專利名稱：水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白及其制備方法以及其在制藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種生物免疫制品，特別是涉及一種水痘和治療帶狀皰 疹的特異免疫球蛋白及其制備方法，以及其在制藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水痘-帶狀皰疹病毒(英文縮寫VZV)屬于人類單純皰疹病毒3型，其原發(fā)感染為水痘。水痘是兒童常見(jiàn)的一種急性、高傳染性，可經(jīng)呼吸道和接觸傳播的感染性疾病， 一般預(yù)后良好，但某些人群(長(zhǎng)期應(yīng)用放、化療病人，外科手術(shù)病人，器官移植病人等)及成人感染VZV 后癥狀甚為嚴(yán)重， 一旦在易感人群中出現(xiàn)水痘病人，就很難預(yù)防水痘在該群體中爆發(fā)。VZV 潛伏后再激活則引起帶狀皰疹。近年來(lái)，帶狀皰疹(英文縮寫HZ)的發(fā)病率明顯增高，且引起的后遺神經(jīng)痛(英文縮寫P麗)用抗病毒藥物治療無(wú)明顯療效。水痘-帶狀皰疹及相關(guān)性后遺癥逐漸成為重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題而日益受到國(guó)家重視。目前我國(guó)水痘的預(yù)防主要是應(yīng)用水痘疫苗進(jìn)行主動(dòng)免疫，但個(gè)體水痘的預(yù)防接種不能改 變水痘的爆發(fā)及流行病學(xué)特征。目前治療帶狀皰疹常用的抗病毒藥物一般為化學(xué)合成藥、中 草藥以及干擾素等生物制劑，但其特異性差，療效也不能充分肯定。特異性免疫球蛋白是由病毒等病原體感染機(jī)體或主動(dòng)接種疫苗后，在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的具有 特異性、高活性及中和作用的球蛋白。使用特異性免疫球蛋白可針對(duì)性的預(yù)防病毒等病原體 的感染及其感染后所發(fā)生疾病的治療，這種方法稱為被動(dòng)免疫。被動(dòng)免疫是控制感染性疾病 暴發(fā)及治療的有效途徑。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)目前人免疫球蛋白對(duì)水痘-帶狀皰疹病毒無(wú)特異性的缺 點(diǎn)，提供一種療效好的高效價(jià)水痘-帶狀皰疹病毒人免疫球蛋白，并提供一種簡(jiǎn)單方便成本低 的制備方法，以及其在制備用于預(yù)防水痘的發(fā)生和治療帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛藥治療的藥物中 的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案3，其中，水痘-帶狀皰疹病毒中和抗體效價(jià)大于等于 50IU/mL，其免疫球蛋白純度大于等于總蛋白的90%，蛋白質(zhì)含量小于等于180g/L。 本發(fā)明所述的水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白，其中，僅與抗人血清產(chǎn)生沉淀線。 本發(fā)明所述的水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白，其中，與正常人血清比較，主要沉淀線為IgG。本發(fā)明所述的水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白，其中IgG單體與二聚體含量之和大于等于90%。本發(fā)明所述的水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白，其中劑型為液體針劑型或凍干劑型，規(guī)格 為125 IU/2. 5 mL/瓶、250 IU/5. 0 mL/瓶。本發(fā)明所述水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白的制造方法，其中，按以下步驟制備a. 檢測(cè)符合國(guó)家采血標(biāo)準(zhǔn)的供血漿者的血槳或血清，取其中水痘-帶狀皰疹病毒中和抗 體IgG，選擇中和抗體效價(jià)大于等于2IU/mL者的血槳為水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白的制備 原料血漿，并將所得血漿混合；b. 將a步驟所得的混合原料血漿按低溫乙醇或?qū)游龇ǖ鞍追蛛x工藝，分離提取免疫球蛋 白組分，經(jīng)超濾、層析、病毒滅活、配制、除菌、分裝等工序制成。本發(fā)明所述水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白的制造方法，其中，步驟a的方法為選擇符合國(guó)家采血標(biāo)準(zhǔn)的供血漿者，接種國(guó)家批準(zhǔn)的水痘疫苗，接種15天-20日時(shí)，以 固相酶聯(lián)免疫法(ELISA)定量檢測(cè)供血漿者血漿或血清的水痘-帶狀皰疹病毒中和抗體IgG， 中和抗體效價(jià)大于等于2IU/mL的血漿為水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白的合格原料血漿，所述 符合國(guó)家采血標(biāo)準(zhǔn)包括以下項(xiàng)目以雙縮脲法檢測(cè)蛋白質(zhì)含量大于等于55g/L，丙氨酸氨基轉(zhuǎn) 移酶(賴氏法)不高于25單位，乙型肝炎表面抗原陰性，梅毒陰性，HIV-1/HIV-2抗體陰性， HCV抗體陰性者。本發(fā)明所述水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白的制造方法，其中，每批次的混合原料血槳由 不少于IOO名供血漿者的原料血漿混合而成，測(cè)定混合原料血漿中的水痘-帶狀皰疹病毒中和 抗體效價(jià)，留中和抗體效價(jià)大于等于4IU/mL的混合原料血漿用以制備水痘-帶狀皰疹人免疫 球蛋白，如所得血漿的水痘-帶狀皰疹病毒中和抗體效價(jià)小于4IU/mL，則該批次血漿不能使用， 只能另作它用。本發(fā)明所述的水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白在制造預(yù)防易感人群患水痘的藥中的應(yīng)用， 其使用量為10 15IU/kg體重，且最大給藥劑量為625IU，最小給藥劑量125IU。本發(fā)明所述的水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白在制造治療帶狀皰疹及其后遺神經(jīng)痛藥物中的應(yīng)用，其使用劑量為1000 5000IU每天。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為提供了一種水痘-帶狀皰疹病毒中和抗體效價(jià)大于等于50IU/mL，其免 疫球蛋白純度大于等于總蛋白的90%，蛋白質(zhì)含量小于等于180g/L的人免疫球蛋白，因?yàn)槠?中的水痘-帶狀皰疹病毒中和抗體效價(jià)大于等于50IU/mL，故此其可以用以防治水痘病和治療 帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛，并取得良好的效果。為了得到水痘-帶狀皰疹病毒中和抗體效價(jià)大于等 于50IU/mL的人免疫球蛋白，發(fā)明人在采集血漿的時(shí)候，有目的的篩選水痘-帶狀皰疹病毒中 和抗體效價(jià)大于2IU/mL的獻(xiàn)血者的血漿，該方法在不提高制造成本的情況下，提升了最終 產(chǎn)品中水痘-帶狀皰疹病毒抗體的濃度，提高了藥效且簡(jiǎn)單方便。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例11、 供血漿者的免疫2008年8月1日至2008年9月7日選擇身體健康的符合國(guó)家采血標(biāo)準(zhǔn)的供血漿者254 名，同一名供血者在O、 25天分別接種水痘減毒活疫苗(疫苗生產(chǎn)廠家為中國(guó)生物技術(shù)集團(tuán) 公司上海生物制品研究所，批號(hào)為20080803， 0.5ml/支)各1支。所述符合國(guó)家采血標(biāo)準(zhǔn)包括 以下項(xiàng)目以雙縮脲法檢測(cè)蛋白質(zhì)含量大于等于55g/L,丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(賴氏法)不高于25單位，乙型肝炎表面抗原陰性，梅毒陰性，HIV-l/HIV-2抗體陰性，HCV抗體陰性者。2、 供血漿者的血漿篩選采集2008年9月21起選擇固相酶聯(lián)免疫法分別定量檢測(cè)已接種水痘疫苗供血漿者254人血 漿中水痘-帶狀皰疹病毒抗體IgG，水痘-帶狀皰疹病毒酶聯(lián)免疫試劑盒為中國(guó)藥品生物制品 檢定所生產(chǎn),批號(hào)為20090424，共檢出中和抗體效價(jià)大于2IU/mL的供血漿者分別為158人， 將該158人的血漿低溫冰凍儲(chǔ)存。3、 水痘、帶狀皰疹人免疫球蛋白的制備(1) 將水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白合格原料血漿158份融化混合，得混合原料血漿90000 毫升，用固相酶聯(lián)免疫法，水痘-帶狀皰疹病毒酶聯(lián)免疫試劑盒為中國(guó)藥品生物制品檢定所生 產(chǎn)，批號(hào)為20090424,定量檢測(cè)混合后混合原料血漿水痘-帶狀皰疹病毒中和抗體效價(jià)為 6.7IU/mL;(2) 將(1)步驟所得的無(wú)菌混合原料血漿，在2'C下離心去除冷沉淀7. 6Kg;(3) 將(2)步驟中去除冷沉淀后得到血漿83L，用8. 3L生理鹽水稀釋，用256mlPH4. 0醋酸 緩沖溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值至6.5，加95%乙醇19.2L至反應(yīng)液中，最終乙醇濃度為20%，反應(yīng)液終體積為110L,使用冷媒控制反應(yīng)液溫度至-4. 5'C并保持，板框壓濾分離得沉淀14kg;(4) 將步驟(3)的沉淀用(TC 0. 01mol/L NaCl溶液126L攪拌溶解，終體積為140L;(5) 在步驟(4)中得到的上清液中加50%乙醇47. 6L至反應(yīng)液中，最終乙醇濃度為度為17%， 用PH4. 0醋酸緩沖溶液365ml調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值至5.1，反應(yīng)液終體積為188L，使用冷媒控制 反應(yīng)液溫度至-4.5'C并保持，板框壓濾分離去除沉淀，收集上清液為178L;(6) 將步驟(5)中得到的上清液進(jìn)行超濾透析四遍后上DEAE-S印harose-Fast Flow弱陰離 子交換層析，反應(yīng)液溫度為10 'C，收集流出液為150L;(7) 將步驟(6)所得的流出液進(jìn)行再超濾，用2mol/L的冰醋酸780ml調(diào)節(jié)流出液pH值為4. 0， 溫度至l(TC,透析8遍后濃縮至10L，測(cè)蛋白含量為8.7%、 pH為3.90;(8) 將步驟(7)所得的濃縮液用2mol/L的冰醋酸12ml調(diào)pH至3. 85，加入30%麥芽糖5L 使最終濃度在10%，蛋白含量剛好為5. 8%;(9) 將上述步驟(8)所得原液經(jīng)24 25'C孵放21天之后用納米膜過(guò)濾的病毒滅活處理；21 天后將所得的液體再返回經(jīng)超濾、脫醇、脫鹽、濃縮，得到原液3520 ml，用固相酶聯(lián)免疫 法，定量檢測(cè)水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白中和抗體效價(jià)為120IU/ml，水痘-帶狀皰疹病毒酶 聯(lián)免疫試劑盒為中國(guó)藥品生物制品檢定所生產(chǎn)，批號(hào)為20090424;(10) 加入lmol/L的碳酸氫鈉溶液600ml調(diào)節(jié)步驟(9)所得原液pH值至6. 8,并加入30%葡萄 糖溶液740ml至原液中，使葡萄糖終濃度為4。/f),補(bǔ)加生理鹽水800inl，用固相酶聯(lián)免疫法，定 量檢測(cè)水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白中和抗體效價(jià)為75IU/ml，，水痘-帶狀皰疹病毒酶聯(lián)免疫 試劑盒為中國(guó)藥品生物制品檢定所生產(chǎn)，批號(hào)為20090424，再經(jīng)0.45um濾膜過(guò)濾得半成品 5560 ml。(1D除菌分裝為2.5 ml/瓶成品，共計(jì)1780瓶，取樣25瓶交質(zhì)量檢定部檢定。 4、成品檢定(1) 活性以酶聯(lián)免疫法檢測(cè)，使用中國(guó)藥品生物制品檢定所的酶聯(lián)免疫免疫試劑盒，批號(hào)為 20090424，水痘-帶狀皰疹病毒中和抗體效價(jià)為76.2IU/ml，以中和蝕斑法檢測(cè)效價(jià)為74.8 IU/ml。(2) 鑒別免疫雙擴(kuò)散法與抗人的血清反應(yīng)，抗人血清的生產(chǎn)廠家為中國(guó)藥品生物制品檢定所， 批號(hào)20060216，產(chǎn)生沉淀線，與抗馬、抗牛、抗豬、抗羊的血清未產(chǎn)生沉淀線。免疫電泳法DYY-2C型電泳儀，瓊脂糖凝膠，100V恒壓電泳2小時(shí)，與正常人血清反應(yīng)，主要沉淀線為IgG。(3) 蛋白質(zhì)含量 定氮法檢測(cè)126. 7g/L。(4) 純度檢測(cè)方法全自動(dòng)電泳掃描法 免疫球蛋白純度為98.5%。(5) 分子大小分布 檢測(cè)方法高壓液相色譜檢測(cè) IgG單體與二聚體含量之和97. 4%。(6) 外觀為無(wú)色澄清液體，無(wú)渾濁。(7) 熱穩(wěn)定性57°〇水浴中保溫4小時(shí)后，無(wú)凝膠化及絮狀物。(8) pH值用生理氯化鈉溶液將供試品蛋白質(zhì)含量稀釋成10g/L， pH值為6. 9。(9) 無(wú)菌檢査 無(wú)雜菌生長(zhǎng)；合格。 卿異常毒性觀察7天，用10只小白鼠和4只豚鼠(sps級(jí)，從安徽醫(yī)科大學(xué)購(gòu)得)，取0. 5ml腹腔注 射健存，體重平均增加4g;合格。(ll)熱原檢查使用成年兔子(普通級(jí)，從安徽醫(yī)科大學(xué)購(gòu)得)3只，按0.45ml/Kg靜脈 注射實(shí)施例1所得的免疫球蛋白，升溫總和為0. 87°C;個(gè)別升溫分別為0. 28°C、 0. 39°C、 0. 20 °C;合格。(1加CV抗體檢查為陰性；合格。(13)HIVL2抗體檢查，酶聯(lián)試劑盒，北京華大吉比愛(ài)生物公司，批號(hào)為20071001，為陰性；合格。實(shí)施例2 預(yù)防水痘7在水痘高發(fā)區(qū)某小學(xué)，隨機(jī)選擇三年級(jí)4個(gè)班共262人。實(shí)驗(yàn)組126人，平均年齡9. 8歲， 其中男65人，女61人；均應(yīng)用實(shí)例1制備的水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白肌肉注射125IU / 人，僅注射1次，觀察4個(gè)月，無(wú)一例發(fā)生水痘，發(fā)病率為0%?？瞻讓?duì)照組136人，平均年 齡IO. l歲，其中男69人，女67人；觀察4個(gè)月，31例發(fā)生水痘，發(fā)病率為22.8%。實(shí)施例3 帶狀皰疹的治療實(shí)驗(yàn)組選擇帶狀皰疹病人55例，男35例，女20例，平均年齡51.7歲，應(yīng)用實(shí)例1 制備的水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白肌肉注射3500IU每人/天，連續(xù)7天，全部病例均疼痛消 失，皰疹面積減少50%以上，有效率100%。對(duì)照組選擇帶狀皰疹病人35例，男20例，女15例，平均年齡52.5歲，均應(yīng)用靜注 人免疫球蛋白10g/天及一般對(duì)癥治療，連續(xù)觀察7天，疼痛消失，皰疹面積減少50%以上16 例，有效率45.7%。上面所述的實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行 限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神前提下，本領(lǐng)域普通工程技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案作出的 各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍內(nèi)，如未接種水痘疫苗的供 血漿者血清或血漿中水痘-帶狀皰疹病毒抗體IgG效價(jià)也可以大于2IU/mL,該人群的血漿也 可以作為原料血漿。
權(quán)利要求
1、水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白，其特征在于，水痘-帶狀皰疹病毒中和抗體效價(jià)大于等于50IU/mL，其免疫球蛋白純度大于等于總蛋白的90％，蛋白質(zhì)含量小于等于180g/L。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白，其特征在于，僅與抗人血清產(chǎn)生沉淀線。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白，其特征在于，與正常人血清比 較，主要沉淀線為IgG。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白，其特征在于IgG單體與二聚體 含量之和大于等于90%。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白，其特征在于劑型為液體針劑型 或凍干劑型，規(guī)格為125 IU/2.5 mL/瓶、250 IU/5. 0 mL/瓶。
6、 根據(jù)權(quán)利要求l至5任意一項(xiàng)所述水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白的制造方法，其特征 在于，按以下步驟制備a. 在符合國(guó)家采血標(biāo)準(zhǔn)的供血中，取其中水痘-帶狀皰疹病毒中和抗體IgG效價(jià)大于等于 2IU/mL者的血漿為水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白的制備原料血槳，并將所得血漿混合；b. 將a步驟所得的混合原料血漿按低溫乙醇或?qū)游龇ǖ鞍追蛛x工藝，分離提取免疫球蛋 白組分，經(jīng)超濾、層析、病毒滅活、配制、除菌、分裝等工序制成。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白的制造方法，其特征在于，步驟a 的方法為選擇符合國(guó)家采血標(biāo)準(zhǔn)的供血漿者，接種國(guó)家批準(zhǔn)的水痘疫苗，接種后15天-90天時(shí)， 以固相酶聯(lián)免疫法定量檢測(cè)供血漿者血漿或血清的水痘-帶狀皰疹病毒中和抗體效價(jià),大于等 于2IU/mL者的血漿為水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白的原料血漿。
8、 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白的制造方法，其特征在于，將 大于等于100名供血漿者的原料血漿混合成每批次的混合原料血漿，測(cè)定混合原料血漿中的 水痘-帶狀皰疹病毒中和抗體效價(jià)，留中和抗體效價(jià)大于等于4IU/mL的混合原料血漿用以制 備水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白在制造預(yù)防易感人群患水痘的藥 中的應(yīng)用。
10、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白在制造治療帶狀皰疹及其后遺神經(jīng)痛藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白，其中，水痘-帶狀皰疹病毒中和抗體效價(jià)大于等于50IU/mL，其免疫球蛋白純度大于等于總蛋白的90％，蛋白質(zhì)含量小于等于180g/L。其制造方法為在符合國(guó)家采血標(biāo)準(zhǔn)的供血漿者中，取其中水痘-帶狀皰疹病毒中和抗體IgG效價(jià)大于等于2IU/mL，蛋白質(zhì)含量大于等于55g/L者的血漿為水痘-帶狀皰疹人免疫球蛋白的制備原料血漿，并將所得血漿混合；再將所得的原料血漿按低溫乙醇或?qū)游龇ǖ鞍追蛛x工藝，分離提取免疫球蛋白組分，經(jīng)加壓過(guò)濾、層析、離心、超濾、病毒滅活、調(diào)配、除菌、分裝等工序制成。其可用于制備預(yù)防水痘和治療帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛藥物的制備。
文檔編號(hào)A61K39/42GK101591389SQ200910088040
公開(kāi)日2009年12月2日 申請(qǐng)日期2009年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月30日
發(fā)明者孫思才, 張振湖, 胡輝恒 申請(qǐng)人:同路生物制藥有限公司