專利名稱：異戊烯基氧基取代的脫氫水飛薊賓醚及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及有機(jī)合成和醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及7-異戊烯基氧基取代的脫氫水飛薊賓醚衍生物的制備方法及其藥物用途，該化合物具有體外清除自由基的活性；顯著抑制自由基誘導(dǎo)的脂過氧化物生成的活性；強(qiáng)效的對(duì)抗雙氧水引起的大鼠腎上腺嗜鉻瘤PC12細(xì)胞損傷作用，即對(duì)模擬腦神經(jīng)細(xì)胞的PC12細(xì)胞有抗氧化損傷保護(hù)作用；說明其對(duì)保護(hù)腦細(xì)胞組織抗氧化和腦神經(jīng)抗氧化、防治老年性癡呆癥等神經(jīng)退行性疾病有積極作用。以上藥效學(xué)結(jié)果表明該脫氫水飛薊賓醚化合物可以預(yù)期用于制備防治神經(jīng)退行性疾病類藥物的用途。

背景技術(shù)：
自由基的衡穩(wěn)性動(dòng)態(tài)平衡是身體健康的保證。當(dāng)機(jī)體內(nèi)自由基生成速率遠(yuǎn)大于其防御與修復(fù)能力時(shí)，平衡就被打破。失控的自由基是一種十分有害的物質(zhì)，其可形成氧化脅迫(oxidative stress，又稱氧化應(yīng)激)能在幾分鐘內(nèi)便影響蛋白質(zhì)表達(dá)等調(diào)節(jié)機(jī)制，引發(fā)自由基性疾病，導(dǎo)致細(xì)胞死亡或不可逆的傷害。該類活性氧(reactive oxygenspecies，簡(jiǎn)稱ROS)可對(duì)細(xì)胞主要成分如細(xì)胞核、線粒體DNA、細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)造成損傷。除了引起衰老外，還導(dǎo)致神經(jīng)退行性發(fā)生和神經(jīng)元死亡。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元對(duì)自由基非常敏感，此類自由基和活性氧的產(chǎn)生一旦出現(xiàn)失衡，神經(jīng)元細(xì)胞很可能遭到持續(xù)損傷并造成神經(jīng)退行性疾病諸如老年性癡呆。
神經(jīng)退行性疾病是極為可怕的一系列毀滅性的疾病，其可以毀壞中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能，導(dǎo)致多種認(rèn)知缺陷和/或行動(dòng)缺陷。就目前的醫(yī)療技術(shù)而言，此類疾病是致殘率及致死率雙高的不可治愈性疾病。已構(gòu)成現(xiàn)代社會(huì)尤其是老齡化社會(huì)的一大健康隱患。老年性癡呆癥、帕金森氏癥(Parkinson’s Disease)、亨廷頓舞蹈病、肌萎縮性(脊椎)側(cè)索硬化都遭遇到大量的神經(jīng)元丟失。近年來，老年性癡呆癥(Alzheimer’s Disease，簡(jiǎn)稱AD，又稱早老性癡呆)在我國(guó)發(fā)病率逐年增高，給國(guó)民生活帶來極大的負(fù)面影響，給患者家庭和社會(huì)保障體系帶來了巨大的負(fù)擔(dān)。帕金森氏癥也稱震顫麻痹，患者缺少腦黑質(zhì)-紋狀體通路的神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺。腦黑質(zhì)線粒體復(fù)合物活性下降，使得ROS增多，導(dǎo)致腦中多不飽和脂肪酸和蛋白發(fā)生氧化，引發(fā)帕金森氏癥。國(guó)內(nèi)外政府和藥業(yè)均將越來越多的研究力量投入到這些神經(jīng)退行性疾病的成因和治療研究中，并取得了很好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
脂質(zhì)過氧化是自由基作用于多不飽和脂肪酸的產(chǎn)物，含量與自由基的生成正相關(guān)，由于機(jī)體有抗氧化的酶系及非酶系的保護(hù)作用，使自由基不斷產(chǎn)生又不斷被清除。隨著年齡的增長(zhǎng)，體內(nèi)的抗氧化劑不斷下降，清除自由基的能力逐漸減弱，脂質(zhì)過氧化作用則增強(qiáng)，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增多。脂質(zhì)過氧化是AD一個(gè)重要的發(fā)病機(jī)理[Busciglio等，Nature，1995，378776-779]。研究指出在與AD近似乃至一致的退行性疾病唐氏綜合癥(Down Syndromes)中，神經(jīng)元發(fā)生凋亡而死亡，這種凋亡便是由脂質(zhì)過氧化引起。使用過氧化氫酶和自由基清除劑可以阻止這種脂質(zhì)過氧化造成的神經(jīng)元凋亡。
此外，活性氧能造成細(xì)胞膜雙磷脂層的變化和損傷，有些雙磷脂層的破壞直接造成AD的病因[Nitsch，R.M.，Proc.Natl.Acad.SCi.U.S.A.1992，891671-1675]。Markesbery的研究顯示脂質(zhì)過氧化可以造成細(xì)胞膜雙磷脂層的降解從而導(dǎo)致AD患者發(fā)病[Markesbery，W.R.，F(xiàn)ree Radic.Bio.Med.，1997，23134-147]。因此，使用抗氧化劑和鐵離子螯合劑都可以減緩脂質(zhì)過氧化和AD的進(jìn)程?，F(xiàn)在常見的抗氧化制劑有維生素C、維生素E、銀杏制劑EGb761、褪黑激素、黃酮和胡蘿卜素類。由于市場(chǎng)的需要，更多的抗氧化劑諸如雌激素類也開始活躍。
衰老也是老年性癡呆的一大誘因，而衰老基本上都是由自由基攻擊細(xì)胞開始的。老年性癡呆患者的腦組織解剖檢查發(fā)現(xiàn)許多自由基攻擊的痕跡線粒體DNA和核DNA損傷、蛋白氧化損傷、脂質(zhì)過氧化、產(chǎn)生深度糖基化最終產(chǎn)物(AGEs)等。自由基攻擊β-淀粉樣蛋白使之聚合形成糾結(jié)及結(jié)塊，或者生成多肽自由基。抗氧化劑如自由基清除劑可以減緩自由基對(duì)β-淀粉樣蛋白的毒性損傷。
眾多的抗自由基天然產(chǎn)物除了前述的維生素C、維生素E、銀杏制劑EGb761、褪黑激素、黃酮和胡蘿卜素外，植物多酚如茶多酚和原花青素、白藜蘆醇等都是經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)的有效抗氧化劑。菊科植物水飛薊的提取物水飛薊素也是少數(shù)幾個(gè)在臨床上廣泛應(yīng)用的天然藥物之一。三十多年的臨床實(shí)驗(yàn)證明該藥具有確切的療效和低毒性(參閱Flora K.等，Am.J.Gastroenterol，1998，93，139-143；Saller R.等，Drugs，2001，61(14)，2035-2063)。水飛薊中水飛薊賓(Silybin)含量最多，活性也相對(duì)最高。故關(guān)于水飛薊賓之藥效學(xué)研究最為廣泛。國(guó)家食品與藥品監(jiān)督管理局制訂的國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)水飛薊素一欄中，要求含水飛薊素以水飛薊賓計(jì)算，不得少于68％。該天然藥物作用主要有以下幾點(diǎn)(一)抗自由基活性水飛薊素對(duì)于由四氯化碳CCl4，半乳糖胺、醇類和其他肝毒素造成的肝損害具有保護(hù)作用。1990年Lotteron等人報(bào)道了在小鼠肝微粒體內(nèi)，水飛薊素能減少由四氯化碳代謝引起的體外脂質(zhì)過氧化及由還原型輔酶單獨(dú)引起的過氧化作用這些都表明水飛薊素為鏈中斷抗氧化劑或?yàn)樽杂苫宄齽?二)保護(hù)肝細(xì)胞膜通過抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性，保護(hù)肝細(xì)胞膜。還能阻斷真菌毒素鬼筆毒環(huán)肽和α-鵝膏蕈堿等與肝細(xì)胞上特異受體的結(jié)合，抑制其對(duì)肝細(xì)胞的攻擊及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，中斷其肝腸循環(huán)，從而增強(qiáng)肝細(xì)胞膜對(duì)于多種損害因素的抵抗力。(三)促進(jìn)肝細(xì)胞的修復(fù)和再生水飛薊賓進(jìn)入細(xì)胞后可以與雌二醇受體結(jié)合，并使之激活，活化的受體可以增強(qiáng)肝細(xì)胞核內(nèi)RNA聚合酶1的活性，使RNA轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，促進(jìn)酶及蛋白質(zhì)的合成，并間接促進(jìn)DNA的合成，有利于肝細(xì)胞的修復(fù)和再生。(四)抗腫瘤作用各種活性氧能氧化鳥嘌呤形成8-羥基鳥嘌呤，造成DNA損傷，進(jìn)而引起腫瘤，水飛薊賓作為一個(gè)有效的抗自由基物質(zhì)也顯示了預(yù)防和治療腫瘤的作用。
水飛薊賓類化合物具有確切的療效，故而以此天然藥物為先導(dǎo)化合物(Lead compound)進(jìn)一步開發(fā)，尋找水飛薊賓類新的衍生物，使其能夠具有更高或者更新的藥理活性，以期獲取自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新藥，實(shí)屬必要。如我們前期報(bào)道的在水飛薊賓的B環(huán)上引入甲氧基就顯著提高了其清除超氧陰離子自由基的活性[楊雷香，趙昱等，“Synthesis and Antioxidant Properties Evaluation of Novel SilybinAnalogue”，Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry，2006，21(4)，399-404]。根據(jù)酚羥基是捕獲自由基的主要官能團(tuán)之事實(shí)，而引入異戊烯基醚基或更可能增加整個(gè)分子的疏水性，同時(shí)其親脂性得到加強(qiáng)，有利于提高其通過血腦屏障、在腦部脂質(zhì)體層直接發(fā)揮藥效的功力，為此我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)新的7位異戊烯基取代脫氫水飛薊賓醚。該化合物即將非親脂性的7位酚羥基用親脂性的異戊烯基醚取代基代替，又保留了該化合物分子中重要捕獲自由基活性作用的3位羥基和5位、20位酚羥基，以期該分子既能有效清除自由基，又能將其作用靶點(diǎn)更引向于親脂性的腦脂質(zhì)體，從而對(duì)老年性癡呆等腦神經(jīng)退行性疾病起到預(yù)防及治療的作用。
鑒于至今尚無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道引入該異戊烯基親脂性基團(tuán)后的脫氫水飛薊賓醚類是否能提高其抗氧化活性，為了證明此新型結(jié)構(gòu)的化合物抗神經(jīng)退行相關(guān)之藥效學(xué)活性，本發(fā)明還用了多種抗氧化損傷藥效學(xué)模型對(duì)我們?cè)O(shè)計(jì)合成出的化合物進(jìn)行了藥效學(xué)評(píng)價(jià)。首先，我們測(cè)試了該化合物體外清除二苯基苦基苯肼自由基(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)體外清除的活性試驗(yàn)；用以確定該化合物清除自由基的能力。
其次，我們還測(cè)試了H2O2誘發(fā)PC12細(xì)胞的抗氧化損傷能力。目前比較肯定的用于研究神經(jīng)病變性疾病(主要是膽堿能神經(jīng)系統(tǒng))的體外細(xì)胞模型主要有3種原代培養(yǎng)的海馬、皮層、基底前腦神經(jīng)細(xì)胞，大鼠腎上腺嗜鉻瘤PC12細(xì)胞和海馬HT22細(xì)胞株。PC12細(xì)胞在培養(yǎng)過程中以其易獲得性和細(xì)胞均一性而成為神經(jīng)科學(xué)離體研究中的重要工具細(xì)胞，并用于研究多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如AD、帕金森病等。雙氧水H2O2是一種強(qiáng)氧化劑，它能穿透細(xì)胞膜使細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)性氧自由基產(chǎn)生增加。我們通過測(cè)試經(jīng)H2O2處理后PC12細(xì)胞的死亡情況來評(píng)價(jià)新合成的抗氧化劑保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞抗氧化損傷的能力。
我們又研究了設(shè)計(jì)合成出的化合物對(duì)大鼠肝勻漿脂質(zhì)過氧化的抑制作用。采用非酶促之維生素C-Fe2+系統(tǒng)誘導(dǎo)大鼠肝勻漿產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)，MDA能與硫代巴比妥酸(TBA)反應(yīng)，產(chǎn)物在532nm處有最大吸收，通過MDA量的變化可以間接反映化合物對(duì)肝勻漿脂質(zhì)過氧化的抑制作用。
藥理學(xué)研究結(jié)果顯示合成出的7-異戊烯基氧基取代的脫氫水飛薊賓化合物有明確的捕獲自由基的活性，其對(duì)DPPH自由基的抑制率強(qiáng)于水飛薊賓；此外，該化合物還表現(xiàn)出強(qiáng)效抑制非酶系統(tǒng)(Vc-Fe2+)自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化物生成的活性，其活性大大強(qiáng)于水飛薊賓；其并且對(duì)模擬腦神經(jīng)細(xì)胞的PC12細(xì)胞有抗氧化損傷有保護(hù)作用，作用強(qiáng)度也遠(yuǎn)超過水飛薊賓的作用強(qiáng)度。說明設(shè)計(jì)合成的7-異戊烯基氧基取代的脫氫水飛薊賓醚類化合物對(duì)清除自由基、保護(hù)腦細(xì)胞組織抗氧化和腦神經(jīng)抗氧化、防治老年性癡呆癥有積極作用，從而可以預(yù)期用于制備該類抗氧化劑藥物的用途，也可以預(yù)期發(fā)展成為防治其他神經(jīng)退行性疾病如帕金森氏癥(PD)、亨廷頓舞蹈病、肌萎縮性(脊椎)側(cè)索硬化等的藥物或藥物組合物。由此完成了本發(fā)明。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有式(I)所示結(jié)構(gòu)的7-異戊烯基氧基取代的脫氫水飛薊賓醚化合物或其可藥用鹽
其中，10，11位同時(shí)為R構(gòu)型或同時(shí)為S構(gòu)型。
本發(fā)明還提供了一種制備式(I)化合物的方法，其特征是水飛薊賓在堿催化下與少量的異戊烯基鹵素反應(yīng)制備而得；反應(yīng)溫度為0℃至100℃，反應(yīng)時(shí)間為5分鐘至24小時(shí)。其中堿是無機(jī)堿或有機(jī)堿，異戊烯基鹵素是指異戊烯基溴；少量是指參與反應(yīng)的異戊烯基鹵素的摩爾數(shù)是參與同一反應(yīng)的水飛薊賓之摩爾數(shù)的20％-70％；水飛薊賓是指非對(duì)映體的水飛薊賓A或水飛薊賓B或它們的混合物。
本發(fā)明的另一目的是提供了式(I)所示結(jié)構(gòu)的7-異戊烯基氧基取代的脫氫水飛薊賓醚或其可藥用鹽在制備防治神經(jīng)退行性疾病藥物中的應(yīng)用；所述的神經(jīng)退行性疾病是指老年性癡呆癥(AD)、帕金森氏癥(PD)、亨廷頓舞蹈病、肌萎縮性(脊椎)側(cè)索硬化等病種。
本發(fā)明的又一目的是提供了一種用于防治神經(jīng)退行性疾病的藥物或藥物組合物，其含有治療有效量的作為活性成分的式(I)所示結(jié)構(gòu)的7-異戊烯基氧基取代的脫氫水飛薊賓醚化合物或其可藥用鹽和可藥用輔料。
本發(fā)明的再一目的是提供了式(I)化合物或其可藥用鹽用于制備防治肝腦脂質(zhì)過氧化有關(guān)的其他生理改變或疾病藥物的用途；尤其是用于防治自由基誘導(dǎo)之脂過氧化物生成引起的急/慢性肝損傷類疾病、炎癥，也包擴(kuò)由脂質(zhì)過氧化引起的自身免疫性疾病、放射治療后遺癥、腫瘤、心肌缺血、心肌肥厚、衰老、變態(tài)反應(yīng)、動(dòng)脈粥樣硬化癥藥物的用途。
本發(fā)明的又一目的是提供了一種用于防治自由基誘導(dǎo)之脂過氧化物生成引起的急/慢性肝損傷類疾病、炎癥，也包擴(kuò)由脂質(zhì)過氧化引起的自身免疫性疾病、放射治療后遺癥、腫瘤、心肌缺血、心肌肥厚、衰老、變態(tài)反應(yīng)、動(dòng)脈粥樣硬化癥的藥物或藥物組合物，其含有治療有效量的作為活性成分的式(I)所示之7-異戊烯基氧基取代的脫氫水飛薊賓醚化合物或其可藥用鹽和可藥用輔料。
本發(fā)明的有益之處在于提供了7-異戊烯基氧基取代的脫氫水飛薊賓醚衍生物，并用藥理實(shí)驗(yàn)揭示了該類化合物具有清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化、保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞減輕氧化損傷能力。該衍生物均在三種藥效學(xué)模型中均顯示出比水飛薊賓優(yōu)越的抗氧化活性，從而可預(yù)期發(fā)展成為新型抗氧化劑類藥物及防治包括老年性癡呆癥在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病藥物的制藥用途。具有潛在的巨大社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明中式(I)化合物由天然藥物為母體制備而得，方法簡(jiǎn)單、步驟短，污染小，適于節(jié)能減排大環(huán)境下的產(chǎn)業(yè)化。

具體實(shí)施例方式 為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面首先用實(shí)施例的形式說明化合物制備的過程，實(shí)施例給出了化合物的部分物理和化學(xué)及波譜學(xué)數(shù)據(jù)。必須說明，本發(fā)明的實(shí)施例是用于說明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的簡(jiǎn)單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。除非另有說明，本發(fā)明中的百分?jǐn)?shù)是重量百分?jǐn)?shù)。
實(shí)施例1化合物I即7-異戊烯基氧基取代的脫氧水飛薊賓醚的制備
在干燥的反應(yīng)瓶中，0.241克水飛薊賓溶于5毫升DMF中，加入0.276克碳酸鉀，攪拌10分鐘使溶解完全。緩慢滴加異戊烯基溴50毫克，攪拌5分鐘，再于75℃反應(yīng)1小時(shí)。靜置冷卻，加入20毫升蒸餾水，醋酸乙酯萃取3次(每次10毫升)，合并有機(jī)層，10毫升蒸餾水洗，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮。得淺黃色粗品，經(jīng)200～300目硅膠(7克)柱層析，石油醚∶醋酸乙酯∶醋酸＝5∶1∶0.1洗脫，得到淺黃色固體39.3毫克。收率14.3％。
化合物I2-[2，3-二氫-3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-2-羥甲基-1，4-苯并二氧六環(huán)-6-]-3，5-二羥基-7-異戊烯基氧基-4H-1-苯并吡喃-4-酮Rf(石油醚∶醋酸乙酯＝3∶1)0.34；核磁共振氫譜1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ1.76(寬單峰，3H，5′-CH3)，1.81(寬單峰，3H，4′-CH3)，3.60(多重峰，1H，H-23a)，3.75(多重峰，1H，H-23b)，3.93(單峰，3H，OCH3)，4.12(多重峰，1H，H-10)，4.57(寬雙峰，J＝6.4Hz，2H，H-1′)，5.01(雙峰，J＝8.4Hz，1H，H-11)，5.48(多重峰，1H，H-2′)，5.81(寬單峰，1H，OH)，6.37(寬單峰，1H，H-6)，6.45(寬單峰，1H，H-8)，6.73(寬單峰，1H，OH)，6.97(雙峰，J＝8.4Hz，2H，芳香環(huán)Ar-H-16，&H-22)，6.98(寬單峰，1H，H-18)，7.09(雙峰，J＝8.4Hz，1H，H-21)，7.82(雙峰，J＝8.0Hz，1H，H-15)，7.87(寬單峰，1H，H-13)，11.69(單峰，1H，5-OH)；電噴霧質(zhì)譜ESI-MS549(M+H)+。
本發(fā)明中的式(I)化合物具有多種重要的生物活性，本發(fā)明通過藥效學(xué)試驗(yàn)，證實(shí)式(I)化合物具有確切的體外抑制DPPH自由基功效、體外抑制自由基誘導(dǎo)之脂質(zhì)過氧化物生成的活性、保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞抗氧化損傷的作用。表明式(I)化合物可以預(yù)期用于制備防治神經(jīng)退行性疾病類藥物的用途，所述的神經(jīng)退行性疾病是指老年性癡呆癥(AD)、帕金森氏癥(PD)、亨廷頓舞蹈病、肌萎縮性(脊椎)側(cè)索硬化等病種；還可以防治肝、腦脂質(zhì)過氧化物生成引起的急/慢性肝損傷類疾病、肝炎、腦動(dòng)脈粥樣硬化癥藥物。
本發(fā)明的式(I)化合物或其可藥用鹽可以與藥學(xué)上常用的輔料或載體結(jié)合，制備得到具有清除自由基、抵御脂質(zhì)過氧化物引起之損害、保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞抗氧化損傷作用的抗氧化藥物或藥物組合物，可用于防治老年性癡呆癥(AD)、帕金森氏癥(PD)、亨廷頓舞蹈病、肌萎縮性(脊椎)側(cè)索硬化等神經(jīng)退行性疾病，還可用于治療急/慢性肝損傷類疾病、肝炎、腦動(dòng)脈粥樣硬化癥等疾病。上述各類藥物或藥物組合物可以采用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑等劑型。
本發(fā)明中所述劑型都可以根據(jù)現(xiàn)已公認(rèn)的藥劑學(xué)常識(shí)經(jīng)由常規(guī)制備而得，在這些公知知識(shí)和技術(shù)基礎(chǔ)上制備出的含有本發(fā)明權(quán)利要求化合物的藥物或藥物組合物之其他劑型都在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面分別用藥理相關(guān)實(shí)施例的形式列舉式(I)化合物對(duì)DPPH自由基之清除作用試驗(yàn)、雙氧水H2O2所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用試驗(yàn)、以及抑制自由基誘導(dǎo)之脂質(zhì)過氧化物生成的活性試驗(yàn)之結(jié)果，說明其在制藥領(lǐng)域中的用途以及用于制備相關(guān)抗氧化劑類藥物、防治神經(jīng)退行性疾病類藥物的根據(jù)。藥理相關(guān)實(shí)施例給出了化合物的部分活性數(shù)據(jù)。同樣必須說明，本發(fā)明列舉的這些實(shí)施例是用于說明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的簡(jiǎn)單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
實(shí)施例2化合物I體外清除二苯基苦基苯肼自由基(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)的活性試驗(yàn) 2.1試驗(yàn)原理DPPH是一種在體外可以穩(wěn)定存在的芳基自由基，廣泛用于評(píng)估化合物的抗氧化活性，化合物清除DPPH自由基能力反映了該化合物對(duì)具有芳基、穩(wěn)定或非酶依賴性質(zhì)的自由基的清除能力。DPPH易溶于甲醇，溶液呈深紫色，在517nm處有最大吸收，若該自由基被待測(cè)化合物捕獲，則在517nm處的吸光度就會(huì)下降，吸光度降低越多，其清除DPPH自由基的能力也越強(qiáng)。
2.2實(shí)驗(yàn)材料與樣品 2.2.1實(shí)驗(yàn)試劑 2.2.1.1吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate，PMS)、硝基四氮唑蘭(nitroblue tetrazolium，NBT)、菲咯嗪(ferrozine)購(gòu)自Sigma公司； 2.2.1.2水飛薊賓購(gòu)自遼寧盤錦天緣藥業(yè)有限公司，HPLC檢測(cè)純度98％； 2.2.1.3Tris堿，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司； 2.2.1.4NADH(還原型輔酶I)和3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)購(gòu)自Amresco公司； 2.2.1.5其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?，?gòu)自杭州華東醫(yī)藥試劑有限公司。
2.2.2儀器 2.2.2.1酶標(biāo)儀Synergy-HT型，BIO-TEK公司； 2.2.2.2立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器LDZX-40BI型，上海申安醫(yī)療器材廠； 2.2.2.3紫外分光光度計(jì)UV-1201型，北京瑞利分析儀器公司； 2.2.2.4超純水系統(tǒng)UPWS-I-60D型，杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司； 2.2.2.5除菌過濾器Sterifil500型，Millipore公司； 2.2.2.6氣浴恒溫振蕩器THZ-C，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠； 2.3實(shí)驗(yàn)方法 2.3.1DPPH(1.0毫摩爾/升)試劑配制稱取DPPH 4.0毫克溶于10毫升甲醇中，4℃儲(chǔ)存。
2.3.2化合物I清除DPPH自由基的檢測(cè)在250微升反應(yīng)體系中含有各種不同濃度的式(I)化合物25微升，DPPH(0.4毫克/毫升)的甲醇溶液40微升及甲醇溶液185微升，37℃水浴反應(yīng)30分鐘后，在517nm處測(cè)定吸光度。水飛薊賓作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。
2.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表一。
表一
2.5結(jié)論試驗(yàn)結(jié)果表明，7位異戊烯基氧基取代的脫氫水飛薊賓化合物I具有明確的DPPH自由基清除作用，且在同一濃度下，其清除能力高于水飛薊賓逾100％。說明該化合物屬于具有一定清除DPPH自由基的抗氧化物質(zhì)，可以有效保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞和組織免受自由基的攻擊。
實(shí)施例3式(I)化合物I對(duì)雙氧水H2O2所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用活性試驗(yàn) 3.1實(shí)驗(yàn)材料與樣品 3.1.1細(xì)胞大鼠腎上腺嗜鉻瘤PC12細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所。
3.1.2實(shí)驗(yàn)試劑 3.1.2.1雙氧水(hydrogen peroxide，H2O2)、硝基四氮唑蘭(nitrobluetetrazolium，NBT)、菲咯嗪(ferrozine)購(gòu)自Sigma公司； 3.1.2.2水飛薊賓購(gòu)自遼寧盤錦天緣藥業(yè)有限公司，HPLC檢測(cè)純度98％。
3.1.2.3Tris堿，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司； 3.1.2.4MTT購(gòu)自Amresco公司； 3.1.2.5小牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司； 3.1.2.6青霉素和鏈霉素由石家莊制藥集團(tuán)有限公司生產(chǎn)； 3.1.2.7其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自杭州華東醫(yī)藥試劑有限公司。
3.1.3實(shí)驗(yàn)儀器 3.1.3.1酶標(biāo)儀Synergy-HT型，BIO-TEK公司； 3.1.3.2立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器LDZX-40BI型，上海申安醫(yī)療器材廠； 3.1.3.3紫外分光光度計(jì)UV-1201型，北京瑞利分析儀器公司； 3.1.3.4超純水系統(tǒng)UPWS-I-60D型，杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司； 3.1.3.5除菌過濾器Sterifil500型，Millipore公司； 3.1.3.6氣浴恒溫振蕩器THZ-C，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠； 3.1.3.7二氧化碳(CO2)細(xì)胞培養(yǎng)箱MMM，德國(guó)公司； 3.1.3.8倒置顯微鏡XD-2型，重慶光電儀器有限公司。
3.2實(shí)驗(yàn)原理雙氧水H2O2是一種主要的活性自由基的前體，它可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的凋亡，PC12細(xì)胞(大鼠腎上嗜鉻細(xì)胞瘤)可模擬腦神經(jīng)細(xì)胞，因此常用它來作為研究藥物與神經(jīng)細(xì)胞之間關(guān)系的模型，用MTT測(cè)細(xì)胞的存活率，如果待測(cè)化合物有清除由H2O2引起的自由基，保護(hù)細(xì)胞抗氧化損傷的作用，則其細(xì)胞存活率就高，相應(yīng)之OD值也高，反之細(xì)胞存活率和OD值均低。本發(fā)明之藥理學(xué)試驗(yàn)采用對(duì)唐希燦所報(bào)道之方法(Xiaoqiu Xiao等，Neurosci Letter，1999，27573-76)加以改進(jìn)來測(cè)定化合物對(duì)PC12細(xì)胞的保護(hù)作用。
3.3細(xì)胞培養(yǎng)PC12細(xì)胞用含10％小牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37℃、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，常規(guī)方法傳代培養(yǎng)。
3.4實(shí)驗(yàn)方法 3.4.1細(xì)胞毒性的測(cè)定首先用改良的MTT法測(cè)定了待測(cè)化合物對(duì)PC12細(xì)胞增殖的作用。PC12細(xì)胞用胰酶-EDTA消化液消化，收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，用含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋至8000個(gè)/毫升的密度，然后接種于96孔細(xì)胞板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24小時(shí)后，分別將新配的待測(cè)的二甲亞砜溶液以濃度梯度加入到各孔中，使孔中化合物I的最終濃度分別為32、16、8微克/毫升。72小時(shí)后，加入10微升MTT(5毫克/毫升)的生理鹽水溶液，繼續(xù)在37℃，5％CO2潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3小時(shí)，棄去原液，每孔中加入150微升二甲亞砜，振蕩溶解生成的MTT晶體甲臜，用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)下比色，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率計(jì)算公式如下 ％細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率＝(OD溶劑對(duì)照-OD樣品)/OD溶劑對(duì)照×100％。
3.4.2化合物I對(duì)H2O2所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用的測(cè)定PC12細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含10％牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升鏈霉素。細(xì)胞以每孔8000個(gè)的密度加到96孔板中，在37℃，50％CO2潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36小時(shí)。用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化以及用MTT法測(cè)定細(xì)胞的存活率。細(xì)胞經(jīng)36小時(shí)的孵育后，分別將新配的化合物I的二甲亞砜溶液以濃度梯度加入到各孔中。作用2小時(shí)后加入新配的H2O2(終濃度為600微摩爾/升)作用3小時(shí)，顯微鏡觀察記錄，棄去原培養(yǎng)液，加入新的培養(yǎng)液100微升，然后加入MTT 10微升，3小時(shí)后，小心吸去培養(yǎng)液，加入150微升DMSO溶解甲臜，于570nm處讀數(shù)。采用水飛薊賓為陽(yáng)性對(duì)照藥物。
3.4.3試驗(yàn)結(jié)果見表二。
表二化合物I及對(duì)照品組對(duì)雙氧水損傷PC12細(xì)胞保護(hù)作用
3.5結(jié)論試驗(yàn)結(jié)果表明，化合物I具有強(qiáng)效的的對(duì)抗自由基引起的PC12細(xì)胞損傷作用，即對(duì)模擬腦神經(jīng)細(xì)胞的PC12細(xì)胞有抗氧化損傷保護(hù)作用。在高、中、低濃度時(shí)其對(duì)保護(hù)PC12細(xì)胞免受自由基損傷之能力比陽(yáng)性對(duì)照藥物水飛薊賓保護(hù)能力提高了100％以上。說明該7-異戊烯基氧基取代的脫氫水飛薊賓醚或其可藥用鹽屬于具有顯效保護(hù)模擬腦神經(jīng)細(xì)胞的PC12細(xì)胞作用的抗氧化物質(zhì)。
測(cè)定化合物對(duì)H2O2所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用可作為初步探討其保護(hù)中樞腦神經(jīng)細(xì)胞的作用機(jī)理之依據(jù)。故據(jù)該化合物表現(xiàn)出之對(duì)雙氧水損傷所致PC12細(xì)胞的保護(hù)作用，可預(yù)期該7-異戊烯基氧基取代的脫氫水飛薊賓醚化合物對(duì)神經(jīng)退行性疾病類藥物中的治療有十分積極的作用。
實(shí)施例4式(I)化合物抑制自由基誘導(dǎo)之脂過氧化物生成活性的試驗(yàn) 4.1實(shí)驗(yàn)原理脂質(zhì)過氧化是自由基作用于多不飽和脂肪酸(PUFA)的產(chǎn)物，含量與自由基的生成正相關(guān)，由于機(jī)體有抗氧化的酶系及非酶系的保護(hù)作用，使自由基不斷產(chǎn)生又不斷被清除。隨著年齡的增長(zhǎng)，體內(nèi)的抗氧化劑不斷下降，清除自由基的能力逐漸減弱，脂質(zhì)過氧化作用則增強(qiáng)，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增多。因此，測(cè)定樣品抗脂質(zhì)過氧化作用，是篩選抗氧化、抗衰老藥物的重要指標(biāo)之一。本研究用維生素C-Fe2+系統(tǒng)誘導(dǎo)大鼠肝勻漿產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)，MDA能與硫代巴比妥酸(TBA)反應(yīng)，產(chǎn)物在532nm處有最大吸收，通過MDA量的變化間接反映化合物對(duì)肝勻漿脂質(zhì)過氧化的抑制作用[楊雷香等，Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry，2009，24(2)，425-431]。
4.2實(shí)驗(yàn)材料與樣品 4.2.1試驗(yàn)動(dòng)物SD(sprague-dawley)大鼠購(gòu)自浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。合格證號(hào)SCXK(浙2007-0029)。
4.2.2實(shí)驗(yàn)試劑 4.2.2.1硫酸亞鐵FeSO4溶液國(guó)產(chǎn)FeSO4分析醇試劑，購(gòu)自杭州華東試劑公司，使用前按照要求自配； 4.2.2.2維生素C即Vc溶液國(guó)產(chǎn)Vc分析醇試劑，購(gòu)自杭州華東試劑公司，使用前按照要求自配； 4.2.2.3三氯醋酸溶液國(guó)產(chǎn)CCl3CO2H分析醇試劑，購(gòu)自杭州華東醫(yī)藥試劑有限公司，使用前按照要求自配； 4.2.2.4磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫代巴比妥酸及其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純(杭州華東醫(yī)藥試劑有限公司)。
4.2.2.5水飛薊賓購(gòu)自遼寧盤錦天緣藥業(yè)有限公司，HPLC檢測(cè)純度98％。
4.3實(shí)驗(yàn)儀器 4.3.1酶標(biāo)儀Synergy-HT型，BIO-TEK公司； 4.3.2立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器LDZX-40BI型，上海申安醫(yī)療器材廠； 4.3.3紫外分光光度計(jì)UV-1201型，北京瑞利分析儀器公司； 4.3.4超純水系統(tǒng)UPWS-I-60D型，杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司； 4.3.5恒溫水浴箱上海森信試驗(yàn)科學(xué)儀器公司； 4.3.6氣浴恒溫振蕩器THZ-C，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠； 4.3.7臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)TGL-16G，上海安亭儀器廠。
4.4實(shí)驗(yàn)方法 4.4.1肝勻漿的制備取SD實(shí)驗(yàn)大鼠5只斷頭處死，迅速取出肝臟，用超速離心法制備肝勻漿。
4.4.2樣品對(duì)鼠肝脂質(zhì)過氧化的抑制作用在含F(xiàn)eSO4(4微摩爾/升)與Vc(50微摩爾/升)的1毫升緩沖液中加入200微克/毫升肝勻漿，以誘導(dǎo)產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化，同時(shí)加入不同濃度的化合物I樣品，37℃孵育30分鐘后加入1毫升三氯醋酸(20％)中止反應(yīng)加入1.5毫升硫代巴比妥酸(0.76％)，100℃沸水浴處理20分鐘，離心去除蛋白沉淀，在532nm波長(zhǎng)下測(cè)定上清吸光度。脂質(zhì)過氧化以反應(yīng)中生成的丙二醛表示，實(shí)驗(yàn)以水飛薊賓作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。用緩沖液代替反應(yīng)液作為空白對(duì)照組，加入同樣體積DMSO的為溶劑對(duì)照組。樣品對(duì)大鼠肝勻漿脂質(zhì)過氧化抑制率的計(jì)算公式計(jì)算公式如下 抑制率(％)＝(OD樣品管-OD空白管)/(OD標(biāo)準(zhǔn)管-OD空白管)×100％。
4.5試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果見表三。
表三.化合物I對(duì)大鼠肝微粒體脂質(zhì)過氧化的抑制作用
4.6結(jié)論試驗(yàn)結(jié)果表明，化合物I屬于具有強(qiáng)效的保護(hù)細(xì)胞抗氧化物質(zhì)，其具有顯著的抑制自由基誘導(dǎo)之脂過氧化物生成能力，其半數(shù)抑制濃度IC50為23.3微摩爾/升，大大強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照藥物水飛薊賓，說明該7-異戊烯基氧基取代的脫氫水飛薊賓醚或其可藥用鹽具有保護(hù)細(xì)胞膜免受脂質(zhì)過氧化的作用，可以預(yù)期用于制備預(yù)防或治療腦組織氧化損傷或者急/慢性肝損傷類疾病的作用，值得進(jìn)一步優(yōu)化結(jié)構(gòu)，或與其他相關(guān)藥物聯(lián)合使用。
在上述說明書闡述本發(fā)明時(shí)，同時(shí)提供了實(shí)施例和藥理相關(guān)實(shí)施例的目的是舉例說明本發(fā)明的實(shí)際操作過程和本發(fā)明的意義。在進(jìn)入本發(fā)明權(quán)利要求和其等同物范圍內(nèi)時(shí)，本發(fā)明的實(shí)際應(yīng)用包括所有一般變化、配合，或改進(jìn)。
權(quán)利要求
1.具有式(I)所示結(jié)構(gòu)的7-異戊烯基氧基取代的脫氫水飛薊賓醚化合物或其可藥用鹽；
式(I)
式(I)化合物的名稱為2-[2，3-二氫-3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-2-羥甲基-1，4-苯并二氧六環(huán)-6-]-3，5-二羥基-7-異戊烯基氧基-4H-1-苯并吡喃-4-酮；其中，10，11位同時(shí)為R構(gòu)型或同時(shí)為S構(gòu)型。
2.一種式(I)化合物的制備方法，其特征是水飛薊賓在堿催化下與少量的異戊烯基鹵素反應(yīng)制備而得；反應(yīng)溫度為0℃至100℃，反應(yīng)時(shí)間為5分鐘至24小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的制備方法，其中堿是無機(jī)堿或有機(jī)堿；少量是指參與反應(yīng)的異戊烯基鹵素的摩爾數(shù)是參與同一反應(yīng)的水飛薊賓之摩爾數(shù)的20％-70％；異戊烯基鹵素是指異戊烯基溴；水飛薊賓是指非對(duì)映體的水飛薊賓A或水飛薊賓B或它們的混合物。
4.式(I)所示結(jié)構(gòu)的7-異戊烯基氧基取代的脫氫水飛薊賓醚或其可藥用鹽在制備防治神經(jīng)退行性疾病的藥物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于所述的神經(jīng)退行性疾病是指老年性癡呆癥、帕金森氏癥、亨廷頓舞蹈病或肌萎縮性脊椎側(cè)索硬化。
6.式(I)所示結(jié)構(gòu)的7-異戊烯基氧基取代的脫氫水飛薊賓醚或其可藥用鹽在制備抗氧化的藥物中的應(yīng)用。
7.一種用于抗氧化和/或防治神經(jīng)退行性疾病的藥物或藥物組合物，其含有治療有效量的作為活性成分的式(I)所示結(jié)構(gòu)的7-異戊烯基氧基取代的脫氫水飛薊賓醚化合物或其可藥用鹽和可藥用輔料。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物或藥物組合物，其特征在于所述的神經(jīng)退行性疾病是指老年性癡呆癥、帕金森氏癥、亨廷頓舞蹈病或肌萎縮性(脊椎)側(cè)索硬化。
全文摘要
本發(fā)明涉及異戊烯基氧基取代的脫氫水飛薊賓醚及其制備方法和用途，該化合物具有體外清除二苯基苦基苯肼自由基的活性；顯著抑制自由基誘導(dǎo)的脂過氧化物生成的活性；強(qiáng)效的保護(hù)雙氧水引起的大鼠腎上腺嗜鉻瘤PC12細(xì)胞損傷作用，即對(duì)模擬腦神經(jīng)細(xì)胞的PC12細(xì)胞有抗氧化損傷保護(hù)作用；說明其對(duì)保護(hù)腦細(xì)胞組織抗氧化和腦神經(jīng)抗氧化、防治老年性癡呆癥等神經(jīng)退行性疾病有積極作用。藥效學(xué)結(jié)果表明該7位取代脫氫水飛薊賓醚化合物可以預(yù)期用于制備防治神經(jīng)退行性疾病類藥物的用途。
文檔編號(hào)A61P21/00GK101723939SQ20091009940
公開日2010年6月9日 申請(qǐng)日期2009年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月11日
發(fā)明者趙昱, 楊雷香, 肖懷, 龔景旭, 巫秀美, 郝小江, 曾蘇, 何正春, 劉光明 申請(qǐng)人:大理學(xué)院