專利名稱：：乙基丙二?；w薊賓衍生物用于制備抗氧化藥物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體而言，本發(fā)明涉及一個(gè)23位乙基丙二?；〈乃w薊賓酯類衍生物即化合物丙二酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基>6-(2,3-二氫-3,5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氫-1,4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基乙酯或其可藥用鹽用于制備抗氧化劑的藥物用途。對(duì)該化合物的藥理學(xué)試驗(yàn)表明該化合物具有體外清除超氧陰離子自由基、抑制自由基誘導(dǎo)之脂過(guò)氧化物生成的活性；此外，該化合物還表現(xiàn)出很強(qiáng)的對(duì)抗自由基引起的大鼠腎上腺嗜鉻瘤PC12細(xì)胞損傷作用，即對(duì)模擬腦神經(jīng)細(xì)胞的PC12細(xì)胞有抗氧化損傷保護(hù)作用，說(shuō)明其對(duì)保護(hù)腦細(xì)胞組織抗氧化和腦神經(jīng)抗氧化、防治老年性癡呆癥有積極作用，可以預(yù)期用于制備該類藥物的用途。再者，該化合物還對(duì)黃嘌呤氧化酶顯示一定的抑制作用，可以預(yù)期用于制備治療由黃嘌呤氧化酶引起的痛風(fēng)病的藥物。
背景技術(shù)：
：在眾多抗自由基天然產(chǎn)物中，水飛薊是少數(shù)幾個(gè)在臨床上廣泛應(yīng)用的藥物之一。三十多年的臨床實(shí)驗(yàn)證明該藥具有確切的療效和低毒性(參閱FloraK.等人，Am.J.Gastroenterol,1998,93，139—143;SailerR.等人，Drugs,2001,61(14)，2035-2063)。水飛薊中水飛薊賓含量最多，活性也最高。該藥作用主要有以下幾點(diǎn)(一)抗自由基活性水飛薊素對(duì)于由四氯化碳、半乳糖胺、醇類和其他肝毒素造成的肝損害具有保護(hù)作用。1990年Lotteron等人報(bào)道了在小鼠肝微粒體內(nèi)，水飛薊素能減少由四氯化碳代謝引起的體外脂質(zhì)過(guò)氧化及由還原型輔酶單獨(dú)引起的過(guò)氧化作用，這些都表明水飛薊素為鏈中斷抗氧化劑或?yàn)樽杂苫宄齽?二)保護(hù)肝細(xì)胞膜通過(guò)抗脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性，保護(hù)肝細(xì)胞膜。還能阻斷真菌毒素鬼筆毒環(huán)肽和a-鵝膏蕈堿等與肝細(xì)胞上特異受體的結(jié)合，抑制其對(duì)肝細(xì)胞的攻擊及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，中斷其肝腸循環(huán)，從而增強(qiáng)肝細(xì)胞膜對(duì)于多種損害因素的抵抗力。(三)促進(jìn)肝細(xì)胞的修復(fù)和再生水飛薊賓進(jìn)入細(xì)胞后可以與雌二醇受體結(jié)合，并使之激活，活化的受體可以增強(qiáng)肝細(xì)胞核內(nèi)RNA聚合酶1的活性，使RNA轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，促進(jìn)酶及蛋白質(zhì)的合成，并間接促進(jìn)DNA的合成，有利于肝細(xì)胞的修復(fù)和再生。(四)抗腫瘤作用各種活性氧能氧化鳥(niǎo)嘌呤形成8-羥基鳥(niǎo)嘌呤，造成DNA損傷，進(jìn)而引起腫瘤，水飛薊賓作為一個(gè)有效的抗自由基物質(zhì)也顯示了預(yù)防和治療腫瘤的作用。水飛薊賓類化合物具有確切的療效，但是由于其水溶性和生物利用度上的一些不足限制了該藥物的巿場(chǎng)。故尋找水飛薊賓類新的衍生物，使其能夠具有更高或者更新的藥理活性，以期獲取自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新藥，實(shí)屬必要。眾^^皂**^#^^^病如老年性癡呆癥(阿茲海莫癥，AD)、帕金森癥、腦卒中等密切相關(guān)。其原因主要與腦組織代謝特點(diǎn)有關(guān)-腦組織耗氧量大，脂肪含量高，而各種抗氧化酶的含量相對(duì)于其它組織而言偏少，因而易受自由基攻擊造成損傷(Gilgun-Sherki,Y.等，Antioxidanttherapyinacutecentralnervoussysteminjury:currentstate,P/zarwaco/.2002，54,271-2S4)。因而，目前認(rèn)為自由基參與了AD患者的病理過(guò)程。此外，自由基還可引起(3淀粉樣蛋白沉積，與細(xì)胞膜產(chǎn)生反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化損傷。因此，研發(fā)腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)抗氧化劑是治療老年性癡呆的有效途徑之一，從近期褪黑素(Melatonin)的風(fēng)靡可略見(jiàn)一斑(Green,K.N.等，Melatonin,aging,andage-relateddiseases:perspectivesforprevention,intervention,andtherapy./P/i戸'o/(Lond),2002,541(3):1013-1023)。因此，尋找新型有效抑制腦細(xì)胞氧化損傷的先導(dǎo)化合物或藥物既有巨大的社會(huì)效益又有顯著的經(jīng)濟(jì)效益。近年來(lái)，國(guó)際醫(yī)藥界持續(xù)不斷地投入了大量的人力、物力、財(cái)力，努力尋找抗氧化作用顯著、具有強(qiáng)效神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的抗氧化劑先導(dǎo)化合物。目前比較肯定的用于研究老年性癡呆癥(主要是膽堿能神經(jīng)系統(tǒng))的體外細(xì)胞模型主要有3種原代培養(yǎng)的海馬、皮層、基底前腦神經(jīng)細(xì)胞，PC12細(xì)胞和海馬HT22細(xì)胞株。本試驗(yàn)采用的PC12細(xì)胞以其在培養(yǎng)過(guò)程中的易獲得性和細(xì)胞均一性成為神經(jīng)科學(xué)離體研究中的重要工具細(xì)胞，并用于研究多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如老年癡呆癥、帕金森病等[王健，陳沙維，調(diào)心方對(duì)H202氧化損傷PC12細(xì)胞的保護(hù)作用研究，中^^>卞^:吉，2004年4巻7期；崔旭等，復(fù)方益智散對(duì)PC12細(xì)胞增值和抗凋亡作用，^華老牟AM^,染,吉，2006，8(3),198-201;徐鷹等，大豆苷元對(duì)氧自由基所致PC12細(xì)胞細(xì)胞毒作用的影響，游^T，2007，5期]。此外，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論證實(shí)痛風(fēng)病的致病因素之一是黃嘌呤氧化酶(EC1.2.3.2，簡(jiǎn)稱為XO)。此酶是體內(nèi)核酸代謝的一個(gè)重要酶，能催化次黃嘌呤和黃嘌呤生成尿酸和超氧陰離子，若機(jī)體不能及時(shí)清除產(chǎn)生的尿酸，使尿酸結(jié)晶鹽在關(guān)節(jié)處沉積，就會(huì)引起痛風(fēng)；產(chǎn)生過(guò)多的超氧陰離子也可引起多組織受損，因此測(cè)定化合物對(duì)xo的作用對(duì)發(fā)現(xiàn)新的xo抑制劑和其抗氧化作用有重要意義。從天然產(chǎn)物以及其衍生物中篩選出黃嘌呤氧化酶抑制劑先導(dǎo)化合物也是開(kāi)發(fā)治療痛風(fēng)病新藥的重要任務(wù)。綜上所述，本發(fā)明涉及一個(gè)乙基丙二酰基取代的水飛薊賓酯類衍生物的多種抗氧化機(jī)制藥效學(xué)活性及其用于制備相關(guān)疾病藥物的用途。經(jīng)測(cè)試發(fā)現(xiàn)該化合物具有清除超氧陰離子自由基活性、抑制自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化物生成的活性和對(duì)抗自由基引起的PC12細(xì)胞損傷作用，從而可以預(yù)期發(fā)展成為能于體內(nèi)清除自由基的藥物或藥物組合物，尤其是可以用于制備防治腦神經(jīng)氧化受損造成的老年性癡呆癥之藥物。此外，該化合物還表現(xiàn)出一定的抑制黃嘌呤氧化酶活性，因而還可以預(yù)期進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成為治療由黃嘌呤氧化酶引起的疾病包括痛風(fēng)病的藥物或藥物組合物。由此完成了本發(fā)明。本發(fā)明的目的是提供一種下式所示的23位乙基丙二?；〈乃w薊賓酯類衍生物即化合物丙二酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3,5,7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氫-1,4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基乙酯或其可藥用鹽用于制備一種氧自由基清除劑暨抗氧化劑藥物的用途。式(I)中10，ll位需同時(shí)是R構(gòu)型，或同時(shí)為S構(gòu)型。具體而言，本發(fā)明的目的之一是提供了丙二酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2,3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氫-l，4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基乙酯或其可藥用鹽用于制備防治由氧自由基引起或與氧自由基有關(guān)的老年性癡呆癥藥物的用途。本發(fā)明的另一目的是提供了丙二酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基>6-(2,3-二氫-3，5,7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氫-1,4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基乙酯或其可藥用鹽用于制備防治由黃嘌呤氧化酶引起的痛風(fēng)病之藥物的用途。
發(fā)明內(nèi)容式a)本發(fā)明的又一目的是提供了一種用于制備防治自由基引起的老年性癡呆癥以及由黃嘌呤氧化酶引起的痛風(fēng)病之藥物或藥物組合物，其中含有治療有效量的丙二酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5,7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氫-l，4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基乙酯或其可藥用鹽和藥用輔料。本發(fā)明的有益之處在于23位乙基丙二酰基取代的水飛薊賓酯類衍生物具有強(qiáng)效清除自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、對(duì)抗自由基引起的PC12細(xì)胞損傷和黃嘌呤氧化酶抑制等藥效作用，且其活性強(qiáng)于水飛薊賓，顯示該化合物可以預(yù)期應(yīng)用于制備治療新的適應(yīng)癥藥物，對(duì)于開(kāi)發(fā)新的抗老年性癡呆癥和痛風(fēng)病這兩種常見(jiàn)病及多發(fā)病創(chuàng)新型藥物提供了新的物質(zhì)基礎(chǔ)，具有潛在的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。再一特點(diǎn)是該化合物來(lái)源于天然產(chǎn)物的半合成結(jié)構(gòu)改造，制備步驟簡(jiǎn)便，成本低，污染小，利于大規(guī)模生產(chǎn)。具體實(shí)施例方式為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面首先用實(shí)施例的形式說(shuō)明化合物制備的過(guò)程，實(shí)施例給出了化合物的部分物理和化學(xué)及波譜學(xué)數(shù)據(jù)，其中OEt是指乙氧基(OCH2CH3)。必須說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)施例是用于說(shuō)明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的簡(jiǎn)單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。實(shí)施例1:化合物丙二酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2,3-二氫-3,5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基乙酯的制備在干燥的反應(yīng)瓶中加入1克水飛薊賓(購(gòu)自遼寧盤(pán)錦天緣藥業(yè)有限公司，HPLC檢測(cè)純度98%)，0.56克丙二酸單乙酯和1.6克三苯基膦，用20毫升無(wú)水四氫呋喃溶解，加入1克偶氮二甲酸二乙酯，加完后于室溫?cái)嚢?0小時(shí)，減壓蒸餾除去溶劑，加入5毫升氯仿，過(guò)濾除去白色固體，母液經(jīng)柱層析，得淺黃色粉末0.46克，收率37%。Rf(氯仿/醋酸乙酯/乙酸=50:1:0.25):0.11;核磁共振氫譜NMR(400MHz:氘代氯仿)5:1.28(三重峰，J=7.2Hz,3H，C//3)，3.41(單峰，2H,COC//2CO),3.76(單峰，3H,OCi/3)，4.08(多重峰，1H,H-23a),4.22(多重峰，2H,H-3，10)，4.30(多重峰，2H，OC772CH3),4.36(多重峰，1H，H—23b)，4.90(雙峰，J=7.6Hz,1H,H—11)，4.98(雙峰，J=10.8Hz，1H,H-2),5.99(單峰，1H,H—6),6.07(單峰,1H,H—8)，6.828.25(多重峰，9H,芳香環(huán)Ar-H),11.19(單峰，1H,5-OH);電噴霧質(zhì)譜ESI-MS:595(M-l)+?；衔锉醄3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2,3-二氫-3，5,7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2,3-二氫-l，4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基乙酯具有多種重要的生物活性，本發(fā)明通過(guò)多種藥效學(xué)試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)該化合物抗氧自由基活性進(jìn)行了測(cè)試，發(fā)現(xiàn)其具有確切的體外清除超氧陰離子自由基、以及抑制自由基誘導(dǎo)之脂過(guò)氧化物生成的活性。此外，該類化合物還表現(xiàn)出很強(qiáng)的對(duì)抗自由基引起的PC12細(xì)胞損傷作用，即對(duì)模擬腦神經(jīng)細(xì)胞的大鼠腎上嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞有抗氧化損傷保護(hù)作用。說(shuō)明其對(duì)保護(hù)腦神經(jīng)抗氧化、防治老年性癡呆癥有積極作用，可以用于制備保護(hù)腦神經(jīng)抗氧化、防治老年性癡呆癥藥物的用途。此外，該化合物還被發(fā)現(xiàn)具有抑制黃嘌呤氧化酶活性的作用，因而可以預(yù)期作為治療痛風(fēng)類疾病的藥物。本發(fā)明的化合物丙二酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2,3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氫-1,4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基乙酯或其可藥用鹽可以與藥學(xué)上常用的輔料或載體結(jié)合，制備用于治療自由基引起的老年性癡呆癥之藥物或藥物組合物。上述藥物或藥物組合物可以采用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑等劑型。本發(fā)明的化合物丙二酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2,3-二氫-3，5,7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氫-1,4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基乙酯或其可藥用鹽還可以與現(xiàn)已上市的抗自由基氧化劑藥物如超氧化物歧化酶(SOD)等聯(lián)合使用，制備得到具有防御自由基引起的損害活性的抗氧化藥物組合物，用于治療上述疾病。其也可與其他保護(hù)腦神經(jīng)抗氧化、防治老年性癡呆癥之藥物聯(lián)合使用，得到抗老年性癡呆藥物組合物。上述藥物組合物可以采用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑等劑型。本發(fā)明的式(I)化合物或其可藥用鹽還可以與現(xiàn)已上市的治療痛風(fēng)病藥物如黃嘌呤氧化酶抑制劑別嘌醇等聯(lián)合使用，制備得到具有治療痛風(fēng)病的藥物組合物，用于痛風(fēng)病的臨床治療。上述各類藥物組合物可以采用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑等劑型。本發(fā)明中所述劑型如片劑、膠囊劑、注射劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑和外用搽劑以及其各種緩釋、控釋劑型或納米制劑都可以根據(jù)現(xiàn)已公認(rèn)的藥劑學(xué)常識(shí)經(jīng)由常規(guī)制備而得，在這些公知知識(shí)和技術(shù)基礎(chǔ)上制備出的含有本發(fā)明權(quán)利要求化合物或其可藥用鹽的藥物或藥物組合物之其他劑型都在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面分別用藥理相關(guān)實(shí)施例的形式列舉化合物丙二酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2,3-二氫-3，5,7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2,3-二氫-l,4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基乙酯對(duì)超氧陰離子自由基抑制作用試驗(yàn)、對(duì)雙氧水H202所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用試驗(yàn)、抑制自由基誘導(dǎo)之脂質(zhì)過(guò)氧化物生成的活性試驗(yàn)，以及對(duì)黃嘌呤氧化酶XO的抑制作用試驗(yàn)之結(jié)果,說(shuō)明其在制藥領(lǐng)域中的用途以及用于制備相關(guān)抗氧化劑藥物的根據(jù)。藥理相關(guān)實(shí)施例給出了化合物的部分活性數(shù)據(jù)。同樣必須說(shuō)明，本發(fā)明列舉的這些實(shí)施例是用于說(shuō)明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的簡(jiǎn)單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。實(shí)施例2丙二酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3,5,7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氫-l，4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基乙酯體外清除超氧陰離子自由基的活性試驗(yàn)2.1實(shí)驗(yàn)材料與樣品2丄1實(shí)驗(yàn)試劑2.U.1盼嗪硫酸甲酯(phenazinemethosulfate,PMS)、硝基四氮唑蘭(nitrobluetetrazolium，NBT)、菲咯嗪(ferrozine)購(gòu)自Sigma公司；2丄1.2槲皮素(quercetin)由浙江大學(xué)藥學(xué)院中藥與天然藥物研究室實(shí)驗(yàn)室提供(純度為99%);水飛薊賓(Silybin)購(gòu)自遼寧盤(pán)錦天緣藥業(yè)有限公司，HPLC檢測(cè)純度98%。2丄1.3Tris堿，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司;2.1.1,43-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazoliumbromide(MTT)禾口NADH(還原型輔酶I)購(gòu)自Amresco公司；2丄1.5其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?，?gòu)自杭州華東醫(yī)藥試劑有限公司。2丄2儀器2.1.2.1酶標(biāo)儀Synergy-HT型，BIO-TEK公司；2丄2.2立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器LDZX-40BI型，上海申安醫(yī)療器材廠;2丄2.3紫外分光光度計(jì)UV-1201型，北京瑞利分析儀器公司；2丄2.4超純水系統(tǒng)UPWS-I-60D型，杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司；2丄2.5除菌過(guò)濾器Sterifi1500型，Millipore公司；2丄2.6氣浴恒i顯振蕩器THZ-C，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1丙二酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2,3-二氫-3，5,7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氫-l,4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基乙酯(簡(jiǎn)稱式(I)化合物)清除超氧陰離子自由基能力的檢測(cè)乃使用吩嗪-N甲硫酸鹽-NADH(phenazinemethosulfate-NADH)系統(tǒng)，用四唑氮藍(lán)(nitrobluetetrazolium)還原方法檢定。2.2.2用3毫升含有78nM的NADH、50四唑氮藍(lán)和10吩嗪-N甲硫酸鹽在pH值為8.0的16mMTris-HCl緩沖液中產(chǎn)生出超氧陰離子自由基，對(duì)不同濃度的式(I)化合物檢測(cè)其活性。超氧陰離子自由基和四唑氮藍(lán)反應(yīng)生成物的顏色用分光光度計(jì)在560nm波長(zhǎng)下監(jiān)測(cè)，水飛薊賓作為對(duì)照品，槲皮素被用作陽(yáng)性對(duì)照藥物。2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表一。表一樣品測(cè)試濃度(微克/毫升)對(duì)超氧陰離子自由基清除率式(I)化合物4041.04%水飛薊賓4038.18%槲皮素4063.24%2.4結(jié)論試驗(yàn)結(jié)果表明，式(I)化合物I即丙二酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5,7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2,3-二氫-l,4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基乙酯具有一定的超氧陰離子自由基清除作用，雖在同一濃度下，其清除能力沒(méi)有槲皮素高，但是其清除能力已經(jīng)略高于水飛薊賓。結(jié)論該23位乙基丙二?；〈乃w薊賓酯類衍生物屬于具有一定清除超氧陰離子自由基的抗氧化物質(zhì)。實(shí)施例3化合物丙二酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2,3-二氫-3,5,7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃—2)-2,3-二氫-1,4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基乙酯對(duì)雙氧水H202所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用活性試驗(yàn)3.1實(shí)驗(yàn)材料與樣品3丄1細(xì)胞大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞(PC12)購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所。3丄2實(shí)驗(yàn)試劑3.1.2.1雙氧水(hydrogenperoxide,H202)、石肖基四氮唑蘭(nitrobluetetrazolium，NBT)、菲咯嗪(ferrozine)購(gòu)自Sigma公司；3丄2.2槲皮素(quercetin)由浙江大學(xué)藥學(xué)院中藥與天然藥物研究室實(shí)驗(yàn)室提供(純度為99%);水飛薊賓(Silybin)購(gòu)自遼寧盤(pán)錦天緣藥業(yè)有限公司，HPLC檢測(cè)純度98%。3.1.2.3Tris堿，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；3.1.2.43-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5扁diphenyltetrazoliumbromide(MTT)購(gòu)自Amresco公司s3丄2.5小牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；3.1.2.6青霉素和鏈霉素由石家莊制藥集團(tuán)有限公司生產(chǎn)；3丄2.7其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自杭州華東醫(yī)藥試劑有限公司。3丄3儀器3.1.3.1酶標(biāo)儀Synergy-HT型，BIO-TEK公司；3丄3.2立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器LDZX-40BI型，上海申安醫(yī)療器材廠；3丄3.3紫外分光光度計(jì)UV-1201型，北京瑞利分析儀器公司；3丄3.4超純水系統(tǒng)UPWS-I-60D型，杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司；3.1.3.5除菌過(guò)濾器Sterifil500型，Millipore公司；3丄3.6氣浴恒溫振蕩器THZ-C，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；3丄3.7C02細(xì)胞培養(yǎng)箱MMM，德國(guó)公司；3丄3.S倒置顯微鏡XD-2型，重慶光電儀器有限公司。3.2實(shí)驗(yàn)原理H202是一種主要的活性自由基的前體，它可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的凋亡，PC12細(xì)胞(大鼠腎上嗜鉻細(xì)胞瘤)可模擬腦神經(jīng)細(xì)胞，因此常用它來(lái)作為研究藥物與神經(jīng)細(xì)胞之間關(guān)系的模型，用MTT測(cè)細(xì)胞的存活率，如果待測(cè)化合物有清除由11202引起的自由基、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用，則其細(xì)胞存活率高，OD值就高；反之就低。本發(fā)明采用對(duì)唐希燦所報(bào)道的方法(XiaoqiuXiao等，A^msc"幼er，1999,275:73-76)并對(duì)之加以改進(jìn)，用以測(cè)定化合物對(duì)PC12細(xì)胞的抗氧化損傷保護(hù)作用。3.3細(xì)胞培養(yǎng)PC12細(xì)胞用含10%小牛血清，100U/毫升青霉素和100微克/毫升鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37。C、5%(302細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，常規(guī)方法傳代培養(yǎng)。3.4實(shí)驗(yàn)方法3.4.1細(xì)胞毒性的測(cè)定首先用改良的MTT法測(cè)定了待測(cè)化合物對(duì)PC12細(xì)胞增殖的作用。PC12細(xì)胞用胰酶-EDTA消化液消化，收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋至8000個(gè)/毫升的密度，然后接種于96孔細(xì)胞板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24小時(shí)后，分別將新配的待測(cè)的二甲亞砜溶液以濃度梯度加入到各孔中，使孔中化合物的最終濃度分別為16、8和4微克/毫升。72小時(shí)后，加入10微升MTT(5毫克/毫升)的生理鹽水溶液，繼續(xù)在37°C，5%C02潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3小時(shí)，棄去原液，每孔中加入150微升二甲亞砜，振蕩溶解生成的MTT晶體甲臜，用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)下比色，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率計(jì)算公式如下%細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(OD溶劑對(duì)照—OD樣品)/OD溶劑對(duì)照x100%。3.4.2式(I)化合物對(duì)H202所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用的測(cè)定PC12細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含10%牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升鏈霉素。細(xì)胞以每孔8000個(gè)的密度加到96孔板中，在37。C，50%C02潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36小時(shí)。用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化以及用MTT法測(cè)定細(xì)胞的存活率。細(xì)胞經(jīng)36小時(shí)的孵育后，分別將新配的式(I)化合物的二甲亞砜溶液以濃度梯度加入到各孔中。作用2小時(shí)后加入新配的11202(終濃度為600pM)作用3小時(shí)，顯微鏡觀察記錄，棄去原培養(yǎng)液，加入新的培養(yǎng)液IOO微升，然后加入MTT10微升，3小時(shí)后，小心吸去培養(yǎng)液，加入150微升DMSO溶解甲臜，于570nm處讀數(shù)。釆用水飛薊賓作為對(duì)照品，槲皮素為陽(yáng)性對(duì)照藥物。3.4.3試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表二。表二式(I)化合物及對(duì)照品對(duì)雙氧水損傷PC12細(xì)胞保護(hù)作用<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>3.5結(jié)論試驗(yàn)結(jié)果表明，丙二酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5,7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2,3-二氫-l,4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基乙酯具有較強(qiáng)的對(duì)抗自由基引起的PC12細(xì)胞損傷作用，即對(duì)模擬腦神經(jīng)細(xì)胞的PC12細(xì)胞有明確的抗氧化損傷保護(hù)作用。而且在同一濃度下，其清除自由基保護(hù)細(xì)胞的能力與陽(yáng)性對(duì)照槲皮素相近，且其保護(hù)PC12細(xì)胞免受自由基損傷能力大大強(qiáng)于水飛薊賓，說(shuō)明該23位乙基丙二?；〈乃w薊賓酯類衍生物屬于具有強(qiáng)效保護(hù)模擬腦神經(jīng)細(xì)胞的PC12細(xì)胞作用的抗氧化物質(zhì)。測(cè)定化合物對(duì)H202所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用可作為初步探討其保護(hù)中樞腦神經(jīng)細(xì)胞的作用機(jī)理之依據(jù)。故據(jù)該化合物表現(xiàn)出對(duì)雙氧水損傷所致PC12細(xì)胞的保護(hù)作用，可以預(yù)期其對(duì)老年性癡呆癥的治療有積極作用。實(shí)施例4化合物丙二酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2,3-二氫-3,5,7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2,3-二氫-l,4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基乙酯抑制自由基誘導(dǎo)之脂過(guò)氧化物生成的活性試驗(yàn)4.1實(shí)驗(yàn)原理脂質(zhì)過(guò)氧化是自由基作用于多不飽和脂肪酸的產(chǎn)物，含量與自由基的生成正相關(guān)，由于機(jī)體有抗氧化的酶系及非酶系的保護(hù)作用，使自由基不斷產(chǎn)生又不斷被清除。隨著年齡的增長(zhǎng)，體內(nèi)的抗氧化劑不斷下降，清除自由基的能力逐漸減弱，脂質(zhì)過(guò)氧化作用則增強(qiáng)，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物增多。因此，測(cè)定樣品抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用，是篩選抗肝腦組織氧化損傷藥物的重要指標(biāo)之一。本藥效學(xué)研究用維生素C-F^+系統(tǒng)誘導(dǎo)大鼠肝勻漿產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA),MDA能與硫代巴比妥酸(TBA)反應(yīng)，產(chǎn)物在532nm處有最大吸收，通過(guò)MDA量的變化間接反映化合物對(duì)肝勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用。4.2實(shí)驗(yàn)材料與樣品4.2.1試驗(yàn)動(dòng)物SD(sprague-dawley)大鼠購(gòu)自浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。合格證號(hào)SCXK(浙2007-0029)。4.2.2實(shí)驗(yàn)試劑4.2.2.1硫酸亞鐵FeS04(4pM)溶液國(guó)產(chǎn)FeS04分析醇試劑，購(gòu)自杭州華東試劑公司，使用前按照要求自配；4.2.2.2維生素C(50一)Vc溶液國(guó)產(chǎn)Vc分析醇試劑，購(gòu)自杭州華東試劑公司，使用前按照要求自配；4.2.2.3三氯醋酸CC13C02H(20%)溶液國(guó)產(chǎn)CC13C02H分析醇試劑，購(gòu)自杭州華東醫(yī)藥試劑有限公司，使用前按照要求自配；4.2.2.4磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫代巴比妥酸及其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純(杭州華東醫(yī)藥試劑有限公司)。4.2.2.5槲皮素(qiiercetin)由浙江大學(xué)藥學(xué)院中藥與天然藥物研究室實(shí)驗(yàn)室提供(純度為99%);水飛薊賓(Silybin)購(gòu)自遼寧盤(pán)錦天緣藥業(yè)有限公司，HPLC檢測(cè)純度98%。4.3實(shí)驗(yàn)材料與樣品4.3.1酶標(biāo)儀Synergy-HT型，BIO-TEK公司；4.3.2立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器LDZX-40BI型，上海申安醫(yī)療器材廠；4.3.3紫外分光光度計(jì)UV-120]型，北京瑞利分析儀器公司；4.3.4超純水系統(tǒng)UPWS-I-60D型，杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司；4.3.5恒溫水浴箱上海森信試驗(yàn)科學(xué)儀器公司；4.3.6氣浴恒溫振蕩器THZ-C，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；4.3.7臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)TGL-16G，上海安亭儀器廠。4.4實(shí)驗(yàn)方法4.4.1肝微粒體的制備抑制自由基誘導(dǎo)之脂過(guò)氧化物生成乃通過(guò)鼠肝微粒體檢測(cè)。取SD實(shí)驗(yàn)大鼠5只斷頭處死，迅速取出肝臟，用超速離心法制備肝微粒體。4.4.2樣品對(duì)鼠肝脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用在含F(xiàn)eS04(4pM)與Vc(50pM)的1亳升緩沖液中加入200微克/毫升微粒體中，以誘導(dǎo)產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化，同時(shí)加入不同濃度的待測(cè)化合物樣品，37。C孵育30分鐘后加入1毫升三氯醋酸(20%)中止反應(yīng)加入1.5毫升硫代巴比妥酸(0.76%)，10CTC沸水浴20分鐘，離心去除蛋白沉淀，在532nm波長(zhǎng)下測(cè)定上清吸光度。脂質(zhì)過(guò)氧化以反應(yīng)中生成的丙二醛表示，實(shí)驗(yàn)以槲皮素作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。用緩沖液代替反應(yīng)液作為空白對(duì)照組，加入同樣體積DMSO的為溶劑對(duì)照組。樣品對(duì)大鼠肝勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率的計(jì)算公式計(jì)算公式如下抑制率(％)二(OD樣品管一OD空白管)/(OD標(biāo)準(zhǔn)管一OD空白管)xl000/。。4.5試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表三。表三.樣品式(I)化合物對(duì)大鼠肝微粒體脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用(半數(shù)抑制濃度IC50)樣品編號(hào)IC50(微克/毫升)式(I)化合物19.89水飛薊賓33.39槲皮素0.53試驗(yàn)結(jié)果表明，化合物丙二酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3,5,7-三羥基斗氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氫-l,4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基乙酯具有較強(qiáng)的抑制自由基誘導(dǎo)之脂過(guò)氧化物生成能力，其半數(shù)抑制濃度IC5Q為19.89微克/毫升，即對(duì)細(xì)胞有明確的抗氧化損傷保護(hù)作用；與水飛薊賓比較，其抑制LPO活性提高了68°/。。4.6結(jié)論該化合物屬于具有強(qiáng)效保護(hù)細(xì)胞抗氧化物質(zhì)，提示其具有保護(hù)肝腦細(xì)胞組織降低氧化損傷、以及可以預(yù)期用于制備保護(hù)肝腦組織氧化損傷類疾病包括老年性癡呆癥藥物的作用。實(shí)施例5.丙二酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2,3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2,3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基乙酯對(duì)黃嘌呤氧化酶XO的抑制作用試驗(yàn)5.1實(shí)驗(yàn)材料與樣品5丄1試驗(yàn)動(dòng)物SD(sprague-dawley)大鼠于浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)得。合格證號(hào)SCXK(浙2007-0029)。5丄2實(shí)驗(yàn)試劑5丄2.1吩嗪硫酸甲酯(phenazinemethosuifate,PMS)、硝基四氮唑蘭(nitrobluetetrazolium,NBT)、黃嘌呤、菲咯嗪(ferrozine)購(gòu)自Sigma公司；5.1.2.2TritonX-100購(gòu)自Gibco公司；5丄2.3陽(yáng)性對(duì)照藥物別嘌醇，泰州美通藥業(yè)有限公司；5丄2.4磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀及其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純(杭州華東試劑公司)。5.1.3儀器5.1.3.1酶標(biāo)儀Synergy-HT型，BIO-TEK公司；5丄3.2立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器LDZX-40BI型，上海申安醫(yī)療器材廠；5丄3.3紫外分光光度計(jì)UV-1201型，北京瑞利分析儀器公司；5丄3.4超純水系統(tǒng)UPWS-I-60D型，杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司；5.1.3.5除菌過(guò)濾器Sterifil500型，Millipore公司；5丄3.6氣浴恒溫振蕩器THZ-C，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；5丄3.7玻璃勻漿器國(guó)產(chǎn)。5.2實(shí)驗(yàn)方法5.2.1取SD大鼠，斷頭處死，迅速取出肝臟至預(yù)冷的磷酸緩沖液(lOOmM，pH8.75)中，去除血管，剪碎后用磷酸緩沖液l:1(w/v)稀釋后在冰上直接勻漿，于-2(TC保存，用前用磷酸緩沖液(1:7)稀釋，4X:條件下離心(8000rpm/10分鐘)，取上清作為酶原。5.2.2化合物對(duì)XO的抑制作用測(cè)定采用酶聯(lián)免疫ELISA法。樣品孔中加入底物黃嘌呤(0.1亳克/毫升，600微升)，酶(30微升)，化合物丙二酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2,3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2>2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基乙酯用二甲亞砜溶解，用磷酸緩沖液稀釋，每孔30微升，使其終濃度為40微克/毫升、20微克/毫升和10微克/毫升，加入硝基蘭四氮唑和吩嗪甲硫酸酯(30微升)，最后加入TritonX-100(0.4%，IO微升)，在37。C中水浴保溫2小時(shí)，于550nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定?；衔飳?duì)黃嘌呤氧化酶抑制率由樣品OD值對(duì)于空白和對(duì)照OD值計(jì)算。黃嘌呤氧化酶抑制率(％)二[(OD標(biāo)準(zhǔn)管—OD空白管)—(OD樣品管—OD樣品空白管)]/(OD標(biāo)準(zhǔn)管—OD空白管)><100%。5.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果化合物丙二酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2,3-二氫-3，5,7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2,3-二氫-l,4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基乙酯在40微克/毫升時(shí)對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制率為32.32%，在20微克/毫升時(shí)對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制率為13.52%，在40微克/毫升時(shí)對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制率為9.47。％，而陽(yáng)性對(duì)照別嘌醇40微克/毫升時(shí)抑制率為89.2%，半數(shù)抑制濃度ICs(r2.35xl(^M。5.4結(jié)論雖然其抑制活性沒(méi)有陽(yáng)性藥物別嘌醇高，化合物丙二酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2,3-二氫-3，5,7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃誦2)-2,3-二氫-l,4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基乙酯對(duì)黃嘌呤氧化酶有一定的抑制活性，且其抑制活性呈量效關(guān)系。說(shuō)明該化合物具有進(jìn)一步發(fā)展成為療效確切的黃嘌呤酶抑制劑的潛能。在上述說(shuō)明書(shū)闡述本發(fā)明時(shí)，提供藥理相關(guān)實(shí)施例的目的是舉例說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)際操作過(guò)程和本發(fā)明的意義。在進(jìn)入本發(fā)明權(quán)利要求和其等同物范圍內(nèi)時(shí)，本發(fā)明的實(shí)際應(yīng)用包括所有一般變化、配合，或改進(jìn)。權(quán)利要求1.一種式(I)所示的23位乙基丙二?；〈乃w薊賓酯衍生物或其可藥用鹽在制備抗氧化劑藥物制劑中的應(yīng)用，式(I)的名稱為丙二酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基乙酯；id="icf0001"file="A2009100962900002C1.tif"wi="91"he="41"top="61"left="52"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>式(I)其條件是式(I)中10，11位同時(shí)是R構(gòu)型，或同時(shí)為S構(gòu)型。2.式(I)所示的23位乙基丙二?；〈乃w薊賓酯或其可藥用鹽在制備防治老年性癡呆癥藥物中的應(yīng)用。3.式(I)所示的23位乙基丙二?；〈乃w薊賓酯或其可藥用鹽在制備防治痛風(fēng)病藥物中的應(yīng)用。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>全文摘要本發(fā)明涉及乙基丙二?；w薊賓衍生物用于制備抗氧化藥物的用途。具體涉及一個(gè)23位乙基丙二酰基取代的水飛薊賓酯類化合物用于制備防治老年性癡呆癥或痛風(fēng)病藥物的用途。藥效學(xué)試驗(yàn)證實(shí)該化合物具有清除超氧陰離子自由基、抑制自由基誘導(dǎo)的脂過(guò)氧化物生成、對(duì)抗自由基引起的PC12細(xì)胞損傷作用即對(duì)模擬腦神經(jīng)細(xì)胞的PC12細(xì)胞有抗氧化損傷保護(hù)作用，從而可以預(yù)期發(fā)展成為保護(hù)腦神經(jīng)、防治由自由基損傷引起的老年性癡呆癥的藥物。該化合物還具有抑制黃嘌呤氧化酶的活性，因而可以預(yù)期其發(fā)展成為治療痛風(fēng)病的藥物。文檔編號(hào)A61P25/00GK101548969SQ200910096290公開(kāi)日2009年10月7日申請(qǐng)日期2009年3月5日優(yōu)先權(quán)日2009年3月5日發(fā)明者伍義行,巫秀美,李校堃,楊雷香,峰汪,佳瞿,昱趙,郝小江,黃可新申請(qǐng)人:溫州醫(yī)學(xué)院;李校堃