專利名稱：：殼寡糖脂肪酸嫁接物鍵合阿霉素藥物及制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬高分子前體藥物的合成領(lǐng)域，涉及殼寡糖-脂肪酸酸嫁接物與抗腫瘤藥物阿霉素的化學(xué)鍵合，以及所合成的殼寡糖-脂肪酸嫁接物鍵合阿霉素藥物在制備抗腫瘤和逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：惡性腫瘤是一種嚴(yán)重威脅人類生命的重大疾病。阿霉素是臨床常用的蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，能嵌入DNA中，阻止RNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程，抑制RNA的合成，也能阻止DNA的復(fù)制。阿霉素藥抗瘤譜廣，療效高，主要用于惡性淋巴肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、小細(xì)胞肺癌、胃癌、肝癌及膀胱癌等。然而小分子藥物易于被身體所吸收，體內(nèi)分布廣泛，缺乏特異性；因此現(xiàn)有的鹽酸阿霉素注射液，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也產(chǎn)生明顯的全身不良反應(yīng)，如心肌退行性病變、心肌間質(zhì)水腫、骨髓抑制等，臨床應(yīng)用受到限制。藥物的體內(nèi)吸收隨著藥物的分子量的增高而降低，高分子前體藥物可改變低分子藥物體內(nèi)分布的非特異性，同時(shí)通過(guò)化學(xué)鍵合鍵的緩慢水解，釋放出藥物，從而達(dá)到高效低毒的靶向治療的目的。有報(bào)道指出，化療過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的耐受性，是腫瘤化療失敗的重要原因，也是腫瘤化療急需解決的難題。有學(xué)者認(rèn)為90%以上惡性腫瘤患者死亡在不同程度上與耐藥因素有關(guān)。腫瘤產(chǎn)生耐藥性的原因十分復(fù)雜，不同藥物其耐藥機(jī)制不同，同一種藥物存在著多種耐藥機(jī)制。研究表明，聚合物載體可在一定程度上逆轉(zhuǎn)腫瘤的多藥耐藥性。聚合物載體可有效減少耐藥細(xì)胞的ATP量，卻不會(huì)引起敏感細(xì)胞的ATP量的變化。耐藥細(xì)胞中ATP量的減少，直接減少了被耐藥細(xì)胞泵出的腫瘤藥物量，表現(xiàn)為對(duì)腫瘤耐藥性的逆轉(zhuǎn)。合成高分子藥物按其結(jié)構(gòu)可分成下面三大類1.本身帶有藥理活性的合成高分子，這種藥物只有在聚合物形式才有活性，而構(gòu)成這種聚合物的單體及低聚物卻無(wú)活性。2.是把小分子藥物制成聚合物的形式，得到的高分子藥物與其母體小分子藥物的活性相同或相似。這一類藥物又可進(jìn)一步分成下面二種(1)4高分子載體藥物，即把分子藥物通過(guò)其價(jià)鍵連接到高分子載體之上，作為側(cè)基的一部分(2)聚合的藥物把小分子藥物(或稍加修改)作為單體或共單體，與另一種小分子一起縮聚成高分子，母體小分子藥物成為高分子主鏈的一部分高分子載體藥物包括l.高分子作為載體對(duì)藥物進(jìn)行物理包裹。2.小分子藥物與高分子載體的連接，后者可以先把小分子藥物連接到單體之上然后聚合，也可以直接往高分子載體上連接。由兩親嵌段共聚物分子在水性介質(zhì)中自聚集形成的聚合物膠團(tuán)(polymermicdks，PM)，是傳遞藥物的新型納米給藥載體。因其具有一些特有的藥物載體性質(zhì)，如粒徑小，在體內(nèi)、外具有良好的穩(wěn)定性和生物相容性，藥物的控制釋放以及生物膜通透性等特性，被認(rèn)為是一種具有廣闊前景的新型靶向給藥系統(tǒng)。聚合物膠團(tuán)通過(guò)"增強(qiáng)滲透與保留作用"(enhancedpermeabilityandretentioneffect,EPR)，被動(dòng)靶向腫瘤部位。殼聚糖(Chitosan，CS)是一類由氨基葡萄糖組成的陽(yáng)離子聚合物，能夠通過(guò)堿或酶使甲殼素脫乙?；玫健＿@種天然的多糖是一種具有生物相容性、生物可降解性、低毒的聚陽(yáng)離子天然高分子材料。殼聚糖的pKa值約為6.5，大分子量殼聚糖在生理?xiàng)l件下(7.27.4)不溶解；且消化道內(nèi)也沒有直接作用于殼聚糖分子結(jié)構(gòu)中P糖苷降解的殼聚糖酶，導(dǎo)致作為藥物載體的大分子量的殼聚糖難以被人體消化道吸收。殼聚糖經(jīng)酶降解后，可得到低分子量殼聚糖，即殼寡糖(chitosanoligosaccharide,CSO)。研究發(fā)現(xiàn)，殼寡糖在水性介質(zhì)中具有良好的溶解性能。但殼寡糖缺乏親脂性，不易被細(xì)胞攝取即較難透過(guò)細(xì)胞膜。殼寡糖經(jīng)脂肪酸修飾后，所得殼寡糖脂肪酸嫁接物在水性介質(zhì)中可通過(guò)自組裝形成嫁接物膠束，該嫁接物具有快速的腫瘤細(xì)胞攝取功能，并通過(guò)嫁接物的脂肪酸的接枝率(氨基取代度)的調(diào)控，分別實(shí)現(xiàn)細(xì)胞漿滯留和細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)的特征，該嫁接物膠束物理包裹抗腫瘤藥物后，可顯著提高原有藥物的抗腫瘤治療活性和逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性的功能。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供殼寡糖脂肪酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物，其具有代表性的結(jié)構(gòu)通式為其中R為脂肪酸；x為殼寡糖中未被脂肪酸和阿霉素化學(xué)實(shí)施的氨基葡萄糖單元和乙?；被咸烟菃卧獢?shù)；n為脂肪酸的化學(xué)修飾比例；y與z之和與n的積表示阿霉素的化學(xué)修飾比例，其中y與z分別表示阿霉素-順烏頭酸中間體中兩個(gè)羧基的反應(yīng)比例，阿霉素-順烏頭酸中間體，含有兩個(gè)羧基，殼寡糖上的氨基可與其中任何一個(gè)羧基反應(yīng)。本發(fā)明所使用的殼寡糖脂肪酸嫁接物已為國(guó)家發(fā)明專利"熒光標(biāo)記疏水改性殼聚糖聚合物及制備方法和應(yīng)用"(專利號(hào)ZL2005100507981);和"表面修飾疏水改性殼寡糖聚合物給藥膠團(tuán)及其制備方法"(專利號(hào)ZL200610051601.0)所涵蓋。殼寡糖脂肪酸嫁接物中殼寡糖的分子量l200kDa;脂肪酸的碳鏈長(zhǎng)度為C12-C22;殼寡糖的脫乙酰度為70%-100%;氮基取代度為1%~50%。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供殼寡糖脂肪酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物的合成，通過(guò)以下方案實(shí)現(xiàn)(1)阿霉素堿制備稱取鹽酸阿霉素200mg，溶于20ml二甲基亞砜中，加入一定量三乙胺(鹽酸阿霉素與三乙胺的摩爾比為1:2)，攪拌過(guò)夜，將反應(yīng)液置透析袋中，蒸餾水透析24小時(shí)，冷凍干燥，得到阿霉素堿；(2)阿霉素-順烏頭酸中間體制備稱取上述阿霉素堿50mg，溶于2ml吡啶中，另稱取一定量的順烏頭酸酐(阿霉素與順烏頭酸酐的摩爾比為1:5)H0CHOH溶于5ml二氧己烷中，緩慢滴加到阿霉素溶液中，低溫下攪拌過(guò)夜，用25ml氯仿，25mlNaHC03(5。/。)萃取，取水層，重復(fù)兩次，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至有沉淀析出(pH約為3)，繼續(xù)攪拌30min，低溫離心分離(10000rpm，10min)，棄去上清液。加入少量蒸餾水，離心，棄去上清液。得到的沉淀產(chǎn)物分散于水中，冷凍干燥，得到阿霉素-順烏頭酸中間體；(3)目的物制備稱取殼寡糖脂肪酸嫁接物100mg，溶于200ml水中，探頭超聲30次(400w，工作2s，間歇3s)，另稱取550mg阿霉素-順烏頭酸中間體，加入二甲基亞砜溶液，使中間體濃度為lmg/ml。中間體溶液緩慢滴加到嫁接物水溶液中，加入過(guò)量碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺(中間體與碳二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺摩爾比為1:10:10)，室溫下攪拌過(guò)夜。將反應(yīng)液置透析袋中，二甲基亞砜水混合溶媒透析2天，蒸餾水繼續(xù)透析l天，冷凍干燥，得到寡糖脂肪酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供殼寡糖脂肪酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物在制備抗腫瘤和逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性藥物中的應(yīng)用。結(jié)果表明，阿霉素與殼寡糖脂肪酸嫁接物化學(xué)鍵合后，仍具有顯著的抗腫瘤治療活性，并可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為47.89。本發(fā)明的有益之處是在前期的研究工作基礎(chǔ)上，利用殼寡糖脂肪酸嫁接物上殘留的氨基和抗腫瘤藥物阿霉素上的氨基，通過(guò)順烏頭酸酐的化學(xué)交聯(lián)，合成殼寡糖脂肪酸嫁接物化學(xué)鍵合阿霉素前體藥物，有望解決抗腫瘤化療藥物在體內(nèi)的耙向分布，降低化療藥物的毒性。本發(fā)明已在細(xì)胞水平證明殼寡糖脂肪酸嫁接物化學(xué)鍵合阿霉素仍可維持藥物良好的抗腫瘤療效，并通過(guò)殼寡糖脂肪酸嫁接物對(duì)阿霉素的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞耐藥性的逆。圖1為阿霉素-順烏頭酸中間體、殼寡糖硬脂酸嫁接物和殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物的核磁共振圖譜。圖2為殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物在不同pH釋放介質(zhì)中的釋放曲線(1^3)。具體實(shí)施例方式本發(fā)明通過(guò)實(shí)施例和附圖作進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例l(1)低分子量殼聚糖(殼寡糖)的制備取市售分子量為450kDa的殼聚糖(脫乙酰度為95%)50g，加至1500mL1.2%(WV)的鹽酸水溶液中，55'C條件下攪拌2小時(shí)，使殼聚糖充分溶漲后，緩慢加入2%的殼聚糖酶(w/w)溶液，在55'C溫度條件下進(jìn)行殼聚糖酶解反應(yīng)。以凝膠滲透色譜法控制殼聚糖的降解程度。待反應(yīng)結(jié)束后，在80'C下攪拌0.5h，加入0.3n/。(w/v)活性炭。將反應(yīng)液稀釋后，用布氏漏斗過(guò)濾，濾液用0.45Hm微孔濾膜處理，噴霧干燥得殼寡糖。經(jīng)測(cè)定，所得殼寡糖的重均分子量為18.1kDa。(2)殼寡糖硬脂酸嫁接物的合成取上述殼寡糖800mg，加30ml蒸餾水超聲溶解。另分別稱取253mg的硬脂酸和1.0g的碳二亞胺SA204.2mg(硬脂酸與碳二亞胺的摩爾比為1:10)，混合，加入20ml乙醇，水浴超聲溶解，于6(TC下攪拌40min，然后緩慢注射到殼寡糖水溶液中(殼寡糖與硬脂酸的摩爾比為1:20)，8(TC下攪拌反應(yīng)4h。冷卻至室溫。將終反應(yīng)液置透析袋中，蒸餾水透析3天。透析液冷凍干燥后，以無(wú)水乙醇洗滌去除殘留的硬脂酸，得到殼寡糖硬脂酸嫁接物。采用三硝基苯磺酸法測(cè)定殼寡糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度。取不同重量的殼寡糖(l10mg)分別溶于2ml的蒸餾水，加入4%碳酸氫鈉2ml和0.1%三硝基苯磺酸2mL，37'C下孵育2h，加入2mol/L鹽酸2mL，搖勻，344nm處測(cè)定吸光度，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。取上述殼寡糖-硬脂酸4mg溶于2mL蒸餾水中，同法操作，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算殼寡糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度為6.47%。(3)殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物的合成稱取鹽酸阿霉素200mg，溶于20ml二甲基亞砜中，加入一定量三乙胺(鹽酸阿霉素與三乙胺的摩爾比為1:2)，攪拌過(guò)夜，將反應(yīng)液置透析袋中，蒸餾水透析24小時(shí)，冷凍干燥，得到阿霉素。稱取上述阿霉素50mg，溶于2ml吡啶中，另稱取一定量的順烏頭酸酐(阿霉素與順烏頭酸酐的摩爾比為1:5)溶于5ml二氧己垸中，緩慢滴加到阿霉素溶液中，低溫下攪拌過(guò)夜，用25ml氯仿，25mlNaHC03(5。/。)萃取，取水層，重復(fù)兩次，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至有沉淀析出(pH約為3),繼續(xù)攪拌30min，低溫離心分離(10000rpm，10min)，棄去上清液。加入少量蒸餾水，離心，棄去上清液。得到的沉淀產(chǎn)物分散于水中，冷凍干燥，得到阿霉素-順烏頭酸中間體。稱取殼寡糖硬脂酸嫁接物100mg，溶于200ml水中，探頭超聲30次(400w,工作2s，間歇3s)，另稱取20mg阿霉素-順烏頭酸中間體，加入二甲基亞砜溶液，使中間體濃度為lmg/ml。中間體溶液緩慢滴加到嫁接物水溶液中，加入過(guò)量碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺(中間體與碳二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺摩爾8比為l:10:10)，室溫下攪拌過(guò)夜。將反應(yīng)液置透析袋中，二甲基亞砜水混合溶媒透析2天，蒸餾水繼續(xù)透析l天，冷凍干燥，得到殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物。利用紫外分光光度法測(cè)定阿霉素-殼寡糖-硬脂酸嫁接物中阿霉素的含量，阿霉素-順烏頭酸中間體溶于二甲基亞砜，蒸餾水稀釋配成不同濃度的溶液，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。一定量阿霉素-殼寡糖-硬脂酸嫁接物溶于蒸餾水中，測(cè)定吸光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算載體中阿霉素含量(重量百分比)為10.0%。(4)殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物的理化性質(zhì)核磁共振光譜法測(cè)定殼寡糖硬脂酸嫁接物、阿霉素-順烏頭酸中間體和殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物。稱取殼寡糖-硬脂酸嫁接物和阿霉素-殼寡糖-硬脂酸嫁接物各30mg，分別用0.5mlD2O溶解，另取阿霉素-順烏頭酸中間體5mg，溶于0.5mlDMSO-d6，用核磁共振^-NMR測(cè)定，結(jié)果參見圖1，圖中A為阿霉素-順烏頭酸中間體，B為殼寡糖硬脂酸嫁接物，C為殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物。采用芘熒光法測(cè)定殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物的臨界膠束濃度。取芘12mg，精密稱定，置100ml容量瓶，加丙酮溶解并定容。移取上述芘溶液lml，置100ml容量瓶中稀釋并定容。移取稀釋后的芘溶液0.5ml分別置10ml玻璃試管中，5(TC揮去丙酮。分別加入不同濃度的殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物溶液5ml，控制芘終濃度為7X10—7mol/l，室溫水浴超聲30min。掃描芘的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜(EX=337nm，EM:I尸374，13=384，狹縫-2.5nm和10nm)，測(cè)定熒光強(qiáng)度，并計(jì)算臨界膠束濃度，為73pg/ml。另取殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物10mg，精密稱定，溶解于10ml蒸餾水，探頭超聲30次(400w，工作2s，間歇3s)，得到lmg/ml的聚合物溶液。微粒粒度與表面電位分析儀測(cè)定殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物膠團(tuán)的粒徑為80.2nm，Zeta電位為43.1mV。(5)殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物體外釋放行為的考察分別取濃度為2mg/ml殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物lml，放入透析袋(MWCO7000)中，將透析袋放入10ml不同pH的磷酸緩沖液(分別為pH5.0和pH7.4)中。在37。C的搖床中振蕩。于不同時(shí)間點(diǎn)取樣，取樣后棄去全部釋放介質(zhì)，加入新鮮介質(zhì)10ml，連續(xù)取樣7天。熒光分光光度法測(cè)定樣品中的藥物濃度(EX=505nm，EM=565nm，狹縫5nm)。釋放曲線見圖2，圖中O:pH5.0釋放介質(zhì)，pH7.4釋放介質(zhì)。(6)殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物的抗腫瘤藥效及逆轉(zhuǎn)耐藥腫瘤細(xì)胞的耐藥性本發(fā)明以腫瘤細(xì)胞抑制率(IC5o值)，評(píng)價(jià)殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物的抗腫瘤藥效，以及對(duì)耐藥腫瘤細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)效率。細(xì)胞存活率試驗(yàn)采用四唑鹽比色法(MTTAssay)測(cè)定。以乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞及其耐藥細(xì)胞MCF-7/Adr細(xì)胞為模型，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入200^tl含1Xl()4個(gè)MCF-7細(xì)胞或MCF-7/Adr細(xì)胞的培養(yǎng)液，置37'C、5%0)2孵箱培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞完全貼壁后，細(xì)胞孔中分別加入不同濃度的阿霉素溶液、殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物溶液，以未經(jīng)處理的空白細(xì)胞為對(duì)照，每孔設(shè)復(fù)孔；孵育72小時(shí)后，每孔加入5mg/ml噻唑蘭(MTT)溶液20繼續(xù)孵育4小時(shí)后棄去上清液，每孔加入二甲基亞砜200W，用酶聯(lián)檢測(cè)儀測(cè)定吸光度，按下式計(jì)算細(xì)胞存活率細(xì)胞存活率(％)=實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度><100%經(jīng)計(jì)算，阿霉素和殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物對(duì)MCF-7細(xì)胞和MCF-7/Adr細(xì)胞的1(35()值結(jié)果，參見表1。表l阿霉素溶液和殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物，對(duì)MCF-7敏感和耐藥細(xì)胞的細(xì)胞毒性<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>研究結(jié)果表明，殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物仍具有顯著的抗腫瘤活性，并可逆轉(zhuǎn)MCF-7耐藥細(xì)胞的耐藥性。(^)低分子量殼聚糖(殼寡糖)的制備方法取市售分子量為450kDa的殼聚糖(脫乙酰度為95%)50g，加至1500mL1.2%(v/v)的鹽酸水溶液中，55'C條件下攪拌2小時(shí)，使殼聚糖充分溶漲后，緩慢加入2%的殼聚糖酶(w/w)溶液，在55"C溫度條件下進(jìn)行殼聚糖酶解反應(yīng)。以凝膠滲透色譜法控制殼聚糖的降解程度。待反應(yīng)結(jié)束后，在80'C下攪拌0.5h，加入0.3。/。(w/v)活性炭。將反應(yīng)液稀釋后，用布氏漏斗過(guò)濾，濾液用0.45微孔濾膜處理，噴霧干燥得殼寡糖。經(jīng)測(cè)定，所得殼寡糖的重均分子量為18.1kDa。(2)殼寡糖硬脂酸嫁接物的合成取上述殼寡糖800mg，加30ml蒸餾水超聲溶解。另分別稱取253mg的硬脂酸和1.0g的碳二亞胺SA204.2mg(硬脂酸與碳二亞胺的摩爾比為1:10)，混合，加入20ml乙醇，水浴超聲溶解，于6(TC下攪拌40min，然后緩慢注射到殼寡糖水溶液中(殼寡糖與硬脂酸的摩爾比為1:20)，8(TC下攪拌反應(yīng)4h。冷卻至室溫。將終反應(yīng)液置透析袋中，蒸餾水透析3天。透析液冷凍干燥后，以無(wú)水乙醇洗滌去除殘留的硬脂酸，得到殼寡糖硬脂酸嫁接物。采用三硝基苯磺酸法測(cè)定殼寡糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度。取不同重量的殼寡糖(l10mg)分別溶于2ml的蒸餾水，加入4%碳酸氫鈉2ml和0.1%三硝基苯磺酸2mL，37。C下孵育2h，加入2mol/L鹽酸2mL，搖勻，344nm處測(cè)定吸光度，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。取上述殼寡糖-硬脂酸4mg溶于2mL蒸餾水中，同法操作，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算殼寡糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度為6.47%。(3)殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物的合成稱取鹽酸阿霉素200mg，溶于20ml二甲基亞砜中，加入一定量三乙胺(鹽酸阿霉素與三乙胺的摩爾比為l:2)，攪拌過(guò)夜，將反應(yīng)液置透析袋中，蒸餾水透析24小時(shí)，冷凍干燥，得到阿霉素。稱取上述阿霉素50mg，溶于2ml吡啶中，另稱取一定量的順烏頭酸酐(阿霉素與順烏頭酸酐的摩爾比為1:5)溶于5ml二氧己烷中，緩慢滴加到阿霉素溶液中，低溫下攪拌過(guò)夜，用25ml氯仿，25mlNaHC03(5y。)萃取，取水層，重復(fù)兩次，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至有沉淀析出(pH約為3)，繼續(xù)攪拌30min，低溫離心分離(10000rpm，10min)，棄去上清液。加入少量蒸餾水，離心，棄去上清液。得到的沉淀產(chǎn)物分散于水中，冷凍干燥，得到阿霉素-順烏頭酸中間體。稱取殼寡糖硬脂酸嫁接物100mg，溶于200ml水中，探頭超聲30次(400w,工作2s，間歇3s)，另稱取5mg阿霉素-順烏頭酸中間體，加入二甲基亞砜溶液，使中間體濃度為lmg/ml。中間體溶液緩慢滴加到嫁接物水溶液中，加入過(guò)量碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺(中間體與碳二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺摩爾比為l:10:10)，室溫下攪拌過(guò)夜。將反應(yīng)液置透析袋中，二甲基亞砜水混合溶媒透析2天，蒸餾水繼續(xù)透析1天，冷凍干燥，得到殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物。利用紫外分光光度法測(cè)定殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物中阿霉素的含量，阿霉素-順烏頭酸中間體溶于二甲基亞砜，蒸餾水稀釋配成不同濃度的溶液，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。一定量殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物溶于蒸餾水中，測(cè)定吸光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算載體中阿霉素含量(重量百分比)為3.0%。(4)殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物的理化性質(zhì)采用芘熒光法測(cè)定殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物的臨界膠束濃度。取芘12mg，精密稱定，置100ml容量瓶，加丙酮溶解并定容。移取上述芘溶液lml，置100ml容量瓶中稀釋并定容。移取稀釋后的芘溶液0.5ml分別置10ml玻璃試管中，5(TC揮去丙酮。分別加入不同濃度的殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物溶液5ml，控制芘終濃度為7X10—7mol/l，室溫水浴超聲30min。掃描芘的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜(EX=337nm，EM:I產(chǎn)374，13=384，狹縫2.5nm和10nm)，測(cè)定熒光強(qiáng)度，并計(jì)算臨界膠束濃度，為94pg/ml。另取殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物10mg，精密稱定，溶解于10ml蒸餾水，探頭超聲30次(400w,工作2s，間歇3s)，得到lmg/ml的聚合物溶液。微粒粒度與表面電位分析儀測(cè)定殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物膠團(tuán)的粒徑為62.3nm，Zeta電位為39.6mV。實(shí)施例3(1)低分子量殼聚糖(殼寡糖)的制備方法取市售分子量為450kDa的殼聚糖(脫乙酰度為95%)50g，加至1500mL1.2%(v/v)的鹽酸水溶液中，55"C條件下攪拌2小時(shí)，使殼聚糖充分溶漲后，緩慢加入2%的殼聚糖酶(w/w)溶液，在55'C溫度條件下進(jìn)行殼聚糖酶解反應(yīng)。以凝膠滲透色譜法控制殼聚糖的降解程度。待反應(yīng)結(jié)束后，在80'C下攪拌0.5h，加入0.3。/o(w/v)活性炭。將反應(yīng)液稀釋后，用布氏漏斗過(guò)濾，濾液用0.45^rni微孔濾膜處理，噴霧干燥得殼寡糖。經(jīng)測(cè)定，所得殼寡糖的重均分子量為18.1kDa。(2)殼寡糖硬脂酸嫁接物的合成取上述殼寡糖800mg，加30ml蒸餾水超聲溶解。另分別稱取253mg的硬脂酸和1.0g的碳二亞胺SA204.2mg(硬脂酸與碳二亞胺的摩爾比為1:10)，混合，加入20ml乙醇，水浴超聲溶解，于6(TC下攪拌40min，然后緩慢注射到殼寡糖水溶液中(殼寡糖與硬脂酸的摩爾比為1:20)，8(TC下攪拌反應(yīng)4h。冷卻至室溫。將終反應(yīng)液置透析袋中，蒸餾水透析3天。透析液冷凍干燥后，以12無(wú)水乙醇洗滌去除殘留的硬脂酸，得到殼寡糖-硬脂酸嫁接物。采用三硝基苯磺酸法測(cè)定殼寡糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度。取不同重量的殼寡糖(l10mg)分別溶于2ml的蒸餾水，加入4%碳酸氫鈉2ml和0.1%三硝基苯磺酸2mL，37。C下孵育2h，加入2mol/L鹽酸2mL，搖勻，344nm處測(cè)定吸光度，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。取上述殼寡糖-硬脂酸4mg溶于2mL蒸餾水中，同法操作，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算殼寡糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度為6.47%。(3)殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物的合成稱取鹽酸阿霉素200mg，溶于20ml二甲基亞砜中，加入一定量三乙胺(鹽酸阿霉素與三乙胺的摩爾比為1:2)，攪拌過(guò)夜，將反應(yīng)液置透析袋中，蒸餾水透析24小時(shí)，冷凍干燥，得到阿霉素。稱取上述阿霉素50mg，溶于2ml吡啶中，另稱取一定量的順烏頭酸酐(阿霉素與順烏頭酸酐的摩爾比為1:5)溶于5ml二氧己烷中，緩慢滴加到阿霉素溶液中，低溫下攪拌過(guò)夜，用25ml氯仿，25mlNaHC03(5。/。)萃取，取水層，重復(fù)兩次，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至有沉淀析出(pH約為3)，繼續(xù)攪拌30min,低溫離心分離(10000rpm，10min)，棄去上清液。加入少量蒸餾水，離心，棄去上清液。得到的沉淀產(chǎn)物分散于水中，冷凍干燥，得到阿霉素-順烏頭酸中間體。稱取殼寡糖硬脂酸嫁接物100mg，溶于200ml水中，探頭超聲30次(400w，工作2s,間歇3s)，另稱取lmg阿霉素-順烏頭酸中間體，加入二甲基亞砜溶液，使中間體濃度為lmg/ml。中間體溶液緩慢滴加到嫁接物水溶液中，加入過(guò)量碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺(中間體與碳二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺摩爾比為1:10:10)，室溫下攪拌過(guò)夜。將反應(yīng)液置透析袋中，二甲基亞砜水混合溶媒透析2天，蒸餾水繼續(xù)透析1天，冷凍干燥，得到殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物。利用紫外分光光度法測(cè)定殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物中阿霉素的含量，阿霉素-順烏頭酸中間體溶于二甲基亞砜，蒸餾水稀釋配成不同濃度的溶液，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。一定量殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物溶于蒸餾水中，測(cè)定吸光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算載體中阿霉素含量(重量百分比)為0.62%。(4)殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物的理化性質(zhì)采用芘熒光法測(cè)定的殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物de臨界膠束濃度。取芘12mg，精密稱定，置100ml容量瓶，加丙酮溶解并定容。移取上述芘溶液lml，置100ml容量瓶中稀釋并定容。移取稀釋后的芘溶液0.5ml分別置10ml玻璃試管中，5(TC揮去丙酮。分別加入不同濃度的殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物溶液5ml，控制芘終濃度為7X10_7mol/l，室溫水浴超聲30min。掃描芘的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜(EX-337nm，EM:I尸374，13=384，狹縫-2.5nm和10nm)，測(cè)定熒光強(qiáng)度，并計(jì)算臨界膠束濃度，為100pg/ml。另取殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物10mg，精密稱定，溶解于10ml蒸餾水，探頭超聲30次(400w,工作2s，間歇3s)，得到lmg/ml的聚合物溶液。微粒粒度與表面電位分析儀測(cè)定殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物膠團(tuán)的粒徑為24.8nm，及Zeta電位為36.8mV。實(shí)施例4(1)低分子量殼聚糖(殼寡糖)的制備方法取市售分子量為450kDa的殼聚糖(脫乙酰度為95%)50g，加至1500mL1.2%(v/v)的鹽酸水溶液中，55"C條件下攪拌2小時(shí)，使殼聚糖充分溶漲后，緩慢加入2%的殼聚糖酶(w/w)溶液，在55'C溫度條件下進(jìn)行殼聚糖酶解反應(yīng)。以凝膠滲透色譜法控制殼聚糖的降解程度。待反應(yīng)結(jié)束后，在8(TC下攪拌0.5h，加入0.3%(w/v)活性炭。將反應(yīng)液稀釋后，用布氏漏斗過(guò)濾，濾液用0.45pm微孔濾膜處理，噴霧干燥得殼寡糖。經(jīng)測(cè)定，所得殼寡糖的重均分子量為18.1kDa。(2)殼寡糖硬脂酸嫁接物的合成取上述殼寡糖800mg，加30ml蒸餾水超聲溶解。另分別稱取253mg的硬脂酸和1.0g的碳二亞胺SA204.2mg(硬脂酸與碳二亞胺的摩爾比為1:10)，混合，加入20ml乙醇，水浴超聲溶解，于6(TC下攪拌40min，然后緩慢注射到殼寡糖水溶液中(殼寡糖與硬脂酸的摩爾比為1:20)，8(TC下攪拌反應(yīng)4h。冷卻至室溫。將終反應(yīng)液置透析袋中，蒸餾水透析3天。透析液冷凍干燥后，以無(wú)水乙醇洗滌去除殘留的硬脂酸，得到殼寡糖-硬脂酸嫁接物。采用三硝基苯磺酸法測(cè)定殼寡糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度。取不同重量的殼寡糖(l10mg)分別溶于2ml的蒸餾水，加入4%碳酸氫鈉2ml和0.1%三硝基苯磺酸2mL，37。C下孵育2h，加入2mol/L鹽酸2mL，搖勻，344nm處測(cè)定吸光度，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。取上述殼寡糖-硬脂酸4mg溶于2mL蒸餾水中，同法操作，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算殼寡糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度為6.47%。(3)殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物的合成稱取鹽酸阿霉素200mg，溶于20ml二甲基亞砜中，加入一定量三乙胺(鹽酸阿霉素與三乙胺的摩爾比為1:2)，攪拌過(guò)夜，將反應(yīng)液置透析袋中，蒸餾水透析24小時(shí)，冷凍干燥，得到阿霉素。稱取上述阿霉素50mg，溶于2ml吡啶中，另稱取一定量的順烏頭酸酐(阿霉素與順烏頭酸酐的摩爾比為1:5)溶于5ml二氧己垸中，緩慢滴加到阿霉素溶液中，低溫下攪拌過(guò)夜，用25ml氯仿，25mlNaHC03(5M)萃取，取水層，重復(fù)兩次，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至有沉淀析出(pH約為3)，繼續(xù)攪拌30min，低溫離心分離(10000rpm，10min)，棄去上清液。加入少量蒸餾水，離心，棄去上清液。得到的沉淀產(chǎn)物分散于水中，冷凍干燥，得到阿霉素-順烏頭酸中間體。稱取殼寡糖硬脂酸嫁接物100mg，溶于200ml水中，探頭超聲30次(400w，工作2s,間歇3s)，另稱取50mg阿霉素-順烏頭酸中間體，加入二甲基亞砜溶液，使中間體濃度為lmg/ml。中間體溶液緩慢滴加到嫁接物水溶液中，加入過(guò)量碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺(中間體與碳二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺摩爾比為l:10:10)，室溫下攪拌過(guò)夜。將反應(yīng)液置透析袋中，二甲基亞砜水混合溶媒透析2天，蒸餾水繼續(xù)透析l天，冷凍干燥，得到殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物。利用紫外分光光度法測(cè)定殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物中阿霉素的含量，阿霉素-順烏頭酸中間體溶于二甲基亞砜，蒸餾水稀釋配成不同濃度的溶液，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。一定量殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物溶于蒸餾水中，測(cè)定吸光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算載體中阿霉素含量(重量百分比)為30%。(4)殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物的理化性質(zhì)采用芘熒光法測(cè)定的殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物de臨界膠束濃度。取芘12mg，精密稱定，置100ml容量瓶，加丙酮溶解并定容。移取上述芘溶液lml，置100ml容量瓶中稀釋并定容。移取稀釋后的芘溶液0.5ml分別置10ml玻璃試管中，5(TC揮去丙酮。分別加入不同濃度的殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物溶液5ml，控制芘終濃度為7Xl(T7mol/l，室溫水浴超聲30min。掃描芘的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜(EX-337nm，EM:I產(chǎn)374,13=384，狹縫2.5nm和10nm)，測(cè)定熒光強(qiáng)度，并計(jì)算臨界膠束濃度，為25pg/ml。另取殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物10mg，精密稱定，溶解于10ml蒸餾水，探頭超聲30次(400w,工作2s，間歇3s)，得到lmg/ml的聚合物溶液。微粒粒度與表面電位分析儀測(cè)定殼寡糖硬脂酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物膠團(tuán)的粒徑為120.5nm，及Zeta電位為31.2mV。1權(quán)利要求1.一種殼寡糖脂肪酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物，具有代表性的結(jié)構(gòu)通式為其中R為脂肪酸；x為殼寡糖中未被脂肪酸和阿霉素化學(xué)實(shí)施的氨基葡萄糖單元和乙酰化氨基葡萄糖單元數(shù)；n為脂肪酸的化學(xué)修飾比例；y與z之和與n的積表示阿霉素的化學(xué)修飾比例，其中y與z分別表示阿霉素-順烏頭酸中間體中兩個(gè)羧基的反應(yīng)比例，阿霉素-順烏頭酸中間體，含有兩個(gè)羧基，殼寡糖上的氨基可與其中任何一個(gè)羧基反應(yīng)；所述殼寡糖脂肪酸嫁接物中殼寡糖的分子量小于1～200kDa；脂肪酸的碳鏈長(zhǎng)度為C12-C22；殼寡糖的脫乙酰度為70％-100％；氨基取代度為1％～50％。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種殼寡糖脂肪酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物的制備方法，其特征在于通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)阿霉素堿制備稱取鹽酸阿霉素，溶于二甲基亞砜中，加入三乙胺，鹽酸阿霉素與三乙胺的摩爾比為1:2,攪拌過(guò)夜，將反應(yīng)液置透析袋中，蒸餾水透析，冷凍干燥，得到阿霉素堿；(2)阿霉素-順烏頭酸中間體制備稱取上述阿霉素堿50mg，溶于吡啶中，另稱取順烏頭酸酐，阿霉素與順烏頭酸酐的摩爾比為1:5，溶于二氧己烷中，緩慢滴加到阿霉素溶液中，低溫下攪拌過(guò)夜，用氯仿和5。/。NaHC03萃取，取水層，重復(fù)兩次，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至有沉淀析出，繼續(xù)攪拌，低溫離心分離，棄去上清液，加入少量蒸餾水，離心，棄去上清液，得到的沉淀產(chǎn)物分散于水中，冷凍干燥，得到阿霉素-順烏頭酸中間體；(3)目的物制備稱取殼寡糖脂肪酸嫁接物，溶于水中，探頭超聲30次,另稱取阿霉素-順烏頭酸中間體，加入二甲基亞砜溶液，使中間體濃度為lmg/ml，中間體溶液緩慢滴加到嫁接物水溶液中，加入過(guò)量碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，中間體與碳二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺摩爾比為1:10:10，室溫下攪拌過(guò)夜，將反應(yīng)液置透析袋中，二甲基亞砜水混合溶媒透析2天，蒸餾水繼續(xù)透析，冷凍干燥，得到寡糖脂肪酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種殼寡糖脂肪酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物在制備抗腫瘤和逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供殼寡糖脂肪酸嫁接物鍵合阿霉素前體藥物，將鹽酸阿霉素溶于二甲基亞砜，加三乙胺攪拌，產(chǎn)物溶于吡啶；另將順烏頭酸酐溶于二氧己烷，滴加到阿霉素溶液中，攪拌，萃取，離心，沉淀物分散于水中，冷凍干燥，得阿霉素-順烏頭酸中間體；將殼寡糖脂肪酸嫁接物溶于水，另取霉素-順烏頭酸中間體加入二甲基亞砜溶液，滴加到嫁接物水溶液中，攪拌，透析，冷凍干燥即得，其中殼寡糖分子量1～200kDa，脫乙酰度為70％-100％，脂肪酸的碳鏈長(zhǎng)度C12-C22，氨基取代度1％～50％。阿霉素與殼寡糖脂肪酸嫁接物化學(xué)鍵合后，具有顯著的抗腫瘤治療活性，并可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性，可在逆制備抗腫瘤和逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性藥物中應(yīng)用。文檔編號(hào)A61P35/00GK101564539SQ20091009897公開日2009年10月28日申請(qǐng)日期2009年5月25日優(yōu)先權(quán)日2009年5月25日發(fā)明者杜永忠,胡富強(qiáng),弘袁申請(qǐng)人:浙江大學(xué)