專利名稱：烏司他丁用于治療急性肝衰竭的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及藥物化學領域，具體而言，本發(fā)明涉及烏司他丁新的藥物用途，即烏司他丁用于急性肝衰竭方面的用途。研究背景急性肝功能衰竭(acute liver failure，ALF)是由多因素引起的肝細胞嚴重損 害，臨床危重疾病之一，表現(xiàn)出嚴重肝衰竭癥狀，如黃疸、凝血障礙、肝性腦病急性肝衰竭 的結果是快速發(fā)展成多器官衰竭，死亡率非常高。如不及時實行肝移植術，死亡率可高達 80%-90%，是醫(yī)學上最最棘手的綜合癥之一。急性肝衰竭的發(fā)病機制及其復雜，感染、藥物 /毒素/化學品、心血管、代謝均可以引發(fā)急性肝衰竭。其中最為常見的病因是病毒性肝炎， 其次為藥物及毒物中毒。據(jù)報道，內毒素血癥、炎性細胞激活并分泌炎癥介質、過度免疫、線 粒體損傷與能量代謝障礙均可能在發(fā)病過程中起到關鍵作用，其中內毒素血癥在肝臟損害 機制中尤為重要。烏司他丁(ulinastatimUTI)在男性尿液中提取，由143個氨基酸組成，分子量約 為67kd的酸性糖蛋白，是一種胰蛋白酶抑制劑，可以抑制多種蛋白酶，對各種炎癥介質的 釋放有明顯的抑制作用。目前，烏司他丁在臨床上主要用于重癥胰腺炎以及胰腺手術后患 者，用于抑制胰蛋白酶活性。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，它對各種炎癥因子的產生和釋放有明顯的抑 制作用，能夠阻斷全身炎癥反應綜合征(SIRS)/MODS的過程，對肝腎心肺等重要器官均具 有保護作用。國內已有研究應用UTI對肝臟手術術后，肝臟缺血再灌注損傷中對肝臟保護 作用。但其對內毒素誘導急性肝衰竭的保護作用尚未有人探討。因此，本發(fā)明的目的是提 供了烏司他丁用于急性肝損傷的用途，即用于制備治療急性肝損傷的藥物的用途。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供烏司他丁在治療急性肝衰竭中的用途。本發(fā)明的烏司他丁對急性肝衰 竭具有明顯的降低轉氨酶，抑制氧化應激損傷、抑制炎癥因子釋放、抑制凋亡等護肝治療作 用本發(fā)明的烏司他丁對急性肝損傷是由脂多糖和D-氨基半乳糖引起的急性肝衰竭 的治療作用。本發(fā)明還涉及烏司他丁治療急性肝衰竭的方法。動物實驗證實烏司他丁對急性肝衰竭有著一定烏司他丁的治療劑量根據(jù)病情的嚴重程度，治療時間而定，一般靜脈注射給藥每 次100-300萬單位，每天給藥1-3次。一般來說，醫(yī)生將根據(jù)病情和被治療患者的具體情況來確定適當?shù)膭┝?。烏司他丁對急性肝損傷的治療作用通過以下方法在動物實驗上得到證實。一材料與方法1、試劑脂多糖(LPS)購自北京寶希迪科技有限公司。D-Gal購自江蘇南通通呂生物制品 有限公司。UTI購自廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司。SOD、MDA測定試劑盒購自南京建成 生物工程研究所，L-FABP免疫組化試劑盒購自上海晶天生物科技有限公司，TNF-α ELISA試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司試劑盒Caspase-3和Caspase-8試劑盒購自碧云天 生物科技公司2、實驗設備01ympusAu560全自動生化分析儀(德國SEMENS公司)；350mm-600mm分光光度計 (上海精密科學儀器有限公司)；臺式離心機(上海醫(yī)用分析儀器廠)；電熱恒溫水箱(上 海醫(yī)療器械廠)；YSlOO光學顯微鏡(NIKON公司)；手動玻璃勻漿管(金山醫(yī)療儀器公司)； 自動酶標儀(BI0-RAD公司)3、動物分組成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠186只，(由溫州醫(yī)學院動物中心提供)，體重 200-250g/只，隨機分為對照組(A組6只)，模型組(B組)和UTI處理組(C組)，B、C組 再按各個時間點分為6h、12h、24h、36h、48h 5個亞組，每個亞組15只；另外B、C組各留15只，觀察其生存率。4、給藥正常對照組(空白組)腹腔注射2ml生理鹽水；模型組，按體重劑量腹腔注射 LPS40ug. kg—1，D-Gal800mg. kg—1 ；烏司他丁治療組，按體重劑量腹腔注射LPS 40ug. kg—1， D-Gal800mg. kg—1，半小時后腹腔注射烏司他丁 10U. kg—1，5U. ml—1。分別于造模后各個時間點腹腔注射10%水合氯醛0. 35ml/kg麻醉，切皮開腹，下 腔靜脈取血約4ml左右，迅速切取肝臟，濾紙吸干。取肝臟左葉同一部位肝組織行病理檢 查，其余肝組織切塊分裝，放入凍存管中，放入液氮罐，備用。5、檢測指標5. 1肝功能，于個時間點留取血液標本2ml，分離血清，全自動生化分析儀測ALT， AST水平。5. 2肝臟組織學檢查，新鮮肝組織用甲醛固定保存、脫水、包埋、HE染色、封片保 存，光鏡下組織學標本5. 3氧化應激因子SOD活力，MDA含量。制備10%肝組織勻漿，采用黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶SOD活力，硫代 巴比妥酸(TBA)測肝組織中MDA含量，分別按試劑說明書要求操作。5. 4血漿炎癥因子TNF-α檢測，采用雙抗體夾心ELISA法，按試劑盒說明書要求操 作，顯色后經全自動酶標儀檢測5. 5免疫組化檢測L-FABP表達，采用免疫組織化學染色SABC法檢測大鼠肝臟組織 L-FABP蛋白的表達，應用Image-Pro Plus圖像分析軟件分析。5. 6Caspase-3和Caspase-8活性測定，采用比色法測定ρ硝基苯胺(ρΝΑ)含量， 用Bradford法測定肝臟組織總蛋白質含量。最后根據(jù)處理組與空白對照組的倍增關系來 反映組織Caspase-3和Caspase-8活性高低。具體按試劑盒說明書操作6、統(tǒng)計學分析實驗數(shù)據(jù)經SPSS13. 0統(tǒng)計軟件進行分析，P < 0. 05為差異有顯著性，實驗數(shù)據(jù)均 以mean 士 SD表示，兩樣本均數(shù)比較采用Student-t檢驗分析。二、結果1、烏司他丁對LPS/D-Gal引起ALF大鼠死亡率的影響大鼠注射LPS/D-Gal后，活動減少，精神疲軟，模型組48h內死亡率可達50%和70%，烏司他丁預防給藥可顯著提高大鼠的活動力和精神狀態(tài)，48h內死亡率降至40%。生 存率情況見圖1。2、烏司他丁對LPS/D-Gal引起ALF大鼠肝臟組織形態(tài)學改變的影響模型組，肉眼觀肝臟增大，顏色較深，表面粗燥，間有黃色小顆粒樣突起，HE染色見 肝細胞出現(xiàn)大片彌漫性出血性壞死，細胞腫脹，肝竇擴張，淤血，肝小葉及支架結構被破壞 有大量炎性細胞浸潤。與正常對照組相比有明顯差異。烏司他丁給藥后上述肝組織損傷和 壞死程度均明顯減輕，多數(shù)動物僅發(fā)生輕、中度肝細胞壞死，伴有一定程度炎性細胞浸潤。 (圖2.圖3.圖4)3.烏司他丁對LPS/D-Gal引起ALF大鼠血清ALT、AST水平升高的影響大鼠腹腔注射LPS/D-Gal 6h后，模型組和治療組血清ALT、AST水平顯著升高，與 正常組比較有統(tǒng)計學意義(P < 0. 05)烏司他丁預防給藥可明顯逆轉血清轉氨酶異常升高， 和模型組比較有統(tǒng)計學意義(P < 0. 05)。(圖5. 6)4.烏司他丁對LPS/D-Gal引起大鼠肝臟組織抗氧化酶SOD活力下降MDA含量升高 的影響LPS/D-Gal使大鼠肝臟組織SOD活性明顯降低，模型組和正常組比較有統(tǒng)計學差異 (P < 0. 05)，烏司他丁組與模型組比較，明顯升高肝組織中SOD活性，(P < 0. 05)，SD大鼠建模后，模型組MDA的水平顯著高于對照組，和正常組比較有統(tǒng)計學差異 (P < 0. 05)，和模型組相比，烏司他丁處理后6h大鼠肝臟MDA水平顯著下降，和模型組比較 有顯著統(tǒng)計學差異(P < 0. 05)，(圖7. 8)5.烏司他丁對炎癥因子TNF-α釋放的影響在用D-GalN和LPS造模6h后，各組TNF- α水平就達到了最高水平，此后逐漸下 降，到24h已基本降到正常水平；UTI處理組與模型組相比在6h、12h點TNF-α水平明顯降 低，差異有統(tǒng)計學意義，見表1。表1各組大鼠不同時間點血清TNF- α水平變化(f ± s，η = 6，pg/ml)
正常組模型組UTI處理組
40. 28 + 11.77
6h396.24±121.8#198.64±32.72tt*12h105.66±18·9#81.54± 10.96ft* 24h67. 13±9.71tt58. 75±11.35 36h50.26±12.548.31 ±10.20 48h45.54±11.4746.07±13.96注與正常組比較#P < 0. 05 ；與正常組比較*P < 0. 05
6、肝組織 Caspase-3 和 Caspase-8 活性在用D-GalN和LPS造模6h后，模型組和UTI處理組Caspase-3和Caspase-8活 性均有明顯升高，與正常對照組相比均有統(tǒng)計學意義(P < 0. 05)，但與模型組相比各時間 點UTI處理組caspase-3和caspase-8活性均有顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P < 0. 05) (表2)。表2各組大鼠不同時間點肝組織Caspase-3和Caspase-8活性的變化(T ± s，η 注與正常對照組比較*P < 0. 05，與模型組比較:#P < 0. 057、肝組織L-FABP免疫組化結果免疫組織化學染色顯示L-FABP在正常肝臟組織中的陽性表達最強，表達分布廣 泛，表現(xiàn)為均勻的棕黃色，肝細胞胞漿以及細胞核核膜均有表達。烏司他丁組陽性染色稍減 弱，模型組最弱，基本上不表達。(圖9.圖10.圖11)本研究結果表明，烏司他丁通過提高SOD活性，降低MDA含量提高抗氧化應激損 傷能力，通過控制炎癥因子TNF-α釋放調控機體的炎癥反應，降低凋亡因子caspase-3和 caspase-8活性阻止肝細胞凋亡，提高肝細胞中L-FABP表達促進肝細胞內的脂肪代謝等途 徑對急性肝衰竭起到保護，從而為臨床治療急性肝衰竭提供新的治療藥物。


圖1、模型組和治療組大鼠48h存活率比較，kaplan meier(k)生存曲線圖2、正常大鼠肝組織HE染色圖3、模型組大鼠肝組織HE染色圖4、治療組大鼠肝組織HE染色圖5、各組大鼠AST水平圖6、各組大鼠ALT水平圖7、各組大鼠SOD活力8、各組大鼠MDA含量9、正常組大鼠肝組織L-FABP免疫組化圖
圖10、模型組大鼠肝組織L-FABP免疫組化圖
圖11、治療組大鼠肝組織L-FABP免疫組化圖
權利要求
烏司他丁用于急性肝衰竭的藥物用途。
2.根據(jù)權利1要求，其中急性肝衰竭是由內毒素引起。
全文摘要
本發(fā)明涉及烏司他丁用于治療急性肝衰竭的用途。本發(fā)明的烏司他丁對急性肝衰竭具有明顯的降低轉氨酶，抑制氧化應激損傷、抑制炎癥因子釋放、抑制凋亡等護肝治療作用。
文檔編號A61K38/57GK101837121SQ20091009677
公開日2010年9月22日 申請日期2009年3月19日 優(yōu)先權日2009年3月19日
發(fā)明者盧潔, 張曉華, 鄭毅, 陳永平 申請人:盧潔;陳永平