專利名稱：抗人死亡受體5的單鏈抗體基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因，尤其是涉及一種抗人死亡受體5(death rec印tor 5， DR5) 的單鏈抗體基因及其重組載體和表達(dá)產(chǎn)物。
背景技術(shù)：
單鏈抗體的出現(xiàn)是人們對抗體認(rèn)識的加深和科學(xué)技術(shù)發(fā)展的必然結(jié)果。自從英國 和日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)了白喉抗毒素，并首次將免疫血清用于傳染病的被動免疫治療和血清學(xué)診
斷以來，抗體技術(shù)作為一種治療手段備受人們關(guān)注。 1975年，Kohler等(Kohler and Milstein. Nature, 1975， 256 :495)發(fā)現(xiàn)并利用雜 交瘤技術(shù)，成功地制備出具有高特異性和親和力的單克隆抗體，克服了多克隆抗體特異性 差的缺點(diǎn)，所以單克隆抗體的出現(xiàn)受到人們的廣泛關(guān)注，各國學(xué)者紛紛投入到單克隆抗體 的研究工作中，并期望找到診斷和治療疾病的有效方法。目前，已經(jīng)有多種單克隆抗體進(jìn)入 臨床使用。但是目前臨床應(yīng)用的單克隆抗體基本都是鼠源的，人源單克隆抗體的研究進(jìn)展 緩慢。 雖然單克隆抗體技術(shù)得到了很大的發(fā)展，但是仍存在著局限性，其中最致命的缺
陷是單克隆抗體作為一種異源蛋白進(jìn)入人體會引起免疫排斥反應(yīng)，這不僅影響了單克隆抗
體療效的發(fā)揮，還會干擾其在體內(nèi)的正常分布，因而限制其在臨床中的應(yīng)用。 進(jìn)入20世紀(jì)80年代后，分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展促進(jìn)了抗體技術(shù)研究的進(jìn)
步，基因工程抗體應(yīng)運(yùn)而生，其中以單鏈抗體最受人們關(guān)注。自從1988年Bird等(Bird
andHuston，Procatl Acad Sci USA， 1988， 5 :5875-5879)成功研制了第一個單鏈抗體以來，
目前已研制成功并生產(chǎn)了多種單鏈抗體，除用于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究和疾病的體外診斷外，有一
些已開始用于臨床治療。作為一個新興的事物，單鏈抗體技術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)成為抗體相關(guān)研究
領(lǐng)域的前沿和熱點(diǎn)問題。它不僅可以對現(xiàn)有的抗體進(jìn)行改造，還可以創(chuàng)造出自然界不存在
的全新的抗體，既可以降低抗體的免疫原性，還可以增強(qiáng)抗體的療效。 單鏈抗體是用基因工程方法制備的小分子抗體，是由彈性連接肽(一般為12 15
個氨基酸)將抗體的重鏈可變區(qū)(VH)與輕鏈可變區(qū)(、)連接而成的重組抗體，其分子量只
相當(dāng)于原抗體的六分之一，但單鏈抗體含有全部的抗原結(jié)合位點(diǎn)，所以單鏈抗體最大程度
地保留了抗體的抗原結(jié)合活性，是具有親本抗體抗原結(jié)合活性的最小片段。 單鏈抗體出現(xiàn)以后，人們在研究單鏈抗體的過程中，發(fā)現(xiàn)單鏈抗體具有的一些無
可比擬的優(yōu)越性，所以人們就利用現(xiàn)有技術(shù)對單鏈抗體進(jìn)行了改造和修飾，以完善單鏈
抗體的功能和發(fā)展新的用途，目前已經(jīng)出現(xiàn)的基于單鏈抗體而開發(fā)出來的新抗體有以下
幾種單鏈抗體多聚體、雙特異性單鏈抗體、單域抗體、具有恒定區(qū)的單鏈抗體、胞內(nèi)抗體
(intracellular antibodyor intrabody)。其中胞內(nèi)抗體技術(shù)是近年來，隨著人們對抗體
工程和細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的深入研究，派生出的一項(xiàng)全新的可阻斷細(xì)胞內(nèi)重要靶蛋白的抗體
技術(shù)。因而，單鏈抗體技術(shù)及其衍生技術(shù)的發(fā)展，為腫瘤、免疫相關(guān)疾病的診斷、治療和研究
奠定了基礎(chǔ)。
4
腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體TRAIL(Tumor necrosis factor-Related
Apoptosis InducingLigand)是新近發(fā)現(xiàn)的TNF超家族的又一成員。與TNF家族其他成員
不同的是，TRAIL在體內(nèi)僅以膜結(jié)合型存在。體外實(shí)驗(yàn)表明，無論膜結(jié)合型的，還是可溶型
的TRAIL,都能迅速誘導(dǎo)表達(dá)TRAIL特異性受體的細(xì)胞發(fā)生凋亡。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，TRAIL
與死亡受體結(jié)合可選擇性地誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，而對大多數(shù)正常細(xì)胞無明顯的殺傷作
用。這一特性使其優(yōu)于TNF配體家族的其它成員，成為腫瘤治療的新動力。 DR5又稱TRAIL-R2，屬I型跨膜蛋白，富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域及死亡結(jié)構(gòu)域。多項(xiàng)
研究成果表明，DR5在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中都有表達(dá)，如在胎兒的肝、肺，以及成人的淋巴
細(xì)胞、肝、卵巢、脾和肺中等部位，尤其高水平地表達(dá)于許多腫瘤組織，如甲狀腺癌、咽喉癌、
肺癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌、睪丸癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮癌、直腸癌等。 1995年Wiley在Immunity, 1995， 3 (6) :673中克隆并發(fā)現(xiàn)了腫瘤壞死因子相關(guān)誘
導(dǎo)配體(Tumor necrosis factor related即optosis-inducing ligand， TRAIL)基因，由
Pitti等證實(shí)并又命名為Apo-2L。 TRAIL廣泛表達(dá)于正常人的各種組織，如外周血淋巴細(xì)
胞、肺、腎、脾、胸腺、前列腺、卵巢、小腸、心臟、胎盤、骨骼肌等，而在腦、肝和睪丸中未檢測 到表達(dá)。目前已知TRAIL有兩種形式膜結(jié)合型TRAIL (全長的TRAIL)和可溶型TRAIL (胞 外區(qū)C端的168個氨基酸)，它們在體外均能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡，作用范圍很廣。
2001年Ichikawa在Nat. Med. ，2001,7 :954中制備出人DR5特異的競爭性單克隆 抗體(Agonistic monoclonal antibody specific for human DR5， TRA-8)，這是特異性 針對人細(xì)胞膜表面的死亡受體DR5而合成的單克隆抗體，它與一般的抗人DR5的單克隆抗 體(Monoclonalantibody against human DR5)不同，它能特異性地與死亡受體DR5相結(jié) 合，發(fā)揮配體的作用，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。制備該單抗的過程為，將人DR5的細(xì)胞外區(qū)和人 IgGl (DR5-Ig)的Fc段組成融合蛋白來免疫雌性BALB/c小鼠，從而合成了 TRA-8這種單克 隆抗體。實(shí)驗(yàn)證明，TRA-8能誘導(dǎo)許多表達(dá)DR5受體的腫瘤細(xì)胞的凋亡，而對正常組織細(xì)胞 無毒性，并且用Western-blot法分析，TRA-8不會與其他的死亡受體發(fā)生交叉反應(yīng)。
由于死亡受體DR5在細(xì)胞分布及作用機(jī)制的獨(dú)特性，已為人們在研究腫瘤細(xì)胞凋 亡的方向上提供了良好的前景，隨著對死亡受體DR5及其配體的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)在抗 癌治療上也存在著某些問題，如TRAIL對肝癌的耐藥性，及它對肝細(xì)胞的毒性等，目前已成 為人們著力探討的課題。而TRA-8也正處于研制當(dāng)中，但是對DR5受體的新配體的不斷探 索，加深了人們對DR5受體在腫瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生、發(fā)展及治療方面的認(rèn)識，并為全新的腫 瘤治療方案提供了廣闊的理論依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供抗人死亡受體5的單鏈抗體(aDR5-scFv)基因。
本發(fā)明的另一目的是提供所述抗人死亡受體5的單鏈抗體基因的制備方法。
本發(fā)明的另一 目的是提供所述的抗人死亡受體5的單鏈抗體基因在制備抗腫瘤 藥物中應(yīng)用。 所述抗人死亡受體5的單鏈抗體基因，是由連接肽連接抗體的輕鏈(VJ和重鏈 (VH)基因建立，所述抗人死亡受體5的單鏈抗體基因由726個堿基組成，
其核苷酸序列為
13tgCElggtcCElgctgCElgc朋tctcctgagctggtg朋gcct49ggggetteagtgatetectgc朋ggettctggctat3CCttc97agetactatateC3Ctgggtg朋gCElg￡lggcctgg￡iCElgggccttgag145tggattgg￡itatatttatcct3gag￡ltggtElgtact朋ttac朋tgag193朋gttc朋gggc朋ggccctgactgCElg￡lCtectecage241gcctacEltgCElgetcageagectgtctg￡lgg￡lCtctgCElgtctat289ttctgtgCEl￡igggccetctatgatggtC3CtacgtgggggetEltgg￡lC337tactggggtc朋gg￡iggtggctctgggggtggtageggt385gg￡iggcgggElgtggggccatttecCElggetgttgtgactCElgg朋tct433gCEletc3CCteacctggtg朋gtcetcacttgtcgctea481Elgtactggggetgtt3CCElgt朋ctatgcctgggtcg朋529CC3g￡ltcatttattcactggtetaateggtggt3CCCg￡l577getCC3ggtgttcctgcc3gaateteaggctecctgattg￡lC朋g625getgccetc3CCateggggetCElgactgagg￡ltgaggCElatetat673ttctgtgttetatggtacage朋ccattgggtgttcggtgg￡i3CC721aaactg其氨基酸序列為1METGlyGinValGinLeuGinGinSerGlyProGluLeuValLysPro17GlyAlaSerValLyslieSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThr33SerTyrTyrlieHisTrpValLysGinArgProGlyGinGlyLeuGlu49TrplieGlyTyrlieTyrProArgAspGlySerThrAsnTyrAsnGlu65LysPheLysGlyLysAlaThrLeuThrAlaAspThrSerSerSerThr81AlaTyrMETGinLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyr97PheCysAlaArgAlaLeuTyrAspGlyHisTyrValGlyAlaMETAsp113TyrTrpGlyGinGlyGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGly129GlyGlyGlySerGlyAlalieSerGinAlaValValThrGinGluSer145AlaLeuThrThrSerProGlyGluThrValThrLeuThrCysArgSer161SerThrGlyAlaValThrThrSerAsnTyrAlaAsnTrpValGinGlu177LysProAspHisLeuPheThrGlyLeulieGlyGlyThrAsnAsnArg193AlaProGlyValProAlaArglieSerGlySerLeulieGlyAspLys209AlaAlaLeuThrlieThrGlyAlaGinThrGluAspGluAlalieTyr225PheCysValLeuTrpTyrSerAsnHisTrpValPheGlyGlyGlyThr241LysLeu(女:終止密碼子:)所述抗人死亡受體5的單鏈抗體基因的制備方法包括以下步驟1)--個制備抗人DR5的單克隆抗體的步驟；2)--個克隆抗體可變區(qū)基因的步驟;3)--個對獲得的基因片段進(jìn)行測序分析的步驟；4)—-個用連接肽(Linker)連接抗體輕鏈、重鏈可變區(qū)基因的步驟；
5) —個構(gòu)建表達(dá)載體的步驟；
6) —個制備重組抗體的步驟。 所述制備抗人DR5的單克隆抗體的步驟是用人DR5蛋白免疫8周齡的Balb/c小 鼠，經(jīng)脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合獲得穩(wěn)定分泌抗人DR5單克隆抗體(aDR5 mAb)的雜交瘤細(xì) 胞株。 所述克隆抗體可變區(qū)基因的步驟是從雜交瘤細(xì)胞株中提取mRNA，用Novagen公 司抗體通用引物試劑盒提供的引物，通過RT-PCR法克隆出該單克隆抗體輕、重鏈可變區(qū)基 因。 所述對獲得的基因片段進(jìn)行測序分析的步驟是將獲得的基因片段分別克隆到商 業(yè)化的T載體(pMD19-T simple vector, TaKaRa)，進(jìn)行序列分析，經(jīng)同源對比分析，證實(shí)該 基因片段為抗體可變區(qū)基因。 所述用連接肽(Linker)連接抗體輕鏈、重鏈可變區(qū)基因的步驟是設(shè)計引物，以15 個氨基酸的柔性連接肽將抗體輕、重鏈可變區(qū)基因連接起來，構(gòu)建成scFv基因。
所述構(gòu)建表達(dá)載體的步驟是將scFv基因克隆到商業(yè)化的pET-22b (+)載體上，轉(zhuǎn) 化Rosetta-gami大腸桿菌宿主，獲得轉(zhuǎn)化菌株為工程菌株Rosetta-gami-aDR5-scFv。
所述制備重組抗體的步驟是用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)工程菌株，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá) 12h，表達(dá)效率達(dá)30X以上。經(jīng)過破菌、過鎳柱純化等步驟純化后，獲得該發(fā)明的分子量為 30kD的重組單鏈抗體。 所述抗人死亡受體5的單鏈抗體基因可在制備抗腫瘤藥物中應(yīng)用。 所述單鏈抗體具有兩個抗原結(jié)合臂，可同時與T細(xì)胞及靶細(xì)胞結(jié)合，并激活細(xì)胞
毒性T細(xì)胞殺傷病變細(xì)胞。單鏈抗體分子量只相當(dāng)于完整抗體的1/6，在臨床應(yīng)用上比完整
抗體優(yōu)越，免疫原性弱，對實(shí)體瘤滲透能力強(qiáng)，可用基因工程手段發(fā)酵生產(chǎn)。與傳統(tǒng)的單克
隆抗體藥物相比，可進(jìn)行大規(guī)模細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)，價格低，易于普及應(yīng)用，是一種極具應(yīng)用潛
力的抗體形式。 本發(fā)明提供的抗DR5單鏈抗體(aDR5-scFv)是有實(shí)際應(yīng)用價值的單鏈抗體 (single-chainFv，scFv) 。 aDR5-scFv是由一條連接肽將aDR5mAb輕鏈(VL)和重鏈(VH)基 因連在一起所形成的單一肽鏈，通過正確折疊，兩個可變區(qū)由非共價鍵形成具有抗原結(jié)合 功能的片段，aDR5-scFv分子量小，易穿入固體組織及腫瘤內(nèi)部，且保留親本抗體結(jié)合抗原 的特性和功能，因而是一種具有潛在應(yīng)用價值的免疫治療制劑。


圖1為抗人DR5單鏈抗體(aDR5-scFv)基因工程菌表達(dá)分析圖。在圖1中，l，未 誘導(dǎo)大腸桿菌總蛋白；2，IPTG誘導(dǎo)lh表達(dá)蛋白；3，IPTG誘導(dǎo)3h表達(dá)蛋白；4，IPTG誘導(dǎo)6h 表達(dá)蛋白；5， IPTG誘導(dǎo)12h表達(dá)蛋白；6，純化后的scFv;7，蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)蛋白掃描 分析，IPTG誘導(dǎo)l 12h scFv的表達(dá)量分別占菌體總蛋白的24X，28X，33X，35X，完全 滿足工程菌表達(dá)蛋白的要求。
具體實(shí)施例方式
1.抗人DR5雜交瘤細(xì)胞株的制備人DR5蛋白lOOii L(約45ii g)與等量弗氏完全佐劑進(jìn)行乳化，充分混合至油 包水狀。于8周齡雌性Balb/c小鼠背部皮下多點(diǎn)注射。每隔2周以相同劑量的DR5加等 量弗氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫2次。15天后，腹腔注射人DR5(50iig)與弗氏不完全佐劑混合 物。末次加強(qiáng)免疫4天后經(jīng)眼球取血，間接ELISA法測定小鼠血清中抗sDR5抗體的效價， 挑選抗血清效價高的小鼠經(jīng)尾靜脈注射重組人DR5蛋白100 ii L加強(qiáng)免疫，3天后進(jìn)行細(xì)胞 融合。 加強(qiáng)免疫3天后，取抗血清效價高的已免疫Balb/c小鼠，眼球取血(取血清留作 陽性對照)后，脫頸處死小鼠，75%酒精浸泡消毒皮膚，無菌取脾，擠壓出脾細(xì)胞，加入20mL GKN溶液于平皿中，10mL吸管吹散脾細(xì)胞團(tuán)塊，將細(xì)胞懸液移至50mL離心管，制備免疫脾細(xì) 胞。取骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0于另一離心管，1500r/min離心5min棄上清后，分別加入GKN溶液 20mL，計數(shù)，同時1500r/min離心5min。根據(jù)計數(shù)結(jié)果，調(diào)整脾細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞=6 : 1， 且脾細(xì)胞濃度為3 X 106/mL?；旌蟽煞N細(xì)胞后，1500r/min離心5min棄上清，彈散管底細(xì)胞， 離心管置于37t:水浴中，lmin內(nèi)緩慢加入50% PEG溶液lmL(邊加邊輕輕攪動)，靜置40s， lmin內(nèi)加入lmLGKN溶液(邊加邊輕輕攪動)，隨后以同法再在2min內(nèi)加入5mLGKN， 2min 內(nèi)加入10mL GKN溶液。將上述細(xì)胞懸液800r/min離心7min，棄上清，輕輕彈散管底細(xì)胞， 加入所需20% HAT培養(yǎng)液，混勻后加入已鋪?zhàn)甜B(yǎng)細(xì)胞的96孔板中，置于37°C C02培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)。 融合后第二天補(bǔ)加HAT培養(yǎng)液。融合一周后換液一次，補(bǔ)加含HAT的RPMI 1640 完全培養(yǎng)液。HAT選擇培養(yǎng)液維持培養(yǎng)兩周后，改用HT培養(yǎng)液培養(yǎng)兩周，接下來改用一般培 養(yǎng)液。于雜交瘤細(xì)胞布滿孔底1/10面積時(約第10天)檢測特異性抗體的產(chǎn)生。以sDR5 蛋白包被酶標(biāo)板，間接ELISA法篩選陽性克隆。 經(jīng)ELISA檢測篩選到陽性雜交瘤的當(dāng)日即采用有限稀釋法對陽性孔雜交瘤細(xì)胞 進(jìn)行克隆化。在克隆化前一天，先以正常小鼠脾制備飼養(yǎng)細(xì)胞，鋪96孔板，制備方法同融合 實(shí)驗(yàn)。將96孔板中待做克隆化的雜交瘤細(xì)胞用加樣器反復(fù)吹打均勻后，取少許細(xì)胞懸液至 另一無菌試管中，取該試管中的細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)確計數(shù)。取300個細(xì)胞懸浮于6mL培養(yǎng)液中(約 5個細(xì)胞/0. lmL)，接種96孔培養(yǎng)板，0. lmL/孔，共32孔，余下2. 8mL，再加入3. 2mL培養(yǎng)液， 共6mL (約2. 5個細(xì)胞/0. lmL)接種96孔培養(yǎng)板，0. lmL/孔，共32孔，最后剩余2. 8mL，再 加入3. 2mL培養(yǎng)液，共6mL (約1. 25個細(xì)胞/0. lmL)，接種32孔培養(yǎng)板0. lmL/孔。將培養(yǎng) 板置于含5% C02的37t:培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5天左右在顯微鏡下觀察到細(xì)胞克隆。培養(yǎng)7 10 天后，ELISA檢測篩選陽性克隆，再次克隆化?？寺』瘷z測兩次100%陽性后，挑取效價高的 陽性單克隆雜交瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，同時須凍存幾支單克隆細(xì)胞 備用。 2.抗體可變區(qū)基因、和VH的克隆 篩選出一株分泌可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，以含10%胎 牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)至對數(shù)生長期，1000rpm，離心5min收集5X 106個細(xì)胞，然后按照 AmershamBiosciences公司的"RNA分離純化試劑盒"提取雜交瘤細(xì)胞的總RNA并分離純化 mRNA，使用Novagen公司抗體通用引物試劑盒提供的引物，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR。
逆轉(zhuǎn)錄條件為7(TC保溫10min后迅速在冰上急冷5min，42t:保溫lh，7(TC保溫 15min后冰上冷卻，得到的cDNA直接用于PCR擴(kuò)增。PCR條件為94。C保溫lmin，58t:保溫
850s， 72t:保溫2min，共30個循環(huán)，PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析后回收目的片段，并
與pMD-T Simple Vector相連接，測序鑒定。 3.抗體基因VH、、的連接肽和scFv基因構(gòu)建 根據(jù)序列測定獲得的VH與、基因序列的氨基端及羧基端序列，設(shè)計構(gòu)建scFv的 引物，并通過引物帶入連接肽序列
VH正義鏈引物為 5' -AAAACCATGGGACAGGTCCAGCTGCAGCAATCTGGACCTGAG-3'
(CCATGG為Ncol酶切位點(diǎn))
VH反義鏈引物為5 ' - GCT4CC4CCaXTCC4G4rCCGCCACCTCC
TCCTTGACCCCAGTAGTCCATAGCC-3'
、正義鏈引物為 5 爿rCTGG^(7G( CF(Frc;G7^(7CGGTGGAGGCGGGAGT
GGGGCCATTTCCCAGGCTGT-3'
、反義鏈引物為 5' -AAAACTCGAGCAGTTTGGTTCCTCCACCGAACACCCAATGG-3'
(CTCGAG為Xho I酶切位點(diǎn)) 其中，VH反義鏈引物和VL正義鏈引物中黑體部分為連接肽，經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增，斜 體黑體部分為互補(bǔ)序列，為構(gòu)建scFv而設(shè)計。 PCR反應(yīng)條件為94。C 5min;然后94。C lmin，60。C 50s，72。C 2min，30個循環(huán)； 最后72t: 10min。將延伸后的PCR產(chǎn)物電泳回收后，overlap PCR進(jìn)一步構(gòu)建scFv基因。 在PCR管中加入上述PCR產(chǎn)物、Taq酶和緩沖液，在不加入引物的情況下進(jìn)行10個循環(huán) 94°C 2min，58°C lmin，72°C lmin。在此過程中，VH反義鏈引物和、正義鏈引物的互補(bǔ)序 列進(jìn)行互補(bǔ)配對，延伸后形成完整的VH-連接肽-VL。最后加入VH正義鏈引物和VL反義鏈 引物進(jìn)行以下反應(yīng)94。C 5min ;94。C lmin，60。C 50s，72。C lmin， 30個循環(huán)；72。C 10min， 最終獲得scFv基因序列。
4.構(gòu)建scFv基因的重組表達(dá)載體 限制性內(nèi)切酶Ncol和Xhol分別消化表達(dá)載體pET-22b (+)與aDR5-scFv基因序 列，純化回收后按摩爾濃度1 : 10比例混合表達(dá)載體和scFv基因，用T4DNA連接酶連接載 體和scFv基因，獲得重組表達(dá)載體pET-22b (+) -aDR5-scFv。
5.表達(dá)aDR5-scFv重組蛋白 將重組表達(dá)載體pET-22b (+) -aDR5-scFv轉(zhuǎn)化DH5 a感受態(tài)大腸桿菌，氨節(jié)青霉素 LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選，雙酶切鑒定并進(jìn)行測序鑒定。陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，提取表達(dá)載體質(zhì) 粒轉(zhuǎn)化Rosetta-gami感受態(tài)大腸桿菌，37。C培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)至0D6。。約為0. 6時，加入IPTG使 其終濃度為0. 6mM，誘導(dǎo)12h。 8000rpm 4。C離心20min收集菌體，以15%的SDS-PAGE分析 aDR5-scFv重組蛋白表達(dá)情況。
序列表 抗人死亡受體5的單鏈抗體(aDR5-scFv)基因的核苷酸序列為 1 atg gga cag gtc cag ctg cag caa tct gga cct gag ctg gtg aag cct
49ggggetteagtg朋gatetectgc朋ggettctggctat3CCttc97agetactatateC3Ctgggtg朋gCElg￡lggcctCElgggccttgag145tggattgg￡itatatttatcct3gag￡ltggtElgtact朋ttac朋tgag193朋gttc朋gggc朋ggccctgactgCElg￡lCtectecage241gcctacEltgCElgetcageagectgtctg￡lgg￡lCtctgCElgtctat289ttctgtgCEl￡igggccetctatgatggtC3CtacgtgggggetEltgg￡lC337tactggggtc朋gg￡iggtggctctgggggtggtageggt385gg￡iggcgggElgtggggccatttecCElggetgttgtgactCElgg朋tct433gCEletc3CCteacctggtg朋gtcetcacttgtcgctea481Elgtactggggetgtt3CCElgt朋ctatgcctgggtcg朋529CC3g￡ltcatttattcactggtetaateggtggt3CCCg￡l577getCC3ggtgttcctgcc3gaateteaggctecctgattg￡lC朋g625getgccetc3CCateggggetCElgactgagg￡ltgaggCElatetat673ttctgtgttetatggtacage朋ccattgggtgttcggtgg￡i3CC721aaactg抗人死亡受體5的單鏈抗體(aDR5-scFv)基因的氨基酸序列為1METGlyGinValGinLeuGinGinSerGlyProGluLeuValLysPro17GlyAlaSerValLyslieSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThr33SerTyrTyrlieHisTrpValLysGinArgProGlyGinGlyLeuGlu49TrplieGlyTyrlieTyrProArgAspGlySerThrAsnTyrAsnGlu65LysPheLysGlyLysAlaThrLeuThrAlaAspThrSerSerSerThr81AlaTyrMETGinLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyr97PheCysAlaArgAlaLeuTyrAspGlyHisTyrValGlyAlaMETAsp113TyrTrpGlyGinGlyGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGly129GlyGlyGlySerGlyAlalieSerGinAlaValValThrGinGluSer145AlaLeuThrThrSerProGlyGluThrValThrLeuThrCysArgSer161SerThrGlyAlaValThrThrSerAsnTyrAlaAsnTrpValGinGlu177LysProAspHisLeuPheThrGlyLeulieGlyGlyThrAsnAsnArg193AlaProGlyValProAlaArglieSerGlySerLeulieGlyAspLys209AlaAlaLeuThrlieThrGlyAlaGinThrGluAspGluAlalieTyr225PheCysValLeuTrpTyrSerAsnHisTrpValPheGlyGlyGlyThr241LysLeu* 。(女:終止密碼子)
權(quán)利要求
抗人死亡受體5的單鏈抗體基因，其特征在于由連接肽連接抗體的輕鏈和重鏈基因建立，由726個堿基組成其核苷酸序列為1atg gga cag gtc cag ctg cag caa tct gga cct gag ctg gtg aag cct49 ggg gct tca gtg aag ata tcc tgc aag gct tct ggc tat acc ttc aca97 agc tac tat ata cac tgg gtg aag cag agg cct gga cag ggc ctt gag145 tgg att gga tat att tat cct aga gat ggt agt act aat tac aat gag193 aag ttc aag ggc aag gcc aca ctg act gca gac aca tcc tcc agc aca241 gcc tac atg cag ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct gca gtc tat289 ttc tgt gca agg gcc ctc tat gat ggt cac tac gtg ggg gct atg gac337 tac tgg ggt caa gga gga ggt ggc gga tct gga ggg ggt ggt agc ggt385 gga ggc ggg agt ggg gcc att tcc cag gct gtt gtg act cag gaa tct433 gca ctc acc aca tca cct ggt gaa aca gtc aca ctc act tgt cgc tca481 agt act ggg gct gtt aca acc agt aac tat gcc aac tgg gtc caa gaa529 aaa cca gat cat tta ttc act ggt cta ata ggt ggt acc aac aac cga577 gct cca ggt gtt cct gcc aga atc tca ggc tcc ctg att gga gac aag625 gct gcc ctc acc atc aca ggg gct cag act gag gat gag gca ata tat673 ttc tgt gtt cta tgg tac agc aac cat tgg gtg ttc ggt gga gga acc721 aaa ctg；其氨基酸序列為1 MET Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro17Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr33Ser Tyr Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu49Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu65Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr81Ala Tyr MET Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr97Phe Cys Ala Arg Ala Leu Tyr Asp Gly His Tyr Val Gly Ala MET Asp113 Tyr Trp Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly129Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ile Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser145Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser161Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu177Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg193Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Ile Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys209Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr225Phe Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr241Lys Leu＊。
2.如權(quán)利要求1所述的抗人死亡受體5的單鏈抗體基因的制備方法，其特征在于包括 以下步驟1) 一個制備抗人DR5的單克隆抗體的步驟；2) —個克隆抗體可變區(qū)基因的步驟；3) —個對獲得的基因片段進(jìn)行測序分析的步驟；4) 一個用連接肽(Linker)連接抗體輕鏈、重鏈可變區(qū)基因的步驟；5) —個構(gòu)建表達(dá)載體的步驟；6) —個制備重組抗體的步驟。
3. 如權(quán)利要求2所述的抗人死亡受體5的單鏈抗體基因的制備方法，其特征在于所述 制備抗人DR5的單克隆抗體的步驟是用人DR5蛋白免疫8周齡的Balb/c小鼠，經(jīng)脾細(xì)胞和 骨髓瘤細(xì)胞融合獲得穩(wěn)定分泌抗人DR5單克隆抗體(aDR5mAb)的雜交瘤細(xì)胞株。
4. 如權(quán)利要求2所述的抗人死亡受體5的單鏈抗體基因的制備方法，其特征在于所述 克隆抗體可變區(qū)基因的步驟是從雜交瘤細(xì)胞株中提取mRNA，用Novagen公司抗體通用引物 試劑盒提供的引物，通過RT-PCR法克隆出該單克隆抗體輕、重鏈可變區(qū)基因。
5. 如權(quán)利要求2所述的抗人死亡受體5的單鏈抗體基因的制備方法，其特征在于所述 對獲得的基因片段進(jìn)行測序分析的步驟是將獲得的基因片段分別克隆到商業(yè)化的T載體 (pMD19-T simple vector, TaKaRa)，進(jìn)行序列分析，經(jīng)同源對比分析，證實(shí)該基因片段為抗 體可變區(qū)基因。
6. 如權(quán)利要求2所述的抗人死亡受體5的單鏈抗體基因的制備方法，其特征在于所述 用連接肽(Linker)連接抗體輕鏈、重鏈可變區(qū)基因的步驟是設(shè)計引物，以15個氨基酸的柔 性連接肽將抗體輕、重鏈可變區(qū)基因連接起來，構(gòu)建成scFv基因。
7. 如權(quán)利要求2所述的抗人死亡受體5的單鏈抗體基因的制備方法，其特征在 于所述構(gòu)建表達(dá)載體的步驟是將scFv基因克隆到商業(yè)化的pET-22b(+)載體上，轉(zhuǎn)化 Rosetta-gami大腸桿菌宿主，獲得轉(zhuǎn)化菌株為工程菌株Rosetta-gami-aDR5-scFv。
8. 如權(quán)利要求2所述的抗人死亡受體5的單鏈抗體基因的制備方法，其特征在于所述 制備重組抗體的步驟是用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)工程菌株，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)12h，表達(dá)效率達(dá) 30%以上。經(jīng)過破菌、過鎳柱純化等步驟純化后，獲得該發(fā)明的分子量為3. 0kD的重組單鏈 抗體。
9. 如權(quán)利要求1所述的抗人死亡受體5的單鏈抗體基因在制備抗腫瘤藥物中應(yīng)用。
全文摘要
抗人死亡受體5的單鏈抗體基因，涉及一種基因。提供抗人死亡受體5的單鏈抗體(aDR5-scFv)基因及制備方法與應(yīng)用。所述抗人死亡受體5的單鏈抗體基因，是由連接肽連接抗體的輕鏈(VL)和重鏈(VH)基因建立，所述抗人死亡受體5的單鏈抗體基因由726個堿基組成。一個制備抗人DR5的單克隆抗體的步驟；一個克隆抗體可變區(qū)基因的步驟；一個對獲得的基因片段進(jìn)行測序分析的步驟；一個用連接肽(Linker)連接抗體輕鏈、重鏈可變區(qū)基因的步驟；一個構(gòu)建表達(dá)載體的步驟；一個制備重組抗體的步驟。所述的抗人死亡受體5的單鏈抗體基因在制備抗腫瘤藥物中應(yīng)用。
文檔編號A61K39/395GK101717775SQ200910112798
公開日2010年6月2日 申請日期2009年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月13日
發(fā)明者莊國洪, 張佳鍇 申請人:廈門大學(xué)