專利名稱：一種蒲葵子的抗腫瘤有效組分的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗腫瘤的中藥有效組分，具體而言是涉及一種蒲葵子抗腫瘤有效
組分的制備方法，該有效組分主要含有小麥黃素、芹菜素兩種化合物。
背景技術(shù)：
腫瘤是威脅人類健康和生命的嚴(yán)重疾病之一，每年死于腫瘤的患者居各類死亡原 因的第二位，僅次于心血管疾病，而且腫瘤的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，給個(gè)人、家庭和社會(huì)帶來 了巨大的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。據(jù)WHO報(bào)導(dǎo)目前歐美每年診斷出的癌癥新患者達(dá)250萬，我國(guó) 每年死于癌癥的患者超過80萬，專家預(yù)測(cè)世界抗癌藥物的市場(chǎng)年遞增13%。因此，研發(fā)新 型抗腫瘤藥物具有非常重要的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。長(zhǎng)期以來，國(guó)際社會(huì)花費(fèi)巨資用于研 究治療癌癥的新藥。然而由于化療藥物固有的毒副作用，使其在臨床應(yīng)用受到諸多限制，尋 找高效低毒的抗癌藥物以及抗癌輔助藥物是當(dāng)前腫瘤研究的重要內(nèi)容。而傳統(tǒng)中草藥在這 方面具有顯著的優(yōu)勢(shì)，使得各國(guó)學(xué)者把注意力逐漸轉(zhuǎn)向了中草藥領(lǐng)域。歐共體對(duì)草藥進(jìn)行 了統(tǒng)一立法，加拿大和澳大利亞等國(guó)草藥地位已經(jīng)合法化，美國(guó)政府也起草了植物藥管理 辦法，這些為中藥作為治療藥進(jìn)入國(guó)際醫(yī)藥市場(chǎng)提供了良好的國(guó)際環(huán)境。我國(guó)藥用生物資 源十分豐富，其生理活性物質(zhì)是研究和發(fā)現(xiàn)新藥的先導(dǎo)化合物，是開發(fā)新藥的天然寶庫(kù)。
蒲葵子，為植物棕櫚科蒲葵Livistona chinensis R. Br.(別名扇葉葵子、葵扇
木子、蒲葵子)的種子。蒲葵為棕櫚科葵屬常綠喬木，一種野生或人工栽培的常綠喬木。它 主產(chǎn)于福建、臺(tái)灣、廣東等地。秋冬果實(shí)成熟時(shí)采收、曬干，生用?！稁X南采藥錄》、《廣州植 物志》、《廣西中獸醫(yī)藥植》、《陸川本草》等均有收載，其性味平、淡，具有敗毒抗癌、消瘀止血 之功效。研究表明已知的化學(xué)成分山萘酚-4' _甲醚、牡荊素、P-谷甾醇、豆甾醇、正 二十六碳醇(劉志平等，廣西植物，2007，27(1) :140-142)。薯蕷皂苷元、P-胡蘿卜苷、小 麥黃素、芹菜素(劉志平等，中草藥，2007，38(2) :178-180)。陳屏等人首次分離得到以下 五種化合物表緬茄兒茶精、表兒茶素、正三十一烷醇、去氫紫堇堿(陳屏等，中草藥，2007， 38(5) :665-667)。 蒲葵子含藥血清對(duì)肉瘤細(xì)胞(S180)、肝癌細(xì)胞(H22)有明顯的抑制作用(曾春暉 等，廣西中醫(yī)藥，2007，30(1) :58-59)。蒲葵子乙醇提取物對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株(Hela)有顯著 的抑制作用，且具有明顯的計(jì)量依賴關(guān)系(秦盛瑩等，西北藥學(xué)雜志，2007， 22(1) :16-18)。 蒲葵子乙醇提取物進(jìn)行化學(xué)成分GC-MS分析，主要成分為脂肪酸、脂肪酸酯、植物甾醇及長(zhǎng) 鏈烷烴等，且對(duì)宮頸癌細(xì)胞(Hela)、人胃癌細(xì)胞(SGC7901)、人肝癌細(xì)胞(Bel7402)均有一 定的抑制作用(朱岳麟等，化學(xué)與生物工程，2007，24(10) :35-37)。蒲葵子醇提物對(duì)蛋白激 酶C的抑制率可達(dá)到66.6X，降低藥物濃度抑制作用減弱(黃才等，中草藥，1995，26(8): 415-418)。國(guó)內(nèi)也有利用蒲葵子經(jīng)破細(xì)胞壁后提取的原粉制備抗癌劑的報(bào)道(丁慶等，CN 97 100 103.0)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種蒲葵子具有抗腫瘤作用的有效組分。 本發(fā)明的目的在于提供一種蒲葵子具有抗腫瘤作用的有效組分的制備方法。 本發(fā)明以如下的技術(shù)方案予以實(shí)施 將自然晾干的蒲葵子粉碎，加溶媒加熱提取得提取液，將提取液濃縮至干，得蒲葵 子粗提取物。粗提物依次分別用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取。乙酸乙酯萃取 液減壓濃縮至干，經(jīng)過聚酰胺層析柱，用水和乙醇洗脫，得到洗脫液，將洗脫液干燥后得樣 品；再經(jīng)過硅膠柱層析，用氯仿和甲醇洗脫，得到有效組分。 (1)將自然晾干的蒲葵子粉碎后，加入1 3倍60_95%的乙醇，60 IO(TC加熱 回流提取，至少提取一次，每次提取時(shí)間為1 4小時(shí)，得提取液，過濾分離得固相(藥渣) 和液相(乙醇提取液)； (2)液相(乙醇提取液)蒸餾回收乙醇，得到蒲葵子粗提物深紅色的浸膏A ;
(3)浸膏A用適量的水混懸，然后依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃 取，減壓回收石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇，得到石油醚浸膏B、二氯甲烷浸膏C、乙 酸乙酯浸膏D和正丁醇浸膏E。 (4)乙酸乙酯浸膏D用聚酰胺層析柱，用水_乙醇(依次為純水、30%、70%乙
醇)作為流動(dòng)相，分別收集合并各種洗脫液，洗脫液濃縮后得樣品；再經(jīng)過硅膠柱層析，用
氯仿甲醇(5 13 : 1)洗脫，濃縮后得到有效組分。 本發(fā)明的蒲葵子的有效組分可在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。 本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于 1.找到了一種蒲葵子具有抗腫瘤作用的有效組分，實(shí)驗(yàn)證明，能夠有效的抑制人 腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，如肝癌細(xì)胞、白血病、宮頸癌、鼻咽癌、乳腺癌細(xì)胞。因此，在制備抗腫瘤藥 物具有重要的意義。 2.找到了一種蒲葵子具有抗腫瘤作用的有效組分的制備方法，避免了繁瑣的分離 出單體。該方法簡(jiǎn)單、成本低廉、省時(shí)，且有益于標(biāo)準(zhǔn)化，在生產(chǎn)中更易于藥物的質(zhì)量控制。


具體實(shí)施例方式
下面將結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容和有益效果，該實(shí)施例僅用
于說明本發(fā)明而非對(duì)本發(fā)明的限制。 實(shí)施例一 將自然晾干的蒲葵子粉碎后，加入2倍80%的乙醇，60 IO(TC加熱回流提取，提 取3次，每次提取時(shí)間為2小時(shí)，得提取液，過濾分離得固相(藥渣)和液相(乙醇提取液)； 液相(乙醇提取液)蒸餾回收乙醇，得到蒲葵子粗提物深紅色的浸膏A;浸膏A用適量的水 混懸，然后依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，回收石油醚、二氯甲烷、乙酸 乙酯和正丁醇，得到石油醚浸膏B、二氯甲烷浸膏C、乙酸乙酯浸膏D和正丁醇浸膏E。
乙酸乙酯浸膏D 20.5g用水稀釋后，上聚酰胺層析柱，用水-乙醇(依次為純水、 30%、70%乙醇)作為流動(dòng)相，分別收集合并各種洗脫液。洗脫液濃縮后得樣品5.0g;樣品再經(jīng)過硅膠柱層析，用氯仿甲醇(5 13 : 1)洗脫，濃縮后得到有效組分500mg。
實(shí)施例二 將自然晾干的蒲葵子粉碎后，加入3倍70%的乙醇，60 IO(TC加熱回流提取，提 取3次，每次提取時(shí)間為2小時(shí)，得提取液，過濾分離得固相(藥渣)和液相(乙醇提取液)； 液相(乙醇提取液)蒸餾回收乙醇，得到蒲葵子粗提物深紅色的浸膏A;浸膏A用適量的水 混懸，然后依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，回收石油醚、二氯甲烷、乙酸 乙酯和正丁醇，得到石油醚浸膏B、二氯甲烷浸膏C、乙酸乙酯浸膏D和正丁醇浸膏E。
乙酸乙酯浸膏D 22.3g用水稀釋后，上聚酰胺層析柱，用水-乙醇(依次為純水、 30%、70%乙醇)作為流動(dòng)相，分別收集合并各種洗脫液。洗脫液濃縮后得樣品6. lg ;樣品 再經(jīng)過硅膠柱層析，用氯仿甲醇(5 10 : 1)洗脫，濃縮后得到有效組分615mg。
實(shí)施例三 將自然晾干的蒲葵子粉碎后，加入3倍75%的乙醇，60 IO(TC加熱回流提取，提 取2次，每次提取時(shí)間為3小時(shí)，得提取液，過濾分離得固相(藥渣)和液相(乙醇提取液)； 液相(乙醇提取液)蒸餾回收乙醇，得到蒲葵子粗提物深紅色的浸膏A;浸膏A用適量的水 混懸，然后依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，回收石油醚、二氯甲烷、乙酸 乙酯和正丁醇，得到石油醚浸膏B、二氯甲烷浸膏C、乙酸乙酯浸膏D和正丁醇浸膏E。
乙酸乙酯浸膏D 24.2g用水稀釋后，上聚酰胺層析柱，用水-乙醇(依次為純水、 30%、70%乙醇)作為流動(dòng)相，分別收集合并各種洗脫液。洗脫液濃縮后得樣品5.8g;樣品 再經(jīng)過硅膠柱層析，用氯仿甲醇(6 S : 1)洗脫，濃縮后得到有效組分378mg。
實(shí)施例四
蒲葵子有效組分的分析 (1)蒲葵子提取物中小麥黃素、芹菜素的含量測(cè)定(高效液相色譜法)
色譜條件色譜柱Agilent Zorbax SB-C18柱(4. 6mmX 150mm， 5 ii m);采用梯度洗 脫，流動(dòng)性A相為0. 2%冰醋酸水溶液，流動(dòng)相B相為乙腈溶液，梯度洗脫程序如下0分鐘 時(shí)，流動(dòng)相A相為80 %的0. 2 %冰醋酸水溶液、流動(dòng)相B相為20 %乙腈溶液；15min時(shí)，流動(dòng) 相A相為45%的0. 2%冰醋酸水溶液、流動(dòng)相B相為55%乙腈溶液；35min時(shí)，流動(dòng)相A相 為5%的0. 2%冰醋酸水溶液、流動(dòng)相B相為95%乙腈溶液；流速0. 5ml min—1 ;檢測(cè)波長(zhǎng) 全波長(zhǎng)；柱溫30°C ;紫外檢測(cè)器。 供試品溶液的制備稱取本品，用甲醇溶液溶解在容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得。 測(cè)定方法精密吸取供試品溶液，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。
(2)上述蒲葵子有效組分HPLC-UV指紋圖譜測(cè)l定方法參見(1)上述蒲葵子提取物中的小麥黃素、芹菜素含量測(cè)定(高效液相 色譜法)。記錄色譜時(shí)間為40分鐘。 分析結(jié)果蒲葵子有效組分的HPLC-UV分析譜圖見圖1，圖1中的1、2分別為小麥 黃素、芹菜素。
本發(fā)明中，芹菜素的結(jié)構(gòu)式為
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實(shí)施例五 抗腫瘤生物活性篩選試驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞H印G-2、人白血病HL60、宮頸癌細(xì)胞Hela、人 鼻咽癌細(xì)胞CNE-2、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7)用0. 25%的胰蛋白酶消化，然后用含10% (體積 百分含量)小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，并分別將各腫瘤稀釋至 1. OX 105個(gè)/ml，再將其接種至96孔培養(yǎng)板中，每孔200ul，各腫瘤細(xì)胞分別接種3個(gè)孔，于 37°C，5% C02的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h ;然后傾去各孔培養(yǎng)液。 將實(shí)施例1制得的蒲葵子有效組分溶解于匿SO中，然后用RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行 稀釋，得到蒲葵子有效組分溶液，使其終濃度為20ug/ml，使匿S0的濃度為10% (體積百分 含量)。 同時(shí)設(shè)實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組進(jìn)行實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)組將蒲葵子有效組分溶液依次分別加入上述腫瘤細(xì)胞H印G-2、 HL60、 Hela、 CNE-2、MCF-7的培養(yǎng)孔內(nèi)，各自接種3個(gè)孔，每孔加入200ul ; 對(duì)照組向上述各腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)孔內(nèi)加入含10% (體積百分含量)DMSO的 RPMI1640培養(yǎng)基，各自接種3個(gè)孔，每孔加入200ul ; 空白組向不含腫瘤細(xì)胞的空培養(yǎng)孔內(nèi)加入含10% (體積百分含量)DMSO的 200ul RPMI1640培養(yǎng)基； 將以上各組的培養(yǎng)板同時(shí)置于37°C，5% C02的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2天。2天后向每孔 加入50ul新鮮配制的lmg/ml四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)溶液，并在37°C，5% C02的條件下繼 續(xù)培養(yǎng)4h ;小心棄上清，每孔加入150ul DMSO，充分溶解MTT還原產(chǎn)物；在酶標(biāo)儀上測(cè)定各 孔在波長(zhǎng)492nm處的光密度值(OD值)，按公式計(jì)算腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。抑制率(％ )= 1— (OD實(shí)驗(yàn)—OD空白)/ (OD對(duì)照—OD空白)X 100 % 。 實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。蒲葵子有效組分對(duì)人不同腫瘤細(xì)胞H印G-2、 HL60、Hela、CNE-2、MCF-7的抑制作用的結(jié)果如表1所示。
表1蒲葵子有效組分對(duì)人不同腫瘤細(xì)胞的抑制作用
腫瘤細(xì)胞有效組分濃度 (ug/ml)抑制率(％ )
人肝癌細(xì)胞H印G-22090. 2
人白血病HL602050. 6
宮頸癌細(xì)胞Hela2048. 9
人鼻咽癌細(xì)胞CNE-22067. 8
人乳腺癌細(xì)胞MCF-72065. 3 蒲葵子活性組分對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的抑制作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(表l)，蒲葵子活性 組分在濃度為20ug/ml時(shí)對(duì)人肝癌細(xì)胞H印G-2、人自血病HL60、宮頸癌細(xì)胞Hela、人鼻咽 癌細(xì)胞CNE-2、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7均有一定程度的抑制作用，對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制率可達(dá) 90.2%。因此，蒲葵子活性組分可以用于制備肝癌、白血病、宮頸癌、鼻咽癌、乳腺癌的藥物。
權(quán)利要求
一種蒲葵子的抗腫瘤有效組分的制備方法，其特征是以蒲葵子為原料，經(jīng)浸膏提取、有效組分的分離的處理過程而制備得到抗腫瘤有效組分。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蒲葵子的抗腫瘤有效組分的制備方法一種蒲葵子的抗腫瘤有效組分，以重量百分比計(jì)，其中小麥黃素的含量是40 50%，芹菜素的含量是10 20%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蒲葵子的抗腫瘤有效組分的制備方法是將自然晾干的蒲葵子粉碎，加溶媒加熱提取得提取液，將提取液濃縮至干，得蒲葵子粗提取物。粗提物依 次分別用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取。乙酸乙酯萃取液減壓濃縮至干，經(jīng)過聚酰胺層析柱，用水和乙醇洗脫，得到洗脫液，將洗脫液干燥后得樣品；再經(jīng)過硅膠柱層析， 用氯仿和甲醇洗脫，得到有效組分。
4. 權(quán)利要求書3所述的制備方法，其特征在于(1) 將自然晾干的蒲葵子粉碎后，加入1 3倍60-95%的乙醇，60 IO(TC加熱回流 提取，至少提取一次，每次提取時(shí)間為1 4小時(shí)，得提取液，過濾分離得固相和液相；(2) 液相蒸餾回收乙醇，得到蒲葵子粗提物深紅色的浸膏A ;(3) 浸膏A用適量的水混懸，然后依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，減 壓回收石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇，得到石油醚浸膏B、二氯甲烷浸膏C、乙酸乙 酯浸膏D和正丁醇浸膏E。(4) 乙酸乙酯浸膏D用聚酰胺層析柱，用水-乙醇(依次為純水、30%、70%乙醇)作為 流動(dòng)相，分別收集合并各種洗脫液，濃縮后得樣品；再經(jīng)過硅膠柱層析，用氯仿甲醇(5 13 : 1)洗脫，濃縮后得到有效組分。
5. 權(quán)利要求書1 4所述蒲葵子有效組分在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明為一種蒲葵子的抗腫瘤有效組分的制備方法。以蒲葵子為原料，經(jīng)浸膏提取、有效組分的分離的處理過程而制備得到抗腫瘤有效組分。該有效組分主要含有小麥黃素、芹菜素，其中，按照重量百分比計(jì)，小麥黃素的含量是40～50％，芹菜素的含量是10～20％。本發(fā)明蒲葵子的抗腫瘤有效組分的制備方法是將蒲葵子粉碎后提取，得粗提取物。粗提物用有機(jī)溶劑萃取，再經(jīng)過聚酰胺層析柱，將洗脫液濃縮后，再經(jīng)過硅膠柱層析，得到有效組分。避免了繁瑣的分離出單體，該方法簡(jiǎn)單、成本低廉、省時(shí)，且有益于標(biāo)準(zhǔn)化，在生產(chǎn)中更易于藥物的質(zhì)量控制。本發(fā)明提供的蒲葵子抗腫瘤有效組分經(jīng)抗腫瘤生物活性的篩選實(shí)驗(yàn)，證明其對(duì)抗腫瘤具有明顯的療效。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101698035SQ20091011224
公開日2010年4月28日 申請(qǐng)日期2009年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月27日
發(fā)明者姚宏, 李光文, 李少光, 林新華, 羅紅斌, 陳艷 申請(qǐng)人:林新華;姚宏;陳艷