專利名稱：一種α-葡萄糖苷酶抑制劑及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種α-葡萄糖苷酶抑制劑及其微生物發(fā)酵制備方法。

背景技術：
糖尿病、肥胖癥和高脂血癥在世界范圍人口中的發(fā)病頻率很高并且繼續(xù)增加。在一般人群中，糖尿病是最慢性的疾病之一，其隨著肥胖和年齡的增多而發(fā)生。雖然有用于治療糖尿病綜合癥所開發(fā)的藥物，但是今天在對糖尿病病人的治療中最具有挑戰(zhàn)的目標仍然是使血糖水平盡可能地接近正常。另外，餐后高血糖癥和高胰島素血癥是發(fā)生糖尿病大血管并發(fā)癥的獨立危險因素。《糖尿病醫(yī)學》中報道，α-葡萄糖苷酶抑制劑存在于小腸微絨毛的α-葡萄糖苷酶，從而抑制進食后的急速上升和其引起的胰島素濃度上升，因能夠抑制人類和人類以外動物的糖，特別是淀粉來源的寡糖、蔗糖代謝，顯示出抑制血糖上升的作用，對改善高血糖癥狀和高血糖所致的肥胖癥、糖尿病等各種疾病很有用。此外，添加α-葡萄糖苷酶抑制劑的食品，適用于代謝異常的患者食用，也適用于健康人作為代謝異常預防食品。
目前已有三種α-葡萄糖苷酶抑制劑應用于臨床，分別為阿卡波糖(Acarbose)，米格列醇(Miglitol)，伏格列波糖(Viglibose)，但是已經發(fā)現這些藥物存在腹部不適，胃腸脹氣，腸鳴音，排氣等消化道反應，偶有腹瀉等副作用，其應用受到了限制(Uchida，R，Nasu，Aet.al Chem..Pharm.Bull 47，187-193，1999)。由于這些限制，尋求新型的α-葡萄糖苷酶抑制劑迫在眉睫。
目前，國內外生產α-葡萄糖苷酶抑制劑大都是從中藥中提取，中藥提取效率較低，成本高，很難產業(yè)化。


發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種α-葡萄糖苷酶抑制劑及其制備方法，該方法能夠解決中藥提取效率低，難于實現產業(yè)化的問題。
本發(fā)明的目的通過以下技術方案來實現一種α-葡萄糖苷酶抑制劑，所述抑制劑為分子量小于1000多肽。
制備所述α-葡萄糖苷酶抑制劑的微生物菌種為玫瑰暗黃鏈霉菌。
所述α-葡萄糖苷酶抑制劑在制備治療糖尿病藥物中的應用。
制備該α-葡萄糖苷酶抑制劑是通過微生物發(fā)酵得到的，其方法步驟如下 (1)菌種活化 制備種子之前采用高氏合成一號固體培養(yǎng)基進行菌種活化，并將活化的菌種轉入斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)積累孢子供種子制備用， 培養(yǎng)基重量組成為可溶性淀粉1.0～3.0％，KNO3 0.01～0.1％，NaCl 0.001～0.05％，K2HPO4 0.01～0.05％，MgSO4·7H2O 0.01～0.05％，FeSO4 0.001～0.005％，瓊脂粉1.2～2.2％，余量為水，pH 7.0～10.0， 所述斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)的條件為pH7.0～10.0，溫度溫度28～35℃，培養(yǎng)時間為5～7d， (2)種子培養(yǎng) 然后將菌種在如下的培養(yǎng)基按所述培養(yǎng)條件進行培養(yǎng) 培養(yǎng)基重量組成為玉米粉1.0～3.0％，可溶性淀粉1.0～3.0％，KNO3 0.1～1.0％，NaCl 0.01～0.05％，K2HPO4 0.01～0.05％，MgSO4·7H2O 0.01～0.05％，FeSO4 0.001～0.005％，余量為水， 種子培養(yǎng)條件為pH7.0～10.0，裝液量為25～50ml/250ml，溫度溫度28～35℃，培養(yǎng)時間為1～2d。
(3)將發(fā)酵生產α-葡萄糖苷酶抑制劑的種子液體接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵， 所述發(fā)酵培養(yǎng)基重量組成為玉米粉1.0～4.0％，黃豆粉0.5～2.0％，可溶性淀粉0.1～1.0％，KNO3 0.5～2.0％，NaCl 0.01～0.05％，K2HPO4 0.01～0.05％，MgSO4·7H2O 0.01～0.05％，FeSO4 0.001～0.005％，CaCO3 0.1～0.35％，余量為水， 發(fā)酵培養(yǎng)的條件為pH7.0～10.0，裝液量為25～50ml/250ml，溫度28～35℃，培養(yǎng)時間4～6d， (4)然后采用常規(guī)的方法，從發(fā)酵培養(yǎng)產物中分離純化得到α-葡萄糖苷酶抑制劑。
本發(fā)明的突出優(yōu)點在于 1、采用從土壤中篩選得到的高產α-葡萄糖苷酶抑制活性的野生菌株作為生產菌株，以玉米粉、玉米漿作為發(fā)酵基料，能夠保證鏈霉菌生產繁殖快，生產的α-葡萄糖苷酶抑制劑無毒、無害，含有對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、α-葡萄糖淀粉酶有很強的抑制率。
2、通過微生物生產酶抑制劑，原料來源簡單，生產成本低，無污染，操作實施方便，可以大大提高生產效率。本發(fā)明發(fā)酵產生次級代謝產物是一種新型的α-葡萄糖苷酶抑制劑，新型α-葡萄糖苷酶抑制劑的出現也為進一步研究α-葡萄糖苷酶等酶活性位點提供了新的工具。

具體實施例方式 以下通過具體實例進一步說明本發(fā)明。
實施例1 (1)菌種活化并將活化的菌種轉入斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)積累大量孢子供種子大量制備用。
培養(yǎng)基重量組成為可溶性淀粉2.0％，KNO3 0.1％，NaCl 0.01％，K2HPO40.01％，MgSO4·7H2O 0.01％，FeSO4 0.001％，瓊脂粉1.8％，余量為水，pH 7.0，培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)時間為7d。
(2)種子培養(yǎng) 將斜面上的孢子用接種環(huán)挑取一環(huán)孢子接到種子培養(yǎng)基中，接種后，將搖瓶分別于26℃、28℃、30℃、32℃、34℃溫度下，160r/min培養(yǎng)，24h，每個溫度設置三個平行實驗。
培養(yǎng)基重量組成為玉米粉2％，可溶性淀粉1.0％，KNO3 0.5％，NaCl 0.05％，K2HPO4 0.05％，MgSO4·7H2 0.05％，FeSO4 0.001％，余量為水。
pH 7.2，裝液量為50ml/250ml。
(3)發(fā)酵培養(yǎng) 發(fā)酵搖瓶為250ml，裝入發(fā)酵培養(yǎng)基50ml，滅菌后，轉接時，首先將三個平行的種子搖瓶混合在一起，而后用5ml移液槍吸取5ml的種子轉移到發(fā)酵搖瓶中，培養(yǎng)自26℃、28℃、30℃、32℃、34℃的種子各接種9個搖瓶，置于相應的溫度條件相下，160r/min培養(yǎng)，5d，6d，7d取三個搖瓶進行檢測。
培養(yǎng)基重量組成為玉米粉2.0％，黃豆粉0.8％，可溶性淀粉0.5％，KNO31.2％，NaCl 0.05％，K2HPO4 0.05％，MgSO4·7H2O 0.05％，FeSO4 0.001％，CaCO30.25％，余量為水，pH8.0。
(4)然后采用常規(guī)的方法，從發(fā)酵培養(yǎng)產物中分離純化新型的α-葡萄糖苷酶抑制劑。
發(fā)酵液離心去除菌體后，通過前述的方法來測定α-葡萄糖苷酶抑制活性，。其結果見表1 表1不同溫度不同培養(yǎng)時間下對α-葡萄糖苷酶的抑制活性
實驗結果分析 溫度在28℃以上較適合α-葡萄糖苷酶抑制劑的生物合成，其中30℃時抑制率達到最高，當培養(yǎng)時間為5d時，次級代謝產物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性達到最高。
實施例2 (1)菌種活化 同實施例1。
(2)種子培養(yǎng) 配制好種子培養(yǎng)基，各種子培養(yǎng)基的初始pH分別為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，滅菌冷卻后。將斜面上的孢子用接種環(huán)挑取一環(huán)孢子接到種子培養(yǎng)基中，將搖瓶分別于30℃，160r/min培養(yǎng)，24h，每個pH值設置三個平行實驗。
培養(yǎng)基重量組成同實施例1。
(3)發(fā)酵培養(yǎng) 發(fā)酵搖瓶為250ml，裝入發(fā)酵培養(yǎng)基50ml，發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值分別為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0滅菌后，轉接時，首先將三個平行的種子搖瓶混合在一起，而后用5ml移液槍吸取5ml的種子轉移到發(fā)酵搖瓶中，培養(yǎng)自pH6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的種子各接種3個搖瓶，置于30℃，160r/min的條件下培養(yǎng)，5d取出搖瓶進行檢測。
培養(yǎng)基重量組成同實施例1。
(4)然后采用常規(guī)的方法，從發(fā)酵培養(yǎng)產物中分離純化新型的α-葡萄糖苷酶抑制劑。
發(fā)酵液離心去除菌體后，按前述方法測定α-葡萄糖苷酶抑制活性。其結果見表1 表1不同初始pH下發(fā)酵液對α-葡萄糖苷酶的抑制活性
實驗結果分析 培養(yǎng)基的初始pH在8.0以上較適合α-葡萄糖苷酶抑制劑的生物合成，其中9.0時抑制率達到最高，次級代謝產物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性達到最高。
實施例3 (1)菌種活化 同實施例1。
(2)種子培養(yǎng) 配制好種子培養(yǎng)基，初始pH值為9.0，種子培養(yǎng)基的裝液量50ml/250ml、將斜面上的孢子用接種環(huán)挑取一環(huán)孢子接到種子培養(yǎng)基中，將搖瓶分別于30℃，160r/min培養(yǎng)，24h，設置三個平行實驗。
培養(yǎng)基重量組成同實施例1。
(3)發(fā)酵培養(yǎng) 配制好發(fā)酵培養(yǎng)基，初始pH為9.0，裝液量分別為20ml/250ml、30ml/250ml、40ml/250ml、50ml/250ml、60ml/250ml、70ml/250ml、80ml/250ml、90ml/250ml、100ml/250ml，滅菌后，轉接時，首先將三個平行的種子搖瓶混合在一起，而后用5ml移液槍吸取5ml的種子轉移到發(fā)酵搖瓶中，各接種3個搖瓶，置于30℃，160r/min的條件下培養(yǎng)，5d取出搖瓶進行檢測。
培養(yǎng)基重量組成同實施例1。
(4)然后采用常規(guī)的方法，從發(fā)酵培養(yǎng)產物中分離純化新型的α-葡萄糖苷酶抑制劑。
發(fā)酵液離心去除菌體后，按前述的方法測定α-葡萄糖苷酶抑制活性。其結果見表1 表1不同裝液量下發(fā)酵液對α-葡萄糖苷酶的抑制活性
實驗結果分析 實驗結果表明，中等程度的通氣條件下，如40ml/250ml，有利于α-葡萄糖苷酶抑制劑的生物合成，過高或者過低的通氣條件都將不利于α-葡萄糖苷酶抑制劑的生物合成。
權利要求
1.一種α-葡萄糖苷酶抑制劑，其特征在于，所述抑制劑為分子量小于1000多肽。
2.制備權利要求1所述α-葡萄糖苷酶抑制劑的微生物菌種為玫瑰暗黃鏈霉菌。
3.權利要求1所述α-葡萄糖苷酶抑制劑在制備治療糖尿病藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種α-葡萄糖苷酶抑制劑及其制備方法，包括如下步驟菌種培養(yǎng)活化，種子培養(yǎng)，菌種接入搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，收集發(fā)酵液，分離純化得到α-葡萄糖苷酶抑制劑。本發(fā)明通過微生物發(fā)酵制備α-葡萄糖苷酶抑制劑，所得的α-葡萄糖苷酶抑制劑不僅可用于降糖藥物的開發(fā)，還為進一步研究α-葡萄糖苷酶等酶活性位點提供了新的工具。
文檔編號A61P3/00GK101724015SQ20091011449
公開日2010年6月9日 申請日期2009年10月30日 優(yōu)先權日2009年10月30日
發(fā)明者梁智群, 陳桂光, 石君連, 張云開, 丁蘇 申請人:廣西南寧智天生物科技有限公司, 廣西大學