專利名稱：miR-155在制備治療胃炎藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
木發(fā)明涉及非編碼小RNA基因miR-155的應(yīng)用，特別涉及miR-155在制備 治療胃炎藥物中的應(yīng)用，尤其是miR-155在制備治療由幽門螺桿菌感染引起的 胃炎藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
微小RNA (microRNAs， miRNAs)是一類長度約為20 25 nt的內(nèi)源性非編 碼RNA分子，普遍存在于真核生物中，它不編碼蛋白質(zhì)或多肽，而是與靶基因 的信使RNA(mRNAs )3'非翻譯區(qū)互補結(jié)合，誘導(dǎo)靶mRNA降解或抑制靶mRNA 的翻譯，從而實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控作用。許多證據(jù)表明，miRNAs在細(xì)胞增殖、 發(fā)育、分化等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，且與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。
近年來，miRNAs與免疫系統(tǒng)的關(guān)系越來越受重視，miRNAs已被證實參 與了淋巴細(xì)胞的發(fā)育與分化、抗體的產(chǎn)生及固有性免疫應(yīng)答調(diào)控等過程。在某 些病毒感染過程中，病毒可以通過自身合成的或利用宿主的特定miRNAs ，調(diào) 控病毒或宿主的基因表達(dá)，利于病毒的生存、傳播，或者調(diào)控機體的抗病毒免 疫反應(yīng)。此外，在一些炎癥性疾病中，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和銀屑病，miRNAs也 參與了疾病的發(fā)生與發(fā)展。因此，miRNAs在病原體感染的診斷及相關(guān)炎癥疾
病中的治療中可能具有極為廣闊的應(yīng)用前景。
幽門螺桿菌(/^"co^"er/^/orf， Hp)是定植于人胃粘膜的重要致病菌，世界 人群Hp感染率超過50%。 Hp與慢性胃炎、消化性潰瘍、胃粘膜相關(guān)淋巴組織 淋巴瘤(MALT)和胃癌等多種疾病相關(guān)，對人類健康構(gòu)成嚴(yán)重危害，世界衛(wèi)生 組織(WHO)將其列為一類致癌因子。人體對于Hp感染的免疫反應(yīng)十分復(fù)雜，雖 然機體對于Hp感染能夠引發(fā)強烈的細(xì)胞與體液免疫，但是并不能夠有效地清除細(xì)菌，感染狀態(tài)常常持續(xù)存在。因此，Hp感染常常引起慢性胃炎，這也是Hp的 重要致病因素之一。臨床治療Hp感染相關(guān)胃炎首先要采用抗生素三聯(lián)或四聯(lián)療
法，在一定程度上能清除Hp，但療效不穩(wěn)定，停藥后易復(fù)發(fā)、副反應(yīng)嚴(yán)重，并
且耐藥問題日趨嚴(yán)峻。
經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的國內(nèi)外文獻(xiàn)檢索，至今未見有關(guān)miRNAs與Hp感染相關(guān) 炎癥的i會斷和治療的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了小分子RNA基因miR-155在制備胃炎藥物屮的應(yīng)用，該miR-丄55 能夠有效抑制幽門螺桿菌感染相關(guān)的炎癥反應(yīng)。本發(fā)明所述的miR-155在幽門螺 桿菌感染的胃上皮細(xì)胞株和人胃粘膜組織中高表達(dá)，且分別給胃上皮細(xì)胞GES-1 轉(zhuǎn)染miR-155模擬體或miR-155抑制劑后，miR-155模擬體能夠顯著減少炎癥 因子白細(xì)胞介素8、生長相關(guān)癌基因(x的蛋白分泌水平，表明miR-155能夠有效 抑制幽門螺桿菌感染相關(guān)的炎癥反應(yīng)。
本發(fā)明所述的應(yīng)用為治療胃炎的藥物；該治療胃炎的藥物為治療由幽門螺 桿菌感染引起的胃炎的藥物。
本發(fā)明提供的miR-155由以下核廿酸組成 5 '國UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU-3'。
本發(fā)明利用miRNAs微陣列芯片對幽門螺桿菌感染的胃上皮細(xì)胞株GES-1 及未感染的GES-1細(xì)胞的miRNAs的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，Hp感 染促進(jìn)/GES-l細(xì)胞中miR-155的表達(dá)，上調(diào)達(dá)2.81倍。進(jìn)一步通過實時定量 PCR (real-time PCR)和Northem雜交(Northern blot) 技術(shù)對miR-155的表達(dá)進(jìn) 行分析，結(jié)果與miRNAs微陣列芯片相吻合，Hp感染能夠誘導(dǎo)miR-155的表達(dá) 上調(diào)。
其次，本發(fā)明選取了20例Hp陽性的慢性胃炎患者與10例Hp陰性的正常對 照，禾!J用real-timePCR技術(shù)對患者胃粘膜組織的miR-155的水平進(jìn)行檢測，結(jié) 果表明，在Hp感染的慢性胃炎病人的胃粘膜組織中，miR-155的表達(dá)量也要顯著 高于Hp陰性的正常胃粘膜組織，這對于Hp感染的慢性胃炎的臨床診斷和預(yù)后判斷具有重要的參考意義。
同時，本發(fā)明中分別給胃上皮細(xì)胞GES-1轉(zhuǎn)染miR-155模擬體(miR-155 mimics)或miR-155抑制劑(miR-155 inhibitors )后，miR-155模擬體能夠顯 著減少炎癥因子白細(xì)胞介素8 (interleukin-8 ， IL-8 )、生長相關(guān)癌基因a (growth-related oncogene-a,GRO-a)的蛋白分泌水平，這表明miR-155能夠有
效仰制幽門螺桿菌感染相關(guān)的炎癥反應(yīng)，因此，miR-155在制備治療胃炎藥物 方面，特別是在制備治療由幽門螺桿菌感染引起的胃炎藥物方面有廣泛前景。
為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點能更明顯易懂，下文特舉較佳 實施例，并配合附圖，作詳細(xì)說明如下。


圖l: miRNAs芯片檢測Hp感染胃上皮細(xì)胞miRNAs表達(dá)譜的變化；
圖2A-2B: Hp感染后胃上皮細(xì)胞miR-155的表達(dá)分析；其屮，圖2A， Real-time PCR技術(shù)檢測Hp感染后胃上皮細(xì)胞miR-155的表達(dá)；圖2B， Northern blot鑒定 Hp感染誘導(dǎo)miR-155的高表達(dá)；
圖3: Hp感染胃炎患者和正常對照患者胃粘膜組織miR-155的表達(dá)分析；
圖4: miR-155模擬體抑制Hp感染炎癥因子IL-8和GRO-a的分泌。
具體實施例方式
實施例l: Hp感染胃上皮細(xì)胞模型的建立
Hp 26695標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng)至對數(shù)生長期，5000xg離心收集細(xì)菌，用無抗生 素RPMI 1640培養(yǎng)基制備Hp細(xì)菌懸液，通過測定A600吸光度值調(diào)整細(xì)菌濃度 (lA600=lxl08cfu/ml)。以含10。/。小牛血清的RPMI 1640(青霉素100U/ml ;鏈霉 素100U/ml)為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)人胃上皮細(xì)胞株GES-1，貼壁生長至80%時，棄 掉培養(yǎng)基。按照感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)(細(xì)菌數(shù)細(xì)胞數(shù))為100: 1加入Hp， 37°C、 5%C02的條件下共培養(yǎng)24小時。
實施例2: miRNAs芯片檢測Hp感染胃上皮細(xì)胞miRNAs表達(dá)譜的變化Trizol法抽提細(xì)胞總RNA， lx107細(xì)胞加入1 ml Trizol,用槍頭反復(fù)劇烈吹 打，漩渦器上充分振蕩使細(xì)胞完全裂解，室溫靜置5 min;按0.2 ml氯仿/1 ml Trizol的比例加入氯仿，充分漩渦，室溫靜置10min; 4°C， 12000xg離心15 min， 取上層無色液體丁新的1.5 ml離心管中；按0.5 ml異丙醇/l ml Trizol的比例加 入異丙醇，充分混合，室溫放置5-10 min，以形成脂A沉淀；4°C， 12000xg 離心10 min，棄上清；加至少1 ml 75%乙醇/1 ml Trizol，懸浮RNA沉淀；4°C ， 7500xg離心5 min，棄上清；空氣干燥5-10 min后，用30卩d無RNA酶的水溶 解。紫外吸收測定法和甲醛變性電泳檢測總RNA的純度與完整性。
胃上皮細(xì)胞miRNAs表達(dá)譜的檢測采用博奧公司的miRNAs V3.0芯片，共 含有924條探針，包括人、大鼠和小鼠的成熟miRNAs的互補序列，同時還包 括122條預(yù)測的人miRNAs探針。把這些探針用芯片點樣儀SmartArray,博奧公 司)點制在一張75x25 mm、經(jīng)過化學(xué)修飾的載玻片上。點制在芯片上的樣品還包 括人的U6-tRNA作為內(nèi)標(biāo)；8個人工制備的30個堿基長度RNA對應(yīng)的探針作 為芯片的外標(biāo)(Zip5、 Zipl3、 Zipl5、 Zip21、 Zip23、 Zip25、 Y2、 Y3) , Hex作 為點樣陽性對照，50%DMSO作為雜交陰性對照。
釆用miRCURY ARRAY標(biāo)記試劑盒，用標(biāo)記酶將CY3或CY5熒光基團(tuán)標(biāo) 記細(xì)胞總RNA，制備熒光標(biāo)記探針。將標(biāo)記的RNA溶于WW雜交液中(15%甲 酰胺；0.2。/。SDS;3xSSC;50xDenhardt's)，于42。C雜交過夜。雜交結(jié)束后，先在42 "含0.2%803， 2xSSC的液體中洗滌4分鐘，而后在0.2xSSC液體中室溫洗滌 4分鐘。玻片甩干后即可用于掃描。
芯片用LuxScanlOK7A雙通道激光掃描儀進(jìn)行掃描，采用LuxScan3.0圖像 分析軟件(博奧公司)對芯片圖像進(jìn)行分析，把圖像信號轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號。將 負(fù)值信號校正到IO，如果基因在所有樣品中的信號值都小于300，則判斷為弱點， 刪除弱點和壞點。數(shù)據(jù)預(yù)處理以后，再根據(jù)各張芯片的全局均值(global mean) 進(jìn)行片間校止，使得各張的全局均值相同。最后GenePixPro5.0和 BIOCONDUCTOR軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一化處理，SAM 2.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析， 篩選差異表達(dá)基因。為避免假陽性和假陰性，本次實驗共檢測5對感染前后的樣 nn 。5組樣品經(jīng)過上述miRNAs芯片分析表明，Hp感染引起胃上皮細(xì)胞miR-155 的高表達(dá)，上調(diào)達(dá)2.8倍(圖l)。
實施例3: Real-time PCR技術(shù)檢測miRNAs的表達(dá)
本實施例采月§ TaqMan miRNA Assay試劑盒(Applied Biosystems)進(jìn)行 miRNAs的Real-time PCR檢測。
首先按照實施例l中所述的Trizol法提取細(xì)胞總RNA，分別取上述總RNA各 10ng為模板，然后利用試劑盒自帶的miRNAs特異引物合成cDNA，反應(yīng)體系如 下:dNTPs (100 mM) 0.15 nl; MultiScribe逆轉(zhuǎn)錄酶1 10xRT緩沖液1.5 RNase抑制劑(20 U l) 0.19 (il; RT引物3 (il;總RNA 5 pi; DEPC H20 4.16 |il。 反應(yīng)條件16°C 30分鐘，42°C 30分鐘，85°C 5分鐘反應(yīng)，4。C保存。
再以cDNA為模板，利用試劑盒自帶的miRNAs的特異引物和反向引物進(jìn)行 TaqMan探針法Real-time PCR。體系如下2xPCRmix 10 pi; cDNA2(il; Probe 0.4 pi; DEPC H20 7.6 pl。反應(yīng)條件95。C反應(yīng)2分鐘，95°C 15秒，60°C 30秒 反應(yīng)40個循環(huán)。以U6小RNA為內(nèi)參對照，采用2—AAeT相對定量法處理數(shù)據(jù)。
Real-time PCR結(jié)果表明，Hp感染引起胃上皮細(xì)胞miR-155的高表達(dá)，上調(diào) 達(dá)3.0倍，與miRNAs芯片結(jié)果相吻合(圖2A)。
實施例4: Northern blot鑒定miR-155的表達(dá)
采用mirVanaTM miRNA提取分離試劑盒(Ambion)，收集細(xì)胞中小于200 nt 的miRNA。取5嗎左右的miRNA， 15%尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳1小時。
切下要檢測的凝膠部分，放入0.5xTBE漂洗；將HybondN+membranes切成 稍人于凝膠大小，在DEPC水中短暫浸潤10 15秒，然后在0.5xTBE的轉(zhuǎn)印液 中平衡10-15分鐘；將5-6張濾紙同樣用轉(zhuǎn)印液浸泡后，按照濾紙一凝膠一纖維 膜一濾紙從上至下的順序依次組好，放置于半干轉(zhuǎn)移裝置，玻璃棒各層排空氣 泡，膠面向陰極，膜面向陽極，裝好電源裝置；保持20V電壓，電轉(zhuǎn)移30-35分 鐘；
轉(zhuǎn)移完成后，移去凝膠，取出膜并標(biāo)記好凝膠方向，放入紫外交聯(lián)儀下交 聯(lián)30秒(120 mJ/cm2); 8(TC烤膜30分鐘。
7合成miR-155及內(nèi)參U6互補的寡核苷酸探針，序列如下 miR-155: 5'-ACCCCTATCACGATTAGCATTAA陽3'; U6: 5'-ATATGGAACGCTTCACGAATT-3'
利用T4多聚核苷酸激酶和[Y-^P]ATP對探針進(jìn)行標(biāo)記。按照每cm2膜lml 的量添加預(yù)雜交液，42"C預(yù)雜交1小時；棄去預(yù)雜交液，重新添加含標(biāo)記探針 的雜交液，42。C雜交過夜；倒掉雜交液，用2xSSC/0.1。/。SDS和0.5xSSC/0.1。/。SDS 漂洗膜30分鐘x2次；置暗盒中-70。C放射自顯影24-48小時。
通過Northern blot分析，結(jié)果表明Hp感染后胃上皮細(xì)胞miR-155的表達(dá)明 顯上調(diào)(圖2B)。
實施例5: H。感染胃炎患者胃粘膜組織miR-155的表達(dá)分析
為了確定Hp感染患者的胃粘膜組織miR-155表達(dá)是否上調(diào)，選取了20例 Hp陽性的慢性胃炎患者與IO例Hp陰性的正常對照。Trizo勝組織總RNA后， 按照實施例3所述的方法，檢測兩組患者胃粘膜組織miR-155的表達(dá)情況，結(jié) 果農(nóng)明，在Hp感染的慢性胃炎病人的胃粘膜組織屮，miR-155的表達(dá)量也要顯 著高于Hp陰性的正常胃粘膜組織(3.9倍，尸O.05)(圖3)。
實施例6: miR-155模擬體抑制Hp感染炎癥因子IL-8和GRO-a的分泌
miR-155模擬體或miR-155抑制劑由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，序列
如下
miR-155模擬體5'-UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU國3'
5'-CCCUAUCACGAUUAGCAUUAAUU-3' miR-155抑制劑5'-ACCCCUAUCACGAUUAGCAUUAA-3'
將miR-155模擬體或miR-155抑制劑轉(zhuǎn)染至GES-1細(xì)胞采用的是美國 Promega公司的Lipofectamine TM 2000試劑，轉(zhuǎn)染前24 h接種0.5-2 x 105細(xì)胞在 500 jil培養(yǎng)基中(24-wdl)，當(dāng)生長至90-95%密度時開始轉(zhuǎn)染。稀釋適當(dāng)體積的 miR-155模擬體或抑制劑在50 |il Opti-MEM I Reduced Serum Medium培養(yǎng) 基中，輕柔混和，使其終濃度為50nM。使用前先混合LipofectamineTM2000，然 后用50 |il Opti-MEM I Reduced Serum Medium培養(yǎng)基稀釋適當(dāng)體積的
8LipOfeCtamineTM2000，輕柔混合，室溫放置5分鐘。將稀釋后的小分子RNA和 轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行混合，室溫孵育20分鐘。將100!al小分子RNA-轉(zhuǎn)染試劑混合物加 至含細(xì)胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔，輕柔的來回?fù)u動培養(yǎng)板。37。C孵育細(xì)胞18-48小時， 4-6小時后可以更換含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基。
小分子RNA轉(zhuǎn)染GES-1 24小吋后，按照實施例1所述的方法用Hp 26695 感染細(xì)胞12h后，收集上清，ELISA檢測炎癥因子IL-8、 GRO-a的表達(dá)水平， 貝休歩驟參照美國R&D公司的DuoSetELISA Development System試劑盒，結(jié) 果表明，miR-155模擬體能夠顯著減少炎癥因子IL-8、 GRO-a的蛋白分泌水平 CPO.05)(圖4)。
雖然本發(fā)明已以較佳實施例披露如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何所 屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明之精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可作些許之更動 與改進(jìn)，因此本發(fā)明之保護(hù)范圍當(dāng)視權(quán)利要求所界定者為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.miR-155在制備治療胃炎藥物中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述治療胃炎的藥物為治療由幽門螺桿菌感染引起的胃炎的藥物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述miR-155由以下核苷酸組成5 '畫UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU-3'。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種非編碼小RNA基因miR-155在制備治療胃炎藥物中的應(yīng)用，所述胃炎可以是由幽門螺桿菌感染引起。本發(fā)明所述的miR-155在幽門螺桿菌感染的胃上皮細(xì)胞株和人胃粘膜組織中高表達(dá)，且分別給胃上皮細(xì)胞GES-1轉(zhuǎn)染miR-155模擬體或miR-155抑制劑后，miR-155模擬體能夠顯著減少炎癥因子白細(xì)胞介素8、生長相關(guān)癌基因α的蛋白分泌水平，表明miR-155能夠有效抑制幽門螺桿菌感染相關(guān)的炎癥反應(yīng)。
文檔編號A61P1/00GK101670118SQ20091010476
公開日2010年3月17日 申請日期2009年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月3日
發(fā)明者真 劉, 彬 唐, 朱恩東, 娜 李, 毛旭虎, 斌 肖, 鄒全明, 剛 郭, 黎伯勝 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)