專利名稱：DRD1 mRNA 3端非編碼區(qū)ARE元件通過穩(wěn)定DRD1 mRNA上調(diào)其表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因功能、臨床新藥開發(fā)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及神經(jīng)遞質(zhì)受體多 巴胺受體DRDl基因mRNA 3’ UTR的克隆工藝，涉及一種神經(jīng)系統(tǒng)特異性表達(dá)的神經(jīng)細(xì)胞分 化相關(guān)基因HuD的全長重組基因工程及蛋白純化工藝，涉及體外轉(zhuǎn)錄表達(dá)RNA探針工藝，涉 及使用純化后蛋白及體外轉(zhuǎn)錄RNA探針運(yùn)用REMSA技術(shù)確認(rèn)DRDlmRNA 3’ UTR上ARE元件 與HuD蛋白結(jié)合，涉及運(yùn)用特異性抗體通過RNA-CHIP技術(shù)確認(rèn)HuD蛋白在pl9細(xì)胞內(nèi)結(jié) 合DRDlmRNA，涉及將熒光素酶蛋白編碼區(qū)和DRDlmRNA 3’ UTR通過基因工程重組并真核表 達(dá)的工藝，涉及運(yùn)用realtime PCR技術(shù)確認(rèn)HuD蛋白增加DRDlmRNA穩(wěn)定性工藝，涉及運(yùn)用 熒光素酶報告技術(shù)確認(rèn)HuD上調(diào)DRDl基因表達(dá)的工藝，涉及HuD蛋白通過結(jié)合DRDlmRNA 3’ UTR ARE元件對DRDl的上調(diào)效應(yīng)未來在藥物成癮，帕金森綜合癥，學(xué)習(xí)與記憶障礙等疾 病治療中新藥的開發(fā)和分子生物學(xué)診療手段的研發(fā)。
背景技術(shù)：
DRDl (dopamine receptor Dl)是多巴胺受體的一種，是由七個跨膜區(qū)域(7-GM) 組成的G蛋白偶聯(lián)受體。其廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)，特別是尾殼核(CPu)，伏隔核(Act，)，視 束(0T)，腦皮層(Cx)和杏仁核。其通過正性調(diào)控cAMP，激活蛋白激酶A，從而激活下游信 號通路和細(xì)胞膜離子通道，在機(jī)體的運(yùn)動功能，學(xué)習(xí)與記憶等多個方面發(fā)揮重要作用。研究 表明，DRDl受體表達(dá)異常是帕金森綜合癥(Parkinson disease)發(fā)病機(jī)制中的重要一環(huán)。 在6-0HDA制備的大鼠帕金森病模型上，激活DRDl受體能夠獲得抗PD的效應(yīng)，而且這些效 應(yīng)可以被相應(yīng)的DRDl特異性受體阻斷劑所抑制。目前，DRDl受體激動劑dihydrexidine、 CY208-243和ABT在MPTP制備的猴PD模型和PD患者上均表現(xiàn)出抗PD效應(yīng)。兼有DRDl和 DRD2受體刺激效應(yīng)的DA受體激動劑培高利特已在臨床獲得了廣泛的應(yīng)用。除此之外，DRDl被廣泛報道在中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)中與藥物成癮包括阿片，可卡 因，安非他命和乙醇等造成的精神運(yùn)動效應(yīng)以及獎勵機(jī)制的控制有關(guān)。文獻(xiàn)報道DRDl的拮 抗劑對其阻斷，可削弱嗎啡，可卡因和安非他命引起的運(yùn)動過度和獎勵效應(yīng)。另外研究表明 DRDl的表達(dá)異常與和學(xué)習(xí)與記憶相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有密切關(guān)系。由于DRDl在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，長期以來研究人員深入 研究DRDl的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，并將其應(yīng)用于臨床治療和新藥研發(fā)。近年來，mRNA 3端非編碼 區(qū)中含有的順式作用元件對基因表達(dá)的調(diào)控作用越來越受到重視。基于此，越來越多的研 究人員試圖在DRD13端非編碼區(qū)中找出能夠有效調(diào)節(jié)DRDl表達(dá)水平的順式作用元件。本 發(fā)明主要對DRD13端非編碼區(qū)上含有的順式作用元件進(jìn)行了鑒定，明確了與其發(fā)生相互作 用的分子，檢測了該元件對DRDl轉(zhuǎn)錄后表達(dá)水平的調(diào)控。同時我們在P19細(xì)胞中對該調(diào)控 機(jī)制的效應(yīng)進(jìn)行了驗證。本發(fā)明為研發(fā)治療DRDl表達(dá)異常相關(guān)性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新藥提 供了新的靶點(diǎn)，具備臨床應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是研究多巴胺受體DRDlmRNA 3端非編碼區(qū)中含有的ARE元件在DRDl轉(zhuǎn)錄 后水平表達(dá)中的調(diào)控作用。本發(fā)明是在檢索ARED3.0數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)DRDlmRNA 3端非編碼區(qū) 上含有一段符合ARE元件特征的序列并有可能是神經(jīng)特異性表達(dá)蛋白HuD的作用底物，通 過生物信息學(xué)軟件比對人，小鼠，大鼠DRDlmRNA 3端非編碼區(qū)序列發(fā)現(xiàn)該ARE元件在進(jìn)化 中高度保守，同時通過生物信息學(xué)軟件SFOLD進(jìn)行模擬計算，得到該段序列在空間結(jié)構(gòu)上 具有和反式作用因子發(fā)生相互作用的可能的基礎(chǔ)上進(jìn)行的。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是鑒定DRD13端非編碼區(qū)含有一個可以穩(wěn)定DRDlmRNA， 從而上調(diào)DRDl表達(dá)的ARE元件。本發(fā)明提供了檢測DRDlmRNA3端非編碼區(qū)ARE元件與神 經(jīng)特異性表達(dá)蛋白HuD相互作用的方法，提供了檢測DRDl轉(zhuǎn)錄后表達(dá)水平的方法。本發(fā)明利用針對神經(jīng)特異性表達(dá)蛋白HuD的特異性抗體，從細(xì)胞提取物中分離出 HuD蛋白-DRDlmRNA復(fù)合物，通過體外逆轉(zhuǎn)錄得到對應(yīng)的cDNA，然后通過特異性PCR探針擴(kuò) 增出目的片段，鑒定出DRDlmRNA與HuD蛋白具有相互作用。本發(fā)明運(yùn)用分子生物學(xué)方法，針對DRDlmRNA 3端非編碼區(qū)上一段距翻譯終止位 點(diǎn)521-565位，含有ARE元件的序列進(jìn)行克隆，并將去重組入pGEM-3zf(+)質(zhì)粒，通過體外 轉(zhuǎn)錄獲得對應(yīng)的RNA片段，同時通過在體外轉(zhuǎn)錄時摻入P32標(biāo)記的UTP使探針具有放射性。 同時運(yùn)用分子生物學(xué)方法，針對HUD基因編碼區(qū)全長進(jìn)行克隆，并將其重組入原核表達(dá)質(zhì) 粒，表達(dá)并純化出高濃度的HuD-GST融和蛋白。使用以上兩種材料，利用REMSA手段，鑒定 出HUD蛋白特異性識別和結(jié)合DRDlmRNA 3端非編碼區(qū)ARE元件。本發(fā)明通過REALTIME PCR方法，檢驗出P19細(xì)胞中DRDlmRNA穩(wěn)定性隨HUD蛋白 的過表達(dá)而增加。本發(fā)明通過分子生物學(xué)方法克隆獲得DRDlmRNA 3端非編碼區(qū)的全長序列，將其 重組入真核表達(dá)載體中Luciferase基因編碼序列的下游。同時共表達(dá)HUD蛋白后，通過 REALTIME PCR和熒光素酶報告方法鑒定出帶有DRD13端非編碼區(qū)的mRNA穩(wěn)定性隨HuD蛋 白過表達(dá)而增加，并相應(yīng)引起翻譯水平表達(dá)上調(diào)。小結(jié)本發(fā)明涉及的基因多巴胺受體DRD1，是多巴胺在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的主要受體之 一，其生理功能廣泛重要，與帕金森綜合癥，藥物成癮，學(xué)習(xí)記憶障礙等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病 關(guān)系密切。本發(fā)明通過REMSA手段和生物信息學(xué)分析鑒定出DRDlmRNA 3端非編碼區(qū)含有 一個ARE元件，鑒定出該元件可以被HuD蛋白結(jié)合，鑒定出該ARE元件通過被HuD調(diào)控可以 增加mRNA穩(wěn)定性，并相應(yīng)引起翻譯水平上升；同時，本發(fā)明提供了檢測DRDlmRNA的方法，檢 測mRNA帶有DRD13端非編碼區(qū)的熒光素酶基因表達(dá)情況的方法，可以有效檢測真核細(xì)胞中 上述二者的表達(dá)水平。本發(fā)明鑒定的DRD13端非編碼區(qū)中含有的ARE元件對DRDl轉(zhuǎn)錄后 表達(dá)水平的調(diào)控作用，為新藥研制提供了新靶點(diǎn)，為相關(guān)疾病分子生物學(xué)診療新方法的研 發(fā)提供了支持技術(shù)和技術(shù)途徑。本發(fā)明的主要技術(shù)特征在于(1)DRD13端非編碼區(qū)上含有一個ARE元件，該元件通過被HuD蛋白識別結(jié)合，調(diào)控 DRDlmRNA的穩(wěn)定性，從而調(diào)控DRDl轉(zhuǎn)錄后表達(dá)水平。(2)含有編碼DRDlmRNA 3端非編碼區(qū)全長的DNA序列，上游為Luciferase基因編 碼序列的重組質(zhì)粒pcDNA3. 1-LUCI-DRD1UTR
(3)含有編碼DRDlmRNA 3端非編碼區(qū)距翻譯終止位點(diǎn)521-565位，含有ARE元件 的 DNA 序列的重組質(zhì)粒 pGEM-3zf(+)-DRD IARE probe附圖
表說明下面結(jié)合附圖對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)描述圖 1 重組質(zhì)粒 pGEM_3zf (+)_DRD1ARE probe 示意 2 重組質(zhì)粒 pcDNA3. 1-LUCI-DRDIUTR 示意3 =DRDlmRNA與HuD蛋白結(jié)合(RNA-CHIP結(jié)果，上圖是使用HuD特異性抗體后結(jié) 果，下圖是使用等量IgG抗體代替抗HuD抗體作為陰性對照的結(jié)果。)圖4:DRDlmRNA 3端非編碼區(qū)ARE元件結(jié)合HuD蛋白(REMSA結(jié)果，1道 為只加放射性DRD1EMSA探針；2道為放射性DRD1EMSA探針加GST蛋白；3_5道為放射性 DRD1EMSA探針加HuD-GST蛋白，其中HuD-GST蛋白上樣量逐步增加，分別為0. 05ymol, 0. 1 μ mol, 0. 2 μ mol)圖5 =DRDlmRNA穩(wěn)定性隨HuD蛋白過表達(dá)而增加(REALTIME PCR結(jié)果)圖6 :mRNA帶有DRD13端非編碼區(qū)的熒光素酶基因表達(dá)隨HuD蛋白過表達(dá)而增加 (熒光素酶報告實驗結(jié)果)圖7 :mRNA帶有DRD13端非編碼區(qū)的熒光素酶基因mRNA穩(wěn)定性隨HuD蛋白過表達(dá) 而增加(REALTIME PCR結(jié)果)
具體實施例方式在下面的實施例中進(jìn)一步說明了本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明的范圍。實施例1
用途序列(5’-3’)pGEX-6P-l-HuD 引物FWGGATCCCGATGGTTATGATAATTAGCACCATGGRVCCG CTCGAG TCAGGACTTGTGGGCTTTGTT
pcDNA3.1-LUCI-DRD1 UTR引物FWGCTCTAGAATATTGGGTTCTCATCTCTG AAGCRVGC TCTAGA GAGAGGAT ACTAAATTCG GATTAAAGCDRDl-Real-time PCR 引物FWCCAGATCGGGCATTTGGAGRVCTGCCTCTTCTTCTGAGACACDRDl-3'UTR-Real-time PCR引物FWTCTGTAAAAGCCAGCTCAAGAAGRVTGAAATGAGAAATGACAGGGAGG 實施例2 ；Real-time PCR1)根據(jù)RT后得到的產(chǎn)物濃度，將模板稀釋成合適的濃度，一般根據(jù)半定量RT-PCR 結(jié)果進(jìn)行稀釋。將每條引物稀釋成2.5 μ M。2)根據(jù)模板數(shù)和引物數(shù)計算所需要進(jìn)行的PCR個數(shù)。例如，若需要檢測某基因在 1例正常腦組織和3例細(xì)胞系中的表達(dá)，那么模板個數(shù)是4，共需兩對引物，1對為NECLl的 引物，1對作為內(nèi)參GAPDH的引物。而一般來講，1對引物在1個模板中需要進(jìn)行3個平行 孔，那么本實驗總共需要的PCR個數(shù)為2X4X3 = 24個。3)配體系配體系時最好配總管，這樣可以減少操作中的誤差，而且配的總體系量最好比實 際所需量寬裕一些，以免分配時出現(xiàn)誤差。例如，本實驗需要PCR個數(shù)為24個，每個PCR體 系為20 μ 1，實際需要的總量為480 μ 1，而配體系時最好配置多出幾管的體系，可以配26管 或27管的體系。PCR體系為 先向總管中加入2XSYBR熒光染料、水和內(nèi)參染料ROX II，然后根據(jù)引物數(shù)平分， 本實驗需要兩對引物，因此將總管一分為二。4)向兩管中各加入一種引物，一管加目的基因的引物，上下游各13μ1，一管加內(nèi)參GAPDH引物，上下游各13 μ 1。5)再將每管按照模板數(shù)平分，本實驗共有四種模板，因此每管分為相等的四管。6)到此時為止，含有目的基因引物的有四管，向每管中加入一種模板3 μ 1，混勻 后分至PCR管中，每管20 μ 1 ；對于含有GAPDH引物的管也如此操作。7)蓋好PCR管的蓋子，2000rpm離心4min，放入PCR儀中即可運(yùn)行程序，程序如下 94°C，10s — 94°C，5s — 60°C，34s，進(jìn)行 45 個循環(huán)后終止。8)運(yùn)用Real-time PCR儀自帶軟件進(jìn)行結(jié)果的分析。實施例3REMSA1體外轉(zhuǎn)錄RNA探針(1) 10XSP6RNAtranscriptionbufferIOOmMDTT0. 1 % BSANTPmixturea-P32 標(biāo)記的 UTP (10 μ Co/μ 1)HRP模版DNASP6RNApolymerae力口EDPC /KM 20 μ 1 在進(jìn)行冷探針的轉(zhuǎn)錄的時候，不加放射性UTP，加入水補(bǔ)足。(2) 37度水浴1小時30分鐘(3)加入20U的Dnase于37度15分鐘，去除模版DNA(4)冷卻至-80度凍存2配置非變性PAGE膠10TBE 3ml40%丙烯酰胺10. 5ml (需要過濾)10% APS 400 μ 1TEMED 30 μ 17jC40. 5ml50%甘油 6mltotal 60ml3配制上樣體系參考體系為(單位μ 1) 4電泳及顯影(1)按照上表配制好反應(yīng)混合液以后，30度水浴10分鐘(2)反應(yīng)結(jié)束候，加入5 μ 1 6X上樣緩沖液(3)用已經(jīng)制作好的膠，0. 5 X TBE, 100-200V電泳2_3h，知道溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)凝 膠底部3厘米處(4)用干膠儀80度干膠2h(或者用硅化后的χ光片和濾紙壓住后烘干)(5)在膠片盒中顯影實施例4RNA-chip一處理細(xì)胞1用帶有1 μ M RA的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)Ρ19細(xì)胞3天2胰酶消化細(xì)胞(之前可視實驗需要決定是否進(jìn)行紫外交聯(lián))，培養(yǎng)基中和胰酶后 常溫800轉(zhuǎn)離心五分鐘，棄上清，用冰上預(yù)冷的PBS清洗兩遍3將離心后的細(xì)胞用等體積lysis buffer (配方見后)裂解，馬上使用或者凍存 于-80C 二處理 protein G 珠1用0. 5ml裂解液將proteinG珠清洗兩遍，然后用原體積裂解液重懸proteinG 珠，每Iml細(xì)胞裂解液(一個大皿)使用50 μ 1x3 = 150 μ 1 proteinG珠，50 μ 1x2用來預(yù) 清除，最后50 μ1用來共沉淀2將50 μ 1 protein G珠加入到裂解液中，4度轉(zhuǎn)動孵育一小時3離心取上清4 重復(fù) 2，3—次5在預(yù)清除后的上清中加入抗體后4度過夜轉(zhuǎn)動孵育三免疫共沉淀1配置以下體系protein G 珠約 50 μ 1NT2buffer850 μ 1
RNase OUT (40 μ/μ 1)VRCIOOmMDTT0. 5Μ EDTAmRNP lysate
5 μ 1 4μ 1 10 μ 1 30 μ 1 100 μ 17取出100 μ 1作為總mRNA提取物8將混合物在室溫中顛倒混合2小時9使用NT2buffer 清洗六遍(1500轉(zhuǎn)1分鐘)，使用100 μ 1ΝΤ2重懸10 加入蛋白酶 K(10mg/ml)3y 1，10% SDS 1 μ 1，55 度孵育 30 分鐘11加入等體積的酚氯仿(約110 μ 1)，劇烈振蕩后4度12000，5min12取上清，加入等量異丙醇，1/10體積NaAC (約20 μ 1)，放-20度lh，或者冰上10 分鐘1312000轉(zhuǎn)4度，15分鐘，用乙醇洗兩遍14 加入 10 μ 1 水溶解 mRNA15測定濃度(可以不測)16逆轉(zhuǎn)錄(見附錄三)附錄一紫外交聯(lián)后制備mRNP裂解液(1)在60mm直徑的大皿中加入0. 5 μ M的RA，培養(yǎng)3天(2)倒掉培養(yǎng)基，用冰PBS輕輕漂洗兩遍(3)在大皿中留2. Iml的PBS (這樣按照大皿底面積，基本上液面就是Imm的高度)(4)在紫外交聯(lián)儀中設(shè)定999mJX4的交聯(lián)能量用刮子收細(xì)胞，或者胰酶孵育細(xì)胞 3分鐘后加入含血清培養(yǎng)基，4度1000轉(zhuǎn)4分鐘，加入Iml冰PBS重懸，然后4度1000轉(zhuǎn)4 分鐘，以300 μ IPBS重懸(5)在已經(jīng)配好的 lysis buffer 中加入 RNAase 和 proteinase (VRC 為 250 X)，然 后等體積加入到細(xì)胞懸液中(6)充分混勻后置冰上5min(7)存放于一 80度附錄二所需試劑1. Polysome lysis bufferIOOmMKCl5mM MgC1210mM Hepes, pH 7.00. 5% Nonidet P-40使用前臨時加入ImM Dithiothrectol(DTT)lOOunits/ml RNase OUT(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)0. 2% Vanadyl ribonucleoside complexes0. 2mM Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)lmg/ml P印statin A5mg/ml Bestatin
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20mg/ml Leupeptin2. NT2Buffer50mM Tris, pH 7. 4150mMNaCllmMMgC120. 5% Nonidet P-40附錄三RT步驟1)提取總RNA測定質(zhì)量2)在 0.5ml 無 Rnase 管中加入A Ing ~ 5 μ g total RNAχμ 1B 0· 5 μ g/μ 1 Oligo (dT) 12-18 1 μ 1ClOmMeachdNTP1 μ 1D 補(bǔ) DEPC/K至 12μ 13) 65°C 5min后制冰上速冷4)加入5X buffer4μ 10. IM DTT2μ 1Rnase inhibitor 1 μ 1(200U)RT 酶Ιμ 42 °C 52min5)70°C 15min 終止反應(yīng)實施例5使用 Promega 公司 Dual-Luciferase Reporter Assay System。基本原理實驗所用報告基因載體為pcDNA3. 1-LUCI-DRDlUTR，編碼螢火蟲 (Firefly)熒光素酶。為了消除每個孔轉(zhuǎn)染效率不同的影響，實驗時共轉(zhuǎn)pRL_TK作為內(nèi)對 照。該質(zhì)粒編碼海腎(Renilla)熒光素酶。這兩種酶的底物和反應(yīng)緩沖液不同，可以用同 一樣品在同一個試管中測定。實驗時，首先加入LAR II，測量Firefly熒光素酶活性，而后 加入Stop&GloReagent，消除Firefly熒光素酶活性，激發(fā)Renilla熒光素酶的活性并測量。 這兩種試劑均由試劑盒提供。最終結(jié)果取Firefly與Rermila熒光素酶讀數(shù)的比值說明書中所含核苷酸序列表1權(quán)利要求1涉及序列DRDlmRNA 3，UTR 所含 ARE 元件atttatttatttatttattta2權(quán)利要求4涉及序列DRDl-Real-time PCR 引物-UP 5-CCAGATCGGGCATTTGGAG-3DRDl-Real-time PCR 引物-DOWN :5-CTGCCTCTTCTTCTGAGACAC_3
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權(quán)利要求
一種DRD1基因mRNA 3端非編碼區(qū)上位于翻譯終止位點(diǎn)后521 541位的ARE元件序列，其可以調(diào)控DRD1轉(zhuǎn)錄后表達(dá)水平。
2.一種含有權(quán)利要求1所述的DRDlmRNA 3’ UTR的ARE元件序列的體外轉(zhuǎn)錄載體，是 pGEM-3zf(+)-DRD1ARE probe。
3.一種含有DRDlmRMA3端非編碼區(qū)全長的，上游為Luciferase基因編碼序列的重組質(zhì)粒 pcDNA3. I-LUCI-DRD IUTR
4.可用于高特異的檢測DRDlmRNA表達(dá)水平的實時熒光PCR引物序列DRD1-Real-time PcR 引物-UP5-CCAGATCGGGCATTTGGAG-3DRD1-Real-time PCR 引物-DOWN5-CTGCCTCTTCTTCTGAGACAC-3
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述具有高特異性擴(kuò)增DRDl的實時熒光PCR引物序列，檢測DRDl表達(dá)水平的方法，步驟如下1)Real-time PCR體系配制(20ul)，每種模版每種引物各3管 SYBR Green PCR 預(yù)混試劑 IOul稀釋的模板Iul引物對(5uM)2ul無菌去離子水7ul2)Real-timePCR 反應(yīng)程序95°C，lOmin，95°C，15s 60°C, Imin0 循環(huán)重復(fù)第 2，3 步 40 次。(儀器ABI 7500型)3)結(jié)果統(tǒng)計學(xué)處理計算同一個樣品NSPcl的Ct值與GAPDH的Ct值的比值，取3個 平行孔Ct比值的平均數(shù)。做圖時將正常組織的Ct比值的平均數(shù)設(shè)為1，計算出所有樣品的 相對值后做圖。
6.根據(jù)DRDlmRNA 3端非編碼區(qū)所含有的ARE元件調(diào)控DRDl基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)水平這 一效應(yīng)而開發(fā)的治療與DRDl表達(dá)異常相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新藥和分子生物學(xué)新診療方法。
全文摘要
DRD1(dopamine receptor D1)是多巴胺受體的一種，廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)，其通過正性調(diào)控cAMP，激活蛋白激酶A，激活下游信號通路和細(xì)胞膜離子通道，發(fā)揮多種重要生理作用。大量文獻(xiàn)證明，DRD1表達(dá)量和活性的高低與帕金森綜合癥(Parkinson disease)、毒品成癮、學(xué)習(xí)與記憶異常相關(guān)疾病等具有直接和重要的聯(lián)系。近年來，大量文獻(xiàn)提示mRNA 3’UTR中的順式作用元件對基因表達(dá)的調(diào)控起十分關(guān)鍵的作用。本發(fā)明主要在DRD1mRNA 3’UTR上鑒定出一個對DRD1基因表達(dá)具有顯著調(diào)控作用的順式作用元件-ARE元件，明確了其相互作用分子-HuD蛋白，并在P19細(xì)胞系中對上述發(fā)現(xiàn)進(jìn)行了驗證。本發(fā)明為研發(fā)DRD1表達(dá)異常相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新藥提供了關(guān)鍵性靶點(diǎn)，也為開發(fā)相關(guān)分子生物學(xué)治療方案提供了重要技術(shù)路徑。
文檔編號A61P25/16GK101928706SQ20091008722
公開日2010年12月29日 申請日期2009年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月19日
發(fā)明者強(qiáng)伯勤, 彭小忠, 袁建剛, 趙理, 陰彬, 龔燕華 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所