專利名稱：：具有抗腫瘤和免疫佐劑作用的多糖及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及從中草藥白藤梨中提取分離的具有抗腫瘤和免疫佐劑作用的白藤梨多糖A、白藤梨多糖B、白藤梨多糖C、白藤梨多糖D和包含有這4種多糖的白藤梨總多糖，及其制備方法和以該多糖為活性成分的藥物組合物，以及它們在治療腫瘤以及作為疫苗佐劑中的應用。
背景技術：
：腫瘤是當今世界最大的疑難病癥之一，為僅次于心血管疾病的第二大死因，嚴重威脅人民的生活和健康，給社會和家庭帶來巨大的壓力。全球抗腫瘤藥物約占藥物市場總銷售額的4.2%,份額雖不高，但年增長率卻常年保持在二位數(shù)，明顯高于其它各類藥品市場增長的平均值，顯示出臨床必需及遠未滿足臨床需求的強勁態(tài)勢。2006年抗腫瘤藥物全球零售額為221.82億美元，年增長率為13%。我國更是以每年17%的速度增長。隨著癌癥發(fā)病率上升、診斷率提高以及人口增多，臨床上對療效好、毒副反應小的抗腫瘤藥物的需求量激增。各國政府、研究機構和制藥公司對抗腫瘤藥物開發(fā)予以高度重視和巨額投資。外科手術、化療和放療是腫瘤治療的三大手段。外科手術適用于某些局部性腫瘤早期和中期的治療，但多數(shù)病人靠手術治療是不能防止腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移。放、化療雖然有相當高的治愈率，但常引起如骨髓抑制、免疫低下等毒副反應，使患者難以堅持治療。各種治療方法所帶來的患者生存質(zhì)量的下降問題使如何保留機體以及各受累器官的功能從而提高病人的生活質(zhì)量成為當前受到廣泛重視的課題。過去人們更多地強調(diào)根除腫瘤，但在實際中很多時候癌細胞被殺光了，病人也不行了，對病人造成的損害無可挽回。目前，臨床上更強調(diào)保證病人的生活質(zhì)量，更注重治療的整體過程，而并非一味地追求殺滅癌細胞，體現(xiàn)了醫(yī)學家不只關注藥物的療效，而且更關注對患者生存質(zhì)量的影響。這與當今中醫(yī)藥治療腫瘤的"帶瘤生存"以及古人之"邪正相安"的治療原則完全相符。大量的臨床實踐證明，中醫(yī)藥無論在改善臨床癥狀、提高生存質(zhì)量、防止復發(fā)轉(zhuǎn)移、延長生存期、以及與放化療配合的增效減毒等方面都有很好的效果。白藤梨為獼猴桃科植物毛花獼猴桃JWm'J^m'a"&aBenth.的干燥根，廣泛分布于浙江、江西、福建、湖南、廣西及廣東。民間用于治療胃癌、食道癌、乳腺癌、子宮頸癌和前列腺癌等多種癌癥。我們以小鼠移植性S180肉瘤和H22肝癌為模型，環(huán)磷酰胺為陽性對照藥，研究了白藤梨的抗腫瘤活性成分。通過比較白藤梨水提取物與乙醇提取物，以及水提取物的石油醚、正丁醇、醋酸乙酯三部分萃取物與粗多糖的體內(nèi)抗腫瘤作用，確定白藤梨的抗腫瘤活性物質(zhì)主要為多糖。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一類具有抗腫瘤和免疫佐劑作用的多糖。本發(fā)明的另一個目的是提供從中草藥白藤梨中提取分離多糖的方法。本發(fā)明的進一步目的是提供治療腫瘤和作為疫苗免疫佐劑的藥物組合物。本發(fā)明的還有一個目的是提供上述多糖和組合物在制備治療腫瘤的藥物以及制備預防和治療人獸傳染性疾病和癌癥的疫苗制劑方面的用途。本發(fā)明具有抗腫瘤和免疫佐劑作用的多糖包括從中草藥白藤梨中提取分離的白藤梨多糖A、白藤梨多糖B、白藤梨多糖C、白藤梨多糖D和包含有這4種多糖的混合物——白藤梨總多糖。白藤梨多糖A相對分子量為1.43xl06Da，由鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖按摩爾比為1.00:6.06:10.26:1.26:3.04:1.48:14.38組成；白藤梨多糖B相對分子量為2.06x106Da，由鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖按摩爾比為1,00:6.06:10.26:1.26:3.04:1.48:14.38組成；白藤梨多糖C相對分子量為1.73x106Da，由巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖按摩爾比為5.76:9.95:1.00:3.60:2.77:14.16組成；白藤梨多糖D相對分子量為1.13x106Da，由巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖按摩爾比為5.51:8.29:1.00:3.49:3.99:13.59組成。本發(fā)明提供的白藤梨多糖A(AEPA)、白藤梨多糖B(AEPB)、白藤梨多糖C(AEPC)、白藤梨多糖D(AEPD)和包含有這4種多糖的混合物——白藤梨總多糖(AEPS)，是從獼猴桃科植物毛花獼猴桃Jc加Wflm'朋AaBenth.的干燥根中提取的，制備方法包括以下步驟-a.將白藤梨藥材粉碎后，以水提取。b.濃縮水提取液，加入3倍水提取液體積的質(zhì)量濃度95%乙醇沉淀。收集沉淀依次以乙醇、丙酮和石油醚洗滌后，溶于蒸餾水中，透析，滲余物減壓濃縮，冷凍干燥，得白藤梨粗多糖。白藤梨粗多糖溶于0.1mol/L氯化鈉，經(jīng)0.45pm微孔濾膜濾過，濾液以凝膠色譜柱純化，氯化鈉溶液洗脫，收集洗脫液，濃縮，脫鹽，冷凍干燥，得白藤梨總多糖。c.白滕梨總多糖經(jīng)凝膠色譜柱分離，以0.12.0mol/L氯化鈉洗脫，收集不同洗脫液，濃縮，脫鹽，冷凍干燥，得到4個流份。d.各流份再經(jīng)凝膠色譜柱純化，以氯化鈉溶液洗脫，濃縮，脫鹽，冷凍干燥，得到白藤梨多糖A、白藤梨多糖B、白藤梨多糖C和白藤梨多糖D?！鲜霾襟Eb禾卩c中所說的柱色譜凝膠為DEAE-SephadexA-25、DEAE-SephadexA-50、DEAE-SepharoseCL-4B、DEAE-SepharoseCL-6B、DEAE-Cellulose32和DEAE-Cellulose52。步驟d中所說的柱色譜凝膠為SephadexG-畫、SephadexG-150、S印hadexG-200、SephacrylS-300、S印hacrylS-400、S印haroseCL-4B禾卩SepharoseCL-6B。本發(fā)明的藥物組合物含有治療有效量的白藤梨多糖A、白藤梨多糖B、白藤梨多糖C、白藤梨多糖D或白藤梨總多糖為活性成分，以及含有一種或多種藥學上可接受的載體。本發(fā)明的多糖和藥物組合物可用于制備治療腫瘤的藥物以及制備預防和治療傳染性疾病和癌癥的疫苗制劑。上文所述藥學上可接受的載體是指藥學領域的藥物載體。例如稀釋劑、賦形劑如水、生理鹽水、葡萄糖、甘露醇、甘油、乙醇及其混合物等；填充劑如淀粉、蔗糖等；粘合劑如纖維素衍生物、海藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯垸酮；濕潤劑如甘油；崩解劑如碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進劑如季銨化合物；表面活性劑如吐溫-80;潤滑劑如滑石、硬脂酸^、硬脂酸鎂和聚乙二醇等。另外還可以在組合物中加入其它輔料如香味劑、甜味劑等。本發(fā)明化合物可以組合物形式通過口服、鼻吸入、直腸、腸胃外或經(jīng)皮給藥的方式施用于需要這種治療的患者或需要接種疫苗的對象。用于口服時，可將其制成常規(guī)的固體制劑如片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊劑、丸劑、緩釋微丸、固體分散體、包含物等，制成的液體制劑如混懸劑、乳劑、溶膠劑、糖漿劑、合劑、溶液劑等；用于腸胃外給藥時，可將其制成注射用的溶液、水或油性混懸劑、乳劑、凍干粉、脂質(zhì)體、微囊、微球、納米囊、納米球等。優(yōu)先的形式是片劑、包衣片劑、膠囊、微丸、栓劑和注射劑，特別優(yōu)先特定部位靶向釋放的制劑。本發(fā)明藥物組合物的各種劑型可以按照藥學領域的常規(guī)生產(chǎn)方法制備。例如使活性成分與一種或多種載體混合，然后將其制成所需的劑型。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選含有活性成分占總重量比為0.01%99.9%。最優(yōu)選含有活性成分占總重量比為0.5%95%。本發(fā)明多糖的使用量可根據(jù)用藥途徑、患者年齡、體重、所治療的腫瘤種類和嚴重程度等變化，以及根據(jù)抗原種類、所需的抗體水平、接種對象的特異性及所需的免疫程序等各種因素，其日劑量可以是0.01^ig/kg100mg/Kg體重，優(yōu)選0.110mg/Kg體重?？梢砸淮位蚨啻问褂?。本發(fā)明的多糖動物實驗結(jié)果顯示出顯著抗腫瘤和免疫佐劑作用，可顯著抑制小鼠移植性S180肉瘤和H22肝癌的生長；提高荷瘤小鼠脾細胞增殖反應、自然殺傷(NK)細胞和細胞毒性T淋巴細胞(CTL)活性、脾細胞分泌IL-2和IFN-y能力以及血清中腫瘤抗原特異性IgG、IgG2a和IgG2b抗體水平；增強卵清蛋白免疫小鼠的體液免疫和細胞免疫應答，誘生機體同時產(chǎn)生Thl型和Th2型免疫應答。該類多糖的毒性小、安全性好。所以，本發(fā)明的多糖有望開發(fā)成具有免疫調(diào)節(jié)作用的抗腫瘤藥物和疫苗的免疫佐劑。圖1是白藤梨總多糖(AEPS)對荷S180肉瘤小鼠脾細胞增殖反應的影響。aP<0.05和e尸〈0.001w荷瘤對照組(MC)。圖2是白藤梨總多糖(AEPS)對荷S180肉瘤小鼠自然殺傷(NK)細胞活性的影響。？O.001vs荷瘤對照組(MC)。圖3是白藤梨總多糖(AEPS)對荷S180肉瘤小鼠細胞毒性T淋巴細胞(CTL)活性的影響。b尸O.Ol和e尸O.OOlw荷瘤對照組(MC)。圖4是白藤梨總多糖(AEPS)對荷S180肉瘤小鼠脾細胞分泌白介素2(IL-2)能力的影響。aP<0.05和bP<0.01w荷瘤對照組(MC)。圖5是白藤梨總多糖(AEPS)對荷S180肉瘤小鼠血清特異性抗體效價的影響。卞<0.05和，<0.01w荷瘤對照組(MC)。圖6是白藤梨多糖A(AEPA)、白藤梨多糖B(AEPB)、白藤梨多糖C(AEPC)和白藤梨多糖D(AEPD)對荷H22肝癌小鼠脾細胞增殖反應的影響。，<0.05、，<0.01和e尸O.OOlw荷瘤對照組(MC)。圖7是白藤梨多糖A(AEPA)、白藤梨多糖B(AEPB)、白藤梨多糖C(AEPC)和白藤梨多糖D(AEPD)對荷H22肝癌小鼠自然殺傷(NK)細胞和細胞毒性T淋巴細胞(CTL)活性的影響?！?lt;0.05、><0.01和e尸O.OOlw荷瘤對照組(MC)。圖8是白藤梨多糖A(AEPA)、白藤梨多糖B(AEPB)、白藤梨多糖C(AEPC)和白藤梨多糖D(AEPD)對荷H22肝癌小鼠脾細胞分泌IL-2能力的影響。卞<0.01vs荷瘤對照組(MC)。圖9是白藤梨多糖A(AEPA)、白藤梨多糖B(AEPB)、白藤梨多糖C(AEPC)7和白藤梨多糖D(AEPD)對荷H22肝癌小鼠脾細胞分泌Y-干擾素(IFN-y)能力的影響。？<0.01W荷瘤對照組(MC)。圖10是白藤梨多糖A(AEPA)、白藤梨多糖B(AEPB)、白藤梨多糖C(AEPC)和白藤梨多糖D(AEPD)對荷H22肝癌小鼠血清特異性抗體效價的影響。3尸<0.05和，<0.01w荷瘤對照組(MC)。圖11是白藤梨總多糖(AEPS)對卵清蛋白(OVA)免疫小鼠脾細胞增殖反應的影響。，<0.05、*<0.01和》<0.001wOVA對照組。圖12是白藤梨總多糖(AEPS)對卵清蛋白(OVA)免疫小鼠血清特異性IgGl、IgG2a和IgG2b抗體效價的影響。，<0.05、V<0.01和卞<0.001wOVA對照組。圖13是白藤梨總多糖(AEPS)對卵清蛋白(OVA)免疫小鼠自然殺傷(NK)細胞活性的影響。bP<0.01和^<0.001wOVA對照組。圖14是白藤梨總多糖(AEPS)對卵清蛋白(OVA)免疫小鼠分泌IL-2和IL-10能力的影響。卞<0.001wOVA對照組。圖15是白藤梨總多糖(AEPS)對卵清蛋白(OVA)免疫小鼠分泌IFN-y能力的影響。eP<0.001wOVA對照組。具體實施例方式以下通過實例進一步說明本發(fā)明。實施例l:白藤梨多糖制備制備白藤梨總多糖藥材白藤梨粗粉5kg,以水加熱回流提取2小時，濾過，藥渣繼續(xù)以水回加熱流提取2次。合并濾液，減壓回收至2000ml，加入3倍體積的質(zhì)量濃度95%乙醇，混勻，4'C靜置24小時。收集沉淀，依次以乙醇、丙酮和石油醚洗滌3次。將沉淀溶于蒸餾水中，透析，滲余物減壓濃縮，冷凍干燥，得白藤梨粗多糖。白藤梨粗多糖溶于O.lmol/L氯化鈉，經(jīng)0.45pm微孔濾膜濾過，濾液上DEAE-SephadexA-50凝膠色譜柱純化，氯化鈉溶液洗脫，收集洗脫液，濃縮，脫鹽，冷凍干燥，得白藤梨總多糖。白藤梨總多糖主要有鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，摩爾比為1.00:4.67:8.45:1.41:2.46:2.43:11.02。制備白藤梨多糖A藥材白藤梨粗粉5kg，以水加熱回流提取2小時，濾過，藥渣繼續(xù)以水回加熱流提取2次。合并濾液，減壓回收至2000ml，加入3倍體積的質(zhì)量濃度95%乙醇，混勻，4"靜置24小時。收集沉淀，依次以乙醇、丙酮和石油醚洗滌3次。將沉淀溶于蒸餾水中，透析，滲余物減壓濃縮，冷凍干燥，得白藤梨粗多糖。白藤梨粗多糖溶于0.1mol/L氯化鈉，經(jīng)0.45pm微孔濾膜濾過，濾液上DEAE-SephadexA-50凝膠色譜柱純化，氯化鈉溶液洗脫，收集洗脫液，濃縮，脫鹽，冷凍干燥，得白藤梨總多糖?？偠嗵且訢EAE-SephadexA-50色譜柱分離，以0.12.0mol/L氯化鈉洗脫，收集0.2mol/L氯化鈉的洗脫液，濃縮，脫鹽，冷凍干燥；再經(jīng)SephacrylS-400色譜柱純化，以氯化鈉洗脫，濃縮，脫鹽，冷凍干燥，得到白藤梨多糖A。白藤梨多糖A相對分子量為1.43xl06Da，由鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，摩爾比為1.00:6.06:10.26:1.26:3.04:1.48:14.38。制備白藤梨多糖B藥材白藤梨粗粉5kg，以水加熱回流提取2小時，濾過，藥渣繼續(xù)以水回加熱流提取2次。合并濾液，減壓回收至2000ml，加入3倍體積的質(zhì)量濃度95%乙醇，混勻，4"C靜置24小時。收集沉淀，依次以乙醇、丙酮和石油醚洗滌3次。將沉淀溶于蒸餾水中，透析，滲余物減壓濃縮，冷凍干燥，得白藤梨粗多糖。白藤梨粗多糖溶于0.1mol/L氯化鈉，經(jīng)0.45pm微孔濾膜濾過，濾液上DEAE-SephadexA-50凝膠色譜柱純化，氯化鈉溶液洗脫，收集洗脫液，濃縮，脫鹽，冷凍干燥，得白藤梨總多糖。白藤梨總多糖以DEAE-SephadexA-50色譜柱分離，以0.12.0mol/L氯化鈉洗脫，收集0.4mol/L氯化鈉的洗脫液，濃縮，脫鹽，冷凍干燥；再經(jīng)SephacrylS-400色譜柱純化，以氯化鈉洗脫，濃縮，脫鹽，冷凍干燥，得到白藤梨多糖B。白藤梨多糖B相對分子量為2.06xl(^Da，由鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，摩爾比為1.00:6.06:10.26:1.26:3.04:1.48:14.38。制備白藤梨多糖C藥材白藤梨粗粉5kg，以水加熱回流提取2小時，濾過，藥渣繼續(xù)以水回加熱流提取2次。合并濾液，減壓回收至2000ml，加入3倍體積的質(zhì)量濃度95%乙醇，混勻，4。C靜置24小時。收集沉淀，依次以乙醇、丙酮和石油醚洗滌3次。將沉淀溶于蒸餾水中，透析，滲余物減壓濃縮，冷凍干燥，得白藤梨粗多糖。白藤梨粗多糖溶于0.1mol/L氯化鈉，經(jīng)0.45|im微孔濾膜濾過，濾液上DEAE-SephadexA-50凝膠色譜柱純化，氯化鈉溶液洗脫，收集洗脫液，濃縮，脫鹽，冷凍干燥，得白藤梨總多糖。白藤梨總多糖以DEAE-SephadexA-50色譜柱分離，以0.12.0mol/L氯化鈉洗脫，收集0.4mol/L氯化鈉的洗脫液，濃縮，脫鹽，冷凍干燥；再經(jīng)SephacrylS-400色譜柱純化，以氯化鈉洗脫，濃縮，脫鹽，冷凍干燥，得到白藤梨多糖C。白藤梨多糖C相對分子量為1.73xl06Da，由巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，摩爾比為5.76:9.95:1.00:3.60:2.77:14.16。制備白藤梨多糖D藥材白藤梨粗粉5kg，以水加熱回流提取2小時，濾過，藥渣繼續(xù)以水回加熱流提取2次。合并濾液，減壓回收至2000ml，加入3倍體積的質(zhì)量濃度95%乙醇，混勻，4'C靜置24小時。收集沉淀，依次以乙醇、丙酮和石油醚洗滌3次。將沉淀溶于蒸餾水中，透析，滲余物減壓濃縮，冷凍干燥，得白藤梨粗多糖。白藤梨粗多糖溶于0.1mol/L氯化鈉，經(jīng)0.45)am微孔濾膜濾過，濾液上DEAE-SephadexA-50凝膠色譜柱純化，氯化鈉溶液洗脫，收集洗脫液，濃縮，脫鹽，冷凍干燥，得白藤梨總多糖。白藤梨總多糖以DEAE-SephadexA-50色譜柱分離，以0.12.0mol/L氯化鈉洗脫，收集0.4mol/L氯化鈉的洗脫液，濃縮，脫鹽，冷凍干燥；再經(jīng)SephacrylS-400色譜柱純化，以氯化鈉洗脫，濃縮，脫鹽，冷凍干燥，得到白藤梨多糖D。白藤梨多糖D相對分子量為1.13xl06Da，由巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，摩爾比為5.51:8.29:1.00:3.49:3.99:13.59。實施例2:白藤梨總多糖的體內(nèi)抗腫瘤作用取清潔級ICR小鼠50只，每鼠右腋皮下常規(guī)接種小鼠肉瘤S^細胞懸液0.2ml。接種24h后，稱重，隨機分組，每組10只。設為荷瘤對照組、環(huán)磷酰胺(CTX)陽性對照組、白藤梨總多糖(AEPS)低、中、高劑量試驗組。荷瘤對照組每日按0.2ml/10g經(jīng)口灌服生理鹽水，連續(xù)10天；陽性對照組按20mg/kg劑量腹腔注射CTX，隔日一次，共5次；白藤梨總多糖低、中、高劑量組按2.5mg/kg、5mg/kg和10mg/kg劑量灌胃給藥，每天一次，連續(xù)10次。于第ll天處死動物，取出腫瘤組織，稱重，計算抑瘤率。表l白藤梨總多糖口服給藥對小鼠S180肉瘤的抑瘤作用組別fT、體重(g)_給藥前給藥后30.09±2.9827.28士1.34:29.卯±2.0828.94±2.5428.27±1.982.33±0.27-0.76±0.08c67.151.21±0.20e47.811.16±0.11e50.111.04±0.18c55.34MC-22.64士1.11CTX2022.10±0.87AEPS2.522.30士1.035.022.07±0.931021.99±0.7510aiM).05和c尸O.OOlvs荷瘤對照組(MC)。結(jié)果表明白藤梨總多糖對小鼠S^肉瘤具有較好的治療作用。灌胃給以白藤梨總多糖2.5mg/kg、5mg/kg和10mg/kg對小鼠S18()肉瘤的抑瘤率分別為47.81%、50.11%和55.34%(表l)。說明白藤梨總多糖具有顯著的體內(nèi)抗腫瘤作用。實施例3:白藤梨總多糖對荷瘤小鼠免疫功能的影響取清潔級ICR小鼠60只，除正常對照組10只小鼠外，其余每鼠右腋皮下常規(guī)接種小鼠肉瘤818。細胞懸液0.21!11。接種24h后，稱重，隨機分組，每組10只。設為正常對照組、荷瘤對照組、環(huán)磷酰胺(CTX)陽性對照組、白藤梨總多糖(AEPS)低、中、高劑量試驗組。正常對照組和荷瘤對照組每日按0.2ml/10g經(jīng)口灌服生理鹽7]C，連續(xù)10天；陽性對照組按20mg/kg劑量腹腔注射CTX，隔日一次，共5次；白藤梨總多糖低、中、高劑量組按2.5mg/kg、5mg/kg和10mg/kg劑量灌胃給藥，每天一次，連續(xù)10次。于第ll天處死動物，取脾臟，制備脾細胞懸液；取血，分離制備血清。采用MTT法和ELISA法檢測AEPS低、中、高3個劑量口服給藥對荷S,8o肉瘤小鼠的脾細胞增殖反應、NK細胞和CTL活性、脾細胞分泌IL-2能力、以及血清中腫瘤抗原特異性IgG、IgG2aglIgG2b抗體水平的影響。結(jié)果表明AEPS不僅能顯著增強荷S!8。肉瘤小鼠T、B淋巴細胞的增殖能力、NK細胞和CTL的殺傷活性以及脾細胞分泌IL-2的能力，而且也能顯著提高荷瘤小鼠血清腫瘤抗原特異性IgG、IgG2a和IgG2b抗體水平(圖15)。這些結(jié)果說明AEPS具有促進荷瘤小鼠體液免疫和細胞免疫功能的作用，其可通過增強荷瘤小鼠免疫功能發(fā)揮抗腫瘤作用。實施例4:白藤梨多糖A、白藤梨多糖B、白藤梨多糖C和白藤梨多糖D的體內(nèi)抗腫瘤作用取清潔級ICR小鼠60只，每鼠右腋皮下常規(guī)接種小鼠肝癌H22細胞懸液0.2ml。接種24h后，稱重，隨機分組，每組10只。設為荷瘤對照組、環(huán)磷酰胺(CTX)陽性對照組、白藤梨多糖A(AEPA)試驗組、白藤梨多糖B(AEPB)試驗組、白藤梨多糖C(AEPC)試驗組和白藤梨多糖D(AEPD)試驗組。荷瘤對照組每日按0.2ml/10g經(jīng)口灌服生理鹽水，連續(xù)10天；陽性對照組按40mg/kg劑量腹腔注射CTX，隔日一次，共2次；白藤梨多糖A(AEPA)、白藤梨多糖B(AEPB)、白藤梨多糖C(AEPC)和白藤梨多糖D(AEPD)試驗組按10mg^g劑量灌胃給藥，每天一次，連續(xù)10次。于第11天處死動物，取出腫瘤組織，稱重，計算抑瘤率。表2白藤梨多糖A、白藤梨多糖B、白藤梨多糖C和白藤梨多糖D對小鼠移植性H22肝癌的抑制作用組別劑量體重(g)瘤重(g)抑制率(mg/kg)治療前治療后(%)MC-22.35±1.3133.41±2.311.67±0.24-CTX4021.66±0.9230.68±1.98a0.35±0.10e86.75AEPA1021.83±0.9432.00±2.210.93±0.33e48.61AEPB1021.58±0.8632.27±2.270.95±0.37e47.11AEPC1021.73±1.1433.51±1.900.81±0.32e56.67AEPD1021.60±1.4533.33±2.890.85±0.24c54.05<0.05和？O.OO1荷瘤對照組(MC)。結(jié)果表明白藤梨多糖A、白藤梨多糖B、白藤梨多糖C和白藤梨多糖D對小鼠H22肝癌具有較好的治療作用。按10mg/kg劑量灌胃給以白藤梨多糖A、白藤梨多糖B、白藤梨多糖C和白藤梨多糖D對小鼠H22肝癌的抑瘤率分別為48.75%、47.11%、56.67%和54.05%(表2)。說明白藤梨多糖A、白藤梨多糖B、白藤梨多糖C和白藤梨多糖D具有顯著的體內(nèi)抗腫瘤作用。實施例5:白藤梨多糖A、白藤梨多糖B、白藤梨多糖C和白藤梨多糖D對荷瘤小鼠免疫功能的影響取清潔級ICR小鼠70只，除正常對照組10只小鼠外，其余每鼠右腋皮下常規(guī)接種小鼠H22肝癌細胞懸液0.2ml。接種24h后，稱重，隨機分組，每組10只。設為正常對照組、荷瘤對照組、環(huán)磷酰胺(CTX)陽性對照組、白藤梨多糖A(AEPA)試驗組、白藤梨多糖B(AEPB)試驗組、白藤梨多糖C(AEPC)試驗組和白藤梨多糖D(AEPD)試驗組。正常對照組和荷瘤對照組每日按0.2ml/10g經(jīng)口灌服生理鹽水，連續(xù)10天；陽性對照組按20mg/kg劑量腹腔注射CTX，隔日一次，共5次；陽性對照組按40mg/kg劑量腹腔注射CTX，隔日一次，共2次；白藤梨多糖A(AEPA)、白藤梨多糖B(AEPB)、白藤梨多糖C(AEPC)和白藤梨多糖D(AEPD)試驗組按10mg/kg劑量灌胃給藥，每天一次，連續(xù)10次。于第ll天處死動物，取脾臟，制備脾細胞懸液；取血，分離制備血清。采用MTT法和ELISA法檢測白藤梨多糖A、白藤梨多糖B、白藤梨多糖C和白藤梨多糖D口服給藥對荷H22肝癌小鼠脾細胞增殖反應、NK細胞和CTL活性、脾細胞分泌IL-2和IFN，能力以及血清中腫瘤抗原特異性IgG、IgG2a和IgG2b抗體水平的影響。結(jié)果表明白藤梨多糖A、白藤梨多糖B、白藤梨多糖C和白藤梨多糖D不12僅能顯著增強荷H22肝癌小鼠的T、B淋巴細胞增殖能力、NK細胞和CTL的殺傷活性，以及脾細胞分泌IL-2和IFN-Y的能力，而且也能顯著提高荷瘤小鼠血清中腫瘤抗原特異性IgG、IgG2a^IgG2b抗體水平(圖610)，證實白藤梨多糖A、白藤梨多糖B、白藤梨多糖C和白藤梨多糖D均具有促進荷瘤小鼠體液免疫和細胞免疫功能的作用，4個多糖可通過增強荷瘤小鼠免疫功能發(fā)揮抗腫瘤作用。實施例6:白藤梨總多糖的免疫佐劑作用清潔級ICR小鼠隨機分組，每組5只。生理鹽水對照組每只皮下注射生理鹽水0,2ml;卵清蛋白(OVA)對照組每只皮下注射OVA溶液(0.5mg/ml)0.2ml;氫氧化鋁對照組每只皮下注射0.2ml含200iug氫氧化鋁的OVA溶液(0.5mg/ml);白藤梨總多糖試驗組每只注射0.2ml含白藤梨總多糖(25、50、100jug)的OVA溶液(0.5mg/ml)。各組免疫2次，第一次免疫和第二次免疫間隔14天。二免后14天處死動物，取脾臟，制備脾細胞懸液；取血，分離制備血清。采用MTT法、ELISA法和RT-PCR檢測OVA免疫小鼠脾細胞增殖反應、NK細胞和CTL活性、細胞因子分泌能力、細胞因子和轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達水平以及血清中特異性抗體效價。表3白藤梨總多糖(AEPS)對卵清蛋白(OVA)免疫小鼠脾細胞細胞因子和轉(zhuǎn)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>0.87±0.04e0.73±0.01c^<0.05、和c尸O.OOlvsOVA對照組。結(jié)果表明AEPS能顯著增強ConA、LPS和OVA誘導的OVA受免小鼠淋巴細胞增殖反應；提高免疫小鼠血清中OVA特異性IgG、IgGl、IgG2a和IgG2b抗體效價；促進免疫小鼠脾細胞分泌il-2、il-10和IFN-y的能力；增強免疫小鼠NK細胞對K562細胞的殺傷活性(圖1115);上調(diào)IL-2、IL-4、IL-10和IFN-y等細胞因子及T-bet和GATA-3等轉(zhuǎn)錄因子的mRNA表達(表3)。說明AEPS不僅能促進免疫小鼠對OVA的體液免疫和細胞免疫應答，而且可誘導平衡的Thl/Th2免疫應答。綜上所述，本發(fā)明的多糖具有顯著抗腫瘤和免疫佐劑，有望幵發(fā)成具有免疫調(diào)節(jié)作用的抗腫瘤藥物和疫苗的免疫佐劑。權利要求1、具有抗腫瘤和免疫佐劑作用的多糖，其特征在于它是從中草藥白藤梨根中提取分離的白藤梨多糖A、白藤梨多糖B、白藤梨多糖C、白藤梨多糖D和包含有這4種多糖的混合物——白藤梨總多糖。白藤梨多糖A相對分子量為1.43×106Da，由鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖按摩爾比為1.00∶6.06∶10.26∶1.26∶3.04∶1.48∶14.38組成；白藤梨多糖B相對分子量為2.06×106Da，由鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖按摩爾比為1.00∶6.06∶10.26∶1.26∶3.04∶1.48∶14.38組成；白藤梨多糖C相對分子量為1.73×106Da，由巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖按摩爾比為5.76∶9.95∶1.00∶3.60∶2.77∶14.16組成；白藤梨多糖D相對分子量為1.13×106Da，由巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖按摩爾比為5.51∶8.29∶1.00∶3.49∶3.99∶13.59組成。2、權利要求l所述的具有抗腫瘤和免疫佐劑作用的多糖的制備方法，其具體步驟如下a.將白藤梨藥材粉碎后，以水提取。b.濃縮水提取液，加入3倍水提取液體積的質(zhì)量濃度95%乙醇沉淀。收集沉淀依次以乙醇、丙酮和石油醚洗滌后，溶于蒸餾水中，透析，滲余物減壓濃縮，冷凍干燥，得白藤梨粗多糖。白藤梨粗多糖溶于0.1mol/L氯化鈉，經(jīng)0.45pm微孔濾膜濾過，濾液以凝膠色譜柱純化，氯化鈉溶液洗脫，收集洗脫液，濃縮，脫鹽，冷凍干燥，得白藤梨總多糖。c.白滕梨總多糖經(jīng)凝膠色譜柱分離，以0.12.0mol/L氯化鈉洗脫，收集不同洗脫液，濃縮，脫鹽，冷凍干燥，得到4個流份。d.各流份再經(jīng)凝膠色譜柱純化，以氯化鈉溶液洗脫，濃縮，脫鹽，冷凍干燥，得到白藤梨多糖A、白藤梨多糖B、白藤梨多糖C和白藤梨多糖D。3、根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征是步驟b和c中所說的柱色譜凝膠為DEAE-SephadexA-25、DEAE-SephadexA-50、DEAE-SepharoseCL-4B、DEAE-SepharoseCL-6B、DEAE-Cellulose32和DEAE-Cellulose52。4、根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征是步驟d中所說的柱色譜凝膠為SephadexG-IOO、SephadexG誦150、SephadexG-200、SephacrylS-300、SephaciylS-400、SepharoseCL扁4B和SepharoseCL-6B。5、用于治療腫瘤和作為疫苗佐劑的藥物組合物，其中含有治療有效量的權利要求1所述的白藤梨多糖A、白藤梨多糖B、白藤梨多糖C、白藤梨多糖D或白藤梨總多糖和藥物學上可接受的載體。6、根據(jù)權利要求5所述的藥物組合物，其特征在于白藤梨多糖A、白藤梨多糖B、白藤梨多糖C、白藤梨多糖D或白藤梨總多糖的有效量為0.01pg/kg層mg/kg體重。7、根據(jù)權利要求l的多糖在制備治療腫瘤的藥物中的應用。8、根據(jù)權利要求1的多糖在制備預防和治療傳染性疾病和癌癥的疫苗制劑中的應用。全文摘要本發(fā)明涉及具有抗腫瘤和免疫佐劑作用的多糖及其制備方法和以該多糖為活性成分的藥物組合物，以及它們在治療腫瘤以及作為疫苗的佐劑中的應用。該多糖是從中草藥白藤梨根中提取分離的白藤梨多糖A、白藤梨多糖B、白藤梨多糖C、白藤梨多糖D和包含有這4種多糖的混合物——白藤梨總多糖，具有顯著抗腫瘤和免疫佐劑作用。這些多糖可顯著抑制小鼠移植性S180肉瘤和H22肝癌的生長；提高荷瘤小鼠脾細胞增殖反應、自然殺傷(NK)細胞和細胞毒性T淋巴細胞(CTL)活性、脾細胞分泌IL-2和IFN-γ能力以及血清中腫瘤抗原特異性IgG、IgG2a和IgG2b抗體水平；增強卵清蛋白免疫小鼠的體液免疫和細胞免疫應答，誘生機體同時產(chǎn)生Th1型和Th2型免疫應答。這些多糖可作為具有免疫調(diào)節(jié)作用的抗腫瘤藥物和疫苗的免疫佐劑。文檔編號A61K31/715GK101518556SQ20091009749公開日2009年9月2日申請日期2009年4月7日優(yōu)先權日2009年4月7日發(fā)明者吳遠文,孫紅祥申請人:浙江大學