結(jié)果 綜上實驗結(jié)果表明，化合物1具有圖1所示結(jié)構(gòu)式，化合物2具有圖2所示結(jié)構(gòu)式c 化合物1的名稱為
3-0- { β -D-xylopyranosyl- (1 — 3) - [ β -D~xylopyranosyl (1 — 2) ] - β -D-glucop yranosyl (1 — 4)-[ α -L-rhamnopyranosy 1(1 — 2)]-β -D-galactopyranosy}-26-0-β -D-g lucopyranosyl-l-5a-furost-20 (22) -en- (25R) -3 β，26_diol(l)?；衔?2 的名稱為:3_ 0- {β _D_xyIopyranosyl (1 — 3) - [ β _D_xylopyranosyl (1 — 2) ] - β -D-glucopyranosyl (1 — 4)-[α -L-rhamnopyranosy 1 (1 — 2) ] - β -D-galactopyranosy} -26-0- β -D-glucopyranosyl-5a -furost-12-one-(25R)-22_methoxy-3 β，26-diol。實施例2、化合物1和化合物2的抗腫瘤活性檢測 肺癌細胞(NCI-H460細胞)購自中國科學院細胞庫，產(chǎn)品目錄號為TCHu 38，乳腺 癌細胞(SF-268細胞)購自中國科學院細胞庫，產(chǎn)品目錄號為TCHu 49，乳腺癌細胞(MCF-7 細胞)購自中國科學院細胞庫，產(chǎn)品目錄號為TCHu 74，人肝癌細胞(人H印G2細胞)購自 中國科學院細胞庫，產(chǎn)品目錄號為TCHu 72?；衔飳δ[瘤細胞的抑制實驗，采用文獻(Mosmarm，Τ. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival!application to proliferation and cytoxicity assays. Journal of Immunological Methods,65,55-63) 中所述的MTT法(Mosmann，1983)檢測。具體操作如下在96孔平面板內(nèi)注入200 μ 1濃 度為1. OX IO4個cell/mL的腫瘤細胞液，然后加入各種測試濃度化合物溶液，放入二氧化 碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 16 小時，再加入 3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazol iumbromide (MTT)再培養(yǎng)4小時。除去上清液，添加DMSO避光保存10分鐘，待生成的甲暨 (formazan)溶解后，在吸光度為570nm酶標儀上測出吸光度。對照組腫瘤細胞+DMS0。用于實驗的腫瘤細胞分別為NCI-H460細胞、SF-268細胞、MCF-7細胞、人H印G2細 胞。抑制率(％ )=(對照組OD值-測試化合物組OD值)/對照組OD值X 100實驗設3次重復，結(jié)果取平均數(shù)。結(jié)果如表3所示。表3、2個留體皂苷化合物對4種腫瘤細胞的抑制實驗結(jié)果 以上結(jié)果表明，本發(fā)明的化合物1和化合物2均對以上4種細胞具有很好的抑制作用。
權(quán)利要求
一種甾體皂苷化合物，具有如下I式或II式所示的結(jié)構(gòu)(I式)(II式)F2009100827723C0000011.tif,F2009100827723C0000012.tif
2.制備權(quán)利要求1中所述留體皂苷化合物的方法，包括如下步驟用提取劑提取刺蒺 藜，得到提取液，再進行高效液相色譜分離，得到權(quán)利要求1中所述I式和/或II式所示的 化合物；所述高效液相色譜分離包括如下步驟用乙腈和水體積比為35 65的混合溶液 作流動相，流動相的流速為4ml/min ；收集保留時間為9. 798-10. 798min的洗脫峰，得到I 式所示化合物；收集保留時間為13. 423-14. 423min的洗脫峰，得到II式所示化合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述高效液相色譜分離中所用的固相介 質(zhì)為十八烷基硅烷鍵合硅膠；所述提取劑為60%-80% (體積百分含量)乙醇的水溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述得到提取液后、 所述進行高效液相色譜分離前，包括用大孔吸附樹脂純化的步驟，洗脫方式為依次用水與 乙醇的體積比為(100 0)、(80 20)、(70 30)、(50 50)、(90 10)、(95 5)、 (O 100)的混合溶液作為洗脫緩沖液進行梯度洗脫，收集水與乙醇的體積比80 20的洗 脫緩沖液對應的洗脫液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述大孔吸附樹脂純化 后、所述進行高效液相色譜分離前，包括用葡聚糖凝膠純化的步驟，所用的洗脫緩沖液為三 氯甲烷與甲醇體積比為11的混合液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述用葡聚糖凝膠純化后、所述進行高效液相色譜分離前，包括用十八烷基硅烷鍵合硅膠純化的步驟，洗脫方式為 依次用甲醇與水的體積比為(O 100)、(80 20)、(50 50)、(100 0)的混合溶液作 為洗脫緩沖液進行梯度洗脫，收集體積比為50 50的洗脫緩沖液對應的洗脫液。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-6中任一所述的方法，其特征在于在所述用提取劑提取刺蒺藜的 方法中和/或所述用大孔吸附樹脂純化的方法中和/或所述用葡聚糖凝膠純化方法中和/ 或所述用十八烷基硅烷鍵合硅膠純化的方法中，包括減壓蒸餾的步驟。
8.一種抗腫瘤藥物，其活性成份為權(quán)利要求1中所述留體皂苷化合物中的至少一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的抗腫瘤藥物，其特征在于所述腫瘤為肝癌、肺癌或乳腺癌。
10.權(quán)利要求1中所述I式和/或II式所示的化合物在制備抗腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了甾體皂苷化合物及其制備方法與應用。本發(fā)明的制備方法包括如下步驟用提取劑提取刺蒺藜，得到提取液，再進行高效液相色譜分離，得到權(quán)利要求1中所述I式和/或II式所示的化合物；所述高效液相色譜分離包括如下步驟用乙腈和水體積比為35∶65的混合溶液作流動相，流動相的流速為4ml/min；收集保留時間為9.798-10.798min的洗脫峰，得到I式所示化合物；收集保留時間為13.423-14.423min的洗脫峰，得到II式所示化合物。實驗證明，本發(fā)明的兩種甾體皂苷化合物抑制腫瘤的效果好，并且可抑制多種腫瘤。本發(fā)明的制備上述甾體皂苷化合物的方法，操作簡單，成本低，產(chǎn)率高。因此，本發(fā)明化合物在腫瘤的預防和/或治療中將有廣闊的應用前景。
文檔編號A61K31/7048GK101875686SQ20091008277
公開日2010年11月3日 申請日期2009年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月29日
發(fā)明者劉紅霞, 王玨, 祖旭宇, 蔣宇揚, 譚春燕 申請人:清華大學深圳研究生院