專(zhuān)利名稱：羥基磷灰石/絲素蛋白復(fù)合多孔支架材料的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物材料制備及蠶絲蛋白的加工利用領(lǐng)域，特別涉及一種骨 組織工程用羥基磷灰石/絲素蛋白復(fù)合多孔支架材料的制備方法。
背景技術(shù)：
骨損傷和骨缺損是臨床上常見(jiàn)的疾病，常需植骨治療，傳統(tǒng)的治療方法 是進(jìn)行自體或異體骨移植進(jìn)行骨修復(fù)。自體骨移植修復(fù)效果好，但存在供應(yīng) 有限，需進(jìn)行二次手術(shù)的缺點(diǎn)，同種異體骨移植存在免疫原性的缺點(diǎn)并且可 能傳播傳染病，都不是理想的骨修復(fù)材料。骨組織工程的基本思路是用少量 的組織細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)擴(kuò)增后修復(fù)骨缺損，同時(shí)可依據(jù)骨缺損情況任意塑形 達(dá)到完善的形態(tài)修復(fù)，為最終實(shí)現(xiàn)無(wú)損傷修復(fù)創(chuàng)傷和真正意義上的功能重建 開(kāi)辟了一條新的途徑。
絲素蛋白(Silk Fibroin簡(jiǎn)稱SF)是一種天然結(jié)構(gòu)性蛋白，由結(jié)晶區(qū)和 非結(jié)晶區(qū)兩部分組成，由于其特殊的分子結(jié)構(gòu)使其具有良好的生物學(xué)性質(zhì)， 如生物相容性、生物降解性、抗凝血性能、力學(xué)性能、支持多種細(xì)胞的粘附、 增殖和分化等。近年來(lái)絲素蛋白在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域的研究和應(yīng)用較多，如 細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)、藥物緩釋載體、固定化酶載體、隱形眼鏡、人工血管和創(chuàng)面 膜等。
羥基磷灰石(hydroxyapatite, HAP或HA)是一種生物活性陶瓷，其化 學(xué)組成和結(jié)晶結(jié)構(gòu)類(lèi)似于人體骨骼中的磷灰石。HA分子中的Ca"可以與含有 羧基的氨基酸、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸等發(fā)生交換反應(yīng)，具有良好的骨傳導(dǎo)性能和 生物活性，能與骨組織形成牢固的骨性結(jié)合促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)，并且相態(tài)比較穩(wěn) 定，無(wú)毒性、發(fā)炎性，是公認(rèn)的性能良好的骨修復(fù)替代材料。但單一組分的 羥基磷灰石脆性大、韌性較差、力學(xué)性能不足，降解緩慢且易從植入位點(diǎn)遷 移，這都限制了其作為人體材料種植體的使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種羥基磷灰石/絲素蛋 白復(fù)合多孔支架材料的制備方法，包括以下步驟
(1) 將脫膠后的纖維狀絲素在重量百分比濃度為50X的CaCl2溶液中， 重量比為1:25，溫度98。C，時(shí)間5min，溶解后經(jīng)過(guò)濾、透析后獲得重量濃 度為5%絲素蛋白溶液；
(2) 將6(TC的飽和Ca(OH)2溶液置于6(TC水浴中，緩慢滴加10% wt的 H3P04溶液，滴加過(guò)程中快速攪拌，溶液的pH保持在8.7;攪拌3h后置于 25r靜置48 h，將沉淀離心，將離心所得沉淀物于超聲波清洗器中振蕩處理 30 min，得到羥基磷灰石勻漿；
(3) 在不斷攪拌并保持水溫為25 。C條件下，根據(jù)配比需要，將絲素蛋 白溶液滴加于羥基磷灰石勻漿中，將混合溶液放入超聲波清洗器中，振蕩處 理3 5 min后取出，向其中緩慢滴加終濃度為0.03%的戊二醛交聯(lián)劑并攪拌 均勻后，快速移入24孔細(xì)胞培養(yǎng)平板，并立即放入-20 。C冰箱預(yù)冷凍12h;
(4) 將冷凍12 h后的載樣細(xì)胞培養(yǎng)平板取出，在25t:條件下，回溫處 理10 30min，然后重新放入-20 。C冰箱再冷凍24 h，然后再次取出放入-50 'C冷凍干燥機(jī)中干燥，最終制得各種不同比例的羥基磷灰石/絲素蛋白復(fù)合多 孔支架材料。
所述步驟(2)飽和Ca(OH)2溶液和10% wt的H3P04溶液的配比為體積 比700: 11。
所述步驟(2)用氨水調(diào)節(jié)pH值，使pH保持在8.7。 所述步驟(2)的滴加過(guò)程中使用磁力攪拌器快速攪拌。 所述步驟(2)的沉淀離心的離心速率為4000r/min。 所述步驟(2)得到的羥基磷灰石勻漿的鈣磷比為1.67。 所述步驟(4)的羥基磷灰石/絲素蛋白復(fù)合多孔支架材料的比例為1: 9 7: 3。
所述的脫膠后的纖維狀絲素的脫膠方法，包括以下步驟 (1)將桑蠶繭去蛹后的繭層剪成約lcn^的繭片，放入重量百分比濃度 為0.5% Na2C03沸水中進(jìn)行脫膠處理，桑蠶繭層與Na2C03溶液的質(zhì)量比為l : 30。(2)30min后，將己成纖維狀的蠶繭撈出擰干，并用去離子水清洗多次， 重復(fù)上述操作2次，室溫下自然晾干后得纖維狀脫膠蠶絲，即脫膠后的纖維 狀絲素。
本發(fā)明方法制得的羥基磷灰石/絲素蛋白復(fù)合多孔支架材料應(yīng)用于骨組織 工程支架材料。
本發(fā)明具有以下有益效果
(1) 將絲素蛋白與羥基磷灰石制成骨組織工程用復(fù)合支架材料， 一方面 絲素蛋白可以作為羥基磷灰粒子的粘結(jié)劑，抑制羥基磷灰石粒子在植入點(diǎn)的 脫離和遷移；另一方面可以提高材料的力學(xué)性能，將聚合物的韌性與無(wú)機(jī)粒 子的強(qiáng)度和硬度相中和。本發(fā)明采用共混法制備羥基磷灰石/絲素蛋白復(fù)合多 孔支架材料，能綜合兩者的性能，優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，獲得性能優(yōu)良的生物活性骨修 復(fù)材料。
(2) 本發(fā)明制備的羥基磷灰石/絲素蛋白復(fù)合多孔支架材料制備工藝簡(jiǎn) 單，需時(shí)短，制備條件容易滿足；不添加致孔劑，所用試劑少且廉價(jià)，成本 低；本發(fā)明所制備的支架材料孔隙率較高，孔隙分散均勻且孔與孔之間相互 貫通，適用于骨組織工程支架材料對(duì)孔隙及孔徑結(jié)構(gòu)的要求。


圖l為本發(fā)明中合成的羥基磷灰石顆粒的透射電鏡照片。 圖2為本發(fā)明實(shí)施例的HA與SF的比例為1: 9時(shí)的復(fù)合多孔支架材料 的孔隙結(jié)構(gòu)照片。
圖3為本發(fā)明實(shí)施例的HA與SF的比例為3: 7時(shí)的復(fù)合多孔支架材料 的孔隙結(jié)構(gòu)照片。
圖4為本發(fā)明實(shí)施例的HA與SF的比例為1: 1時(shí)的復(fù)合多孔支架材料 的孔隙結(jié)構(gòu)照片。
圖5為本發(fā)明實(shí)施例的HA與SF的比例為O: IOO時(shí)的復(fù)合多孔支架材 料的孔隙結(jié)構(gòu)照片。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案-
61、 纖維狀絲素的脫膠
(1) 將桑蠶繭去蛹后的繭層剪成約10112的繭片，放入重量百分比濃度
為0.5% Na2C03沸水中進(jìn)行脫膠處理，桑蠶繭層與Na2C03溶液的質(zhì)量比為l : 30。
(2) 30min后，將己成纖維狀的蠶繭撈出擰干，并用去離子水清洗多次， 重復(fù)上述操作2次，室溫下自然晾干后得纖維狀脫膠蠶絲，即脫膠后的纖維 狀絲素。
2、 重量濃度為5%絲素蛋白溶液的制備
(1)將脫膠后的纖維狀絲素在重量百分比濃度為50X的CaCl2溶液中， 重量比為1:25，溫度98。C，時(shí)間5 min，溶解后經(jīng)過(guò)濾、透析后獲得重量濃 度為5%絲素蛋白溶液。
3、 羥基磷灰石勻漿的制備
(1) 將700ml的6(TC的飽和Ca(OH)2溶液置于60。C水浴中，緩慢滴加 10% wt的H3P04溶液llml，滴加過(guò)程中使用磁力攪拌器不斷快速攪拌并保持 水溫，數(shù)顯pH計(jì)監(jiān)測(cè)溶液的pH，待溶液的pH低于7.0時(shí)，向其中滴加氨水， 調(diào)整溶液的pH保持在8.7;
(2) 攪拌3h后置于25。C靜置48h，傾去上層清液，收集下部沉淀并用 蒸餾水洗滌，將沉淀離心(4000 r/min)，向離心后所得沉淀物中加入少量去 離子水并攪拌均勻，于超聲波清洗器中振蕩處理30 min，得到轉(zhuǎn)磷比為1.67 的羥基磷灰石勻漿(圖1)。
實(shí)施例1:
(1) 精確稱取一定質(zhì)量羥基磷灰石勻漿，使用磁力攪拌器不斷攪拌并保 持水溫為25 °C,向其中緩慢逐滴加入絲素蛋白溶液。使HA與SF的比例為1: 9。
(2) 將羥基磷灰石與絲素蛋白的混合溶液放入超聲波清洗器中，振蕩處 理3 5 min。
(3) 取出混合溶液，向其中緩慢滴加終濃度為0.03%的戊二醛交聯(lián)劑(市 售)，磁力攪拌器緩慢攪拌均勻。(4) 將混合溶液快速移入24孔細(xì)胞培養(yǎng)平板，并立即放入-20。C冰箱中 預(yù)冷凍12 h。
(5) 將冷凍12 h后的載樣細(xì)胞培養(yǎng)平板取出，在25X:條件下，進(jìn)行回 溫處理10min，然后重新放入-2(TC冰箱再冷凍24h。
(6) 將冷凍24 h后的載樣細(xì)胞培養(yǎng)平板取出，放入-5(TC冷凍干燥機(jī)中 干燥，最終制得羥基磷灰石/絲素蛋白復(fù)合多孔支架材料HA10 (圖2)，其平 均孔徑為157.36um，密度為106.1 ±2.5mg/ml，孔隙率為75.5± 1.0 %。
實(shí)施例2:
(1) 精確稱取一定質(zhì)量羥基磷灰石勻漿，使用磁力攪拌器不斷攪拌并保 持水溫為25 °C，向其中緩慢逐滴加入絲素蛋白溶液。使HA與SF的比例為3: 7。
(2) 將羥基磷灰石與絲素蛋白的混合溶液放入超聲波清洗器中，振蕩處 理3 5 min。
(3) 取出混合溶液，向其中緩慢滴加終濃度為0.03%的戊二醛交聯(lián)劑， 磁力攪拌器緩慢攪拌均勻。
(4) 將混合溶液快速移入24孔細(xì)胞培養(yǎng)平板，并立即放入-2(TC冰箱中 預(yù)冷凍12 h。
(5) 將冷凍12 h后的載樣細(xì)胞培養(yǎng)平板取出，在25"C條件下，進(jìn)行回 溫處理20min，然后重新放入-20 。C冰箱再冷凍24 h。
(6) 將冷凍24 h后的載樣細(xì)胞培養(yǎng)平板取出，放入-5(TC冷凍干燥機(jī)中 干燥，最終制得羥基磷灰石/絲素蛋白復(fù)合多孔支架HA30 (圖3)，其平均孔 徑為126.26U m，密度為123.1±3.1mg/ml，孔隙率為82.1 ± 1.5 %。
實(shí)施例3:
(1) 精確稱取一定質(zhì)量羥基磷灰石勻漿，使用磁力攪拌器不斷攪拌并保 持水溫為25°C，向其中緩慢逐滴加入絲素蛋白溶液。使HA與SF的比例為1:
(2) 將羥基磷灰石與絲素蛋白的混合溶液放入超聲波清洗器中，振蕩處 理3 5 min。(3) 取出混合溶液，向其中緩慢滴加終濃度為0.03%的戊二醛交聯(lián)齊廿， 磁力攪拌器緩慢攪拌均勻。
(4) 將混合溶液快速移入24孔細(xì)胞培養(yǎng)平板，并立即放入-20。C冰箱中 預(yù)冷凍12 h。
(5) 將冷凍12 h后的載樣細(xì)胞培養(yǎng)平板取出，在25'C條件下，進(jìn)行回 溫處理30min，然后重新放入-20 。C冰箱再冷凍24 h。
(6) 將冷凍24 h后的載樣細(xì)胞培養(yǎng)平板取出，放入-5(TC冷凍干燥機(jī)中 干燥，最終制得羥基磷灰石/絲素蛋白復(fù)合多孔支架HA50 (圖4)，其平均孔 徑為94.67Pm，密度為175.9±5.2mg/ml，孔隙率為73.8± 1.4 %。
HA與SF的比例為O: 100，制備方法同實(shí)施例1至3，制備得如圖5所
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施例子。顯然， 本發(fā)明不限于以上實(shí)施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能 從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保 護(hù)范圍。
對(duì)照例:
權(quán)利要求
1、一種羥基磷灰石/絲素蛋白復(fù)合多孔支架材料的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)將脫膠后的纖維狀絲素在重量百分比濃度為50％的CaCl2溶液中，重量比為1∶25，溫度98℃，時(shí)間5min，溶解后經(jīng)過(guò)濾、透析后獲得重量濃度為5％絲素蛋白溶液；(2)將60℃的飽和Ca(OH)2溶液置于60℃水浴中，緩慢滴加10％wt的H3PO4溶液，滴加過(guò)程中快速攪拌，溶液的pH保持在8.7；攪拌3h后置于25℃靜置48h，將沉淀離心，將離心所得沉淀物于超聲波清洗器中振蕩處理30min，得到羥基磷灰石勻漿；(3)在不斷攪拌并保持水溫為25℃條件下，根據(jù)配比需要，將絲素蛋白溶液滴加于羥基磷灰石勻漿中，將混合溶液放入超聲波清洗器中，振蕩處理3～5min后取出，向其中緩慢滴加終濃度為0.03％的戊二醛交聯(lián)劑并攪拌均勻后，快速移入24孔細(xì)胞培養(yǎng)平板，并立即放入-20℃冰箱預(yù)冷凍12h；(4)將冷凍12h后的載樣細(xì)胞培養(yǎng)平板取出，在25℃條件下，回溫處理10～30min，然后重新放入-20℃冰箱再冷凍24h，然后再次取出放入-50℃冷凍干燥機(jī)中干燥，最終制得各種不同比例的羥基磷灰石/絲素蛋白復(fù)合多孔支架材料。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述步驟(2)飽和 Ca(OH)2溶液和10% wt的H3P04溶液的配比為體積比700: 11。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述步驟(2)用氨 水調(diào)節(jié)pH值，使pH保持在8.7。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述步驟(2)的滴 加過(guò)程中使用磁力攪拌器快速攪拌。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述步驟(2)的沉 淀離心的離心速率為4000r/min。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述步驟(2)得到 的羥基磷灰石勻漿的鈣磷比為1.67。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述步驟(4)的羥基磷灰石/絲素蛋白復(fù)合多孔支架材料的比例為1: 9 7: 3。
8、 權(quán)利要求1所述的脫膠后的纖維狀絲素的脫膠方法，其特征在于包括 以下步驟(1) 將桑蠶繭去蛹后的繭層剪成約lcr^的繭片，放入重量百分比濃度 為0.5% Na2C03沸水中進(jìn)行脫膠處理，桑蠶繭層與Na2C03溶液的質(zhì)量比為1 : 30。(2) 30min后，將己成纖維狀的蠶繭撈出擰干，并用去離子水清洗多次， 重復(fù)上述操作2次，室溫下自然晾干后得纖維狀脫膠蠶絲，即脫膠后的纖維 狀絲素。
9、 權(quán)利要求1至6中任一權(quán)利要求的方法制得的羥基磷灰石/絲素蛋白 復(fù)合多孔支架材料應(yīng)用于骨組織工程支架材料。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了羥基磷灰石/絲素蛋白復(fù)合多孔支架材料的制備方法，包括將絲素蛋白溶液滴加于羥基磷灰石勻漿中，將混合溶液放入超聲波清洗器中，振蕩處理，向其中滴加戊二醛交聯(lián)劑并攪拌后，移入細(xì)胞培養(yǎng)平板，并放入-20℃冰箱預(yù)冷；冷凍12h后，在25℃條件下，回溫處理再冷凍24h，然后再次干燥，制得各種不同比例的羥基磷灰石/絲素蛋白復(fù)合多孔支架材料。本發(fā)明制備的羥基磷灰石/絲素蛋白復(fù)合多孔支架材料制備工藝簡(jiǎn)單，需時(shí)短，制備條件容易滿足；不添加致孔劑，所用試劑少且廉價(jià)，成本低；本發(fā)明所制備的支架材料孔隙率較高，孔隙分散均勻且孔與孔之間相互貫通，適用于骨組織工程支架材料對(duì)孔隙及孔徑結(jié)構(gòu)的要求。
文檔編號(hào)A61L27/56GK101502672SQ20091009678
公開(kāi)日2009年8月12日 申請(qǐng)日期2009年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月19日
發(fā)明者強(qiáng) 豐, 張海萍, 朱良均, 閔思佳 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)