專利名稱：1,6-二磷酸果糖治療癲癇并發(fā)癥及預(yù)防癲癇的醫(yī)藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥學領(lǐng)域，尤其是1, 6-二磷酸果糖的治療癲癇并發(fā)癥和預(yù)防癲癇的 醫(yī)藥用途。
背景技術(shù)：
癲癇是一種常見的反復發(fā)作的世界性疑難疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織最新統(tǒng)計，全世 界范圍內(nèi)大約有五千萬人為癲癇病患者?，F(xiàn)有的抗癲癇藥物主要是通過抑制癲癇病灶 的異常放電達到控制或抑制癲癇的發(fā)作的目的。常用的抗癲癇藥物按照結(jié)構(gòu)可分為六 類①乙內(nèi)酰脲類，如苯妥英鈉等；②巴比妥類，如苯巴比妥、撲米酮等；③亞芪胺 類，如卡馬西平等；④琥珀酰亞胺類，如乙琥胺等；⑤側(cè)鏈脂肪酸類丙戊酸鈉等； ⑥苯二氮卓類地西泮、氯硝西泮等。由于這種電活動抑制作用也影響正常神經(jīng)細胞 的電活動，所以現(xiàn)有的抗癲癇藥物多有嚴重的不良反應(yīng)和副作用，比如認識損害，情緒 變化和神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂等。此外，現(xiàn)有抗癲癇藥物僅對70%的患者有效，而且一旦停 止使用藥物，多數(shù)癲癇患者會出現(xiàn)癲癇復發(fā)。癲癇給患者危害是多方面的除癲癇發(fā) 作外，近年來癲癇并發(fā)癥對患者、家庭和社會的危害不斷被認識。癲癇并發(fā)癥包括 生殖內(nèi)分泌功能低下、神經(jīng)精神癥狀包括失眠、學習和工作能力的降低。此外，雖然 癲癇誘發(fā)因素被廣泛認識，但是現(xiàn)有抗癲癇藥物不能預(yù)防癲癇的發(fā)作。
1， 6-二磷酸果糖是存在于體內(nèi)的糖代謝中間產(chǎn)物。它通過調(diào)節(jié)糖代謝中若干酶的 活性產(chǎn)生藥理作用。外源性1, 6-二磷酸果糖可提高細胞內(nèi)三磷酸腺苷和磷酸肌酸的 濃度、促進鉀離子內(nèi)流、增加紅細胞內(nèi)二磷酸甘油酸的含量、抑制氧自由基和組織胺 釋放等多種藥理作用，能減輕機體因缺血、缺氧造成的損害，尤其是對缺血性心臟病 更顯出良好的保護作用。目前1， 6-二磷酸果糖鈉鹽、鎂鹽、鈣鹽用于休克、改善冠 心病的心絞痛、急性心肌梗死和心律失常以及心力衰竭的心肌缺血。但是關(guān)于1.6-二 磷酸果糖或者其鹽在治療癲癇并發(fā)癥及預(yù)防癲癇的醫(yī)藥用途還未見報道。 本發(fā)明公開的1, 6-二磷酸果糖在治療癲癇并發(fā)癥及預(yù)防癲癇的醫(yī)藥用途，可克服現(xiàn) 有抗癲癇藥物存在的上述不足，今后開發(fā)成藥物，將為患者、家庭和社會做出重要貢 獻。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供1, 6-二磷酸果糖治療癲癇并發(fā)癥及預(yù)防癲癇 的醫(yī)藥用途，以解決現(xiàn)有技術(shù)中的難題。
本發(fā)明首先提供1， 6-二磷酸果糖、其前藥或者其藥學上可接受的鹽在制備預(yù)防 癲癇的藥物，根治癲癇的藥物，治療癲癇并發(fā)癥的藥物，或者改善現(xiàn)有抗癲癇藥物療所述l，6-二磷酸果糖藥學上可以接受的鹽，是指化合物帶負電荷的部分，例如磷 酸根，與正電荷的堿例如銨，或者堿土金屬例如鈉、鉀、鈣、鎂、錳形成的一鹽、二 鹽或者三鹽，或者與帶正電荷的有機堿例如甲胺、二甲胺、三甲胺所成的鹽。還可以 是由化合物帶正電荷的部分，與具有相反電性的帶負電荷的有機或者無機酸，例如鹽 酸、氫溴酸、硫酸、三氟乙酸、村檬酸或者馬來酸的酸根加成的鹽。
本發(fā)明所述的1，6-二磷酸果糖、其前藥或藥學上可以接受的鹽還包括這些化合物 的水合物，例如結(jié)構(gòu)式(I)的果糖-1, 6-二磷酸三鈉鹽八水合物。
1,6-二磷酸果糖分子結(jié)構(gòu)中具有多個手性中心，因此該化合物可以是外消旋的混 合物、單獨的對映異構(gòu)體、單獨的非對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體的混合物，對于本領(lǐng) 域技術(shù)人員，所有這些異構(gòu)體是可以預(yù)期的。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解1,6-二磷酸果 糖的外消旋的混合物、單獨的對映異構(gòu)體、單獨的非對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體的混 合物，其前藥或藥學上可以接受的鹽的預(yù)防癲癇，根治癲癇，治療癲癇并發(fā)癥，或者 改善現(xiàn)有抗癲癇藥物療效的作用，也屬于本發(fā)明要求保護的范圍內(nèi)。
特別的，預(yù)防癲癇是指預(yù)防癲癇病人的癲癇發(fā)作及癲癇病的發(fā)生和發(fā)展。雖然 目前癲癇誘發(fā)因素被廣泛認識，但現(xiàn)有抗癲癇藥物無預(yù)防癲癇的作用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，1, 6-二磷酸果糖對急性癲癇發(fā)作和慢性癲癇的形成均有顯著的預(yù)防作用。
目前癲癇為 一反復發(fā)作的世界性疑難疾病，其根本原因與現(xiàn)有抗癲癇藥物僅能控 制癲癇發(fā)作，不能治療疾病本身， 一旦停藥癲癇癥狀可再次出現(xiàn)，其發(fā)作程度甚至強 于以前。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，1， 6-二磷酸果糖可消除癲癇癥狀，即停藥后癲癇不再發(fā)作，這 一發(fā)現(xiàn)支持本化合物用于臨床治愈癲癇疾病。1， 6-二磷酸果糖這一獨特作用可能與其 可維持腦中GSH正常水平和神經(jīng)保護有關(guān)。
癲癇并發(fā)癥包括生殖功能低下、神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂和神經(jīng)精神障礙，如失眠、心理 障礙、認知能力低下、學習和工作能力的降低。癲癇給患者、家庭和社會帶來的危害 不僅是癲癇發(fā)作的本身，實際上癲癇病并發(fā)癥如生殖內(nèi)分泌功能低下或紊亂及神經(jīng)內(nèi) 分泌功能紊亂和神經(jīng)精神障礙引發(fā)的認知能力低下、心理障礙等對患者、家庭和社會 的危害更大。但是現(xiàn)有抗癲癇藥物不僅不能改善癲癇并發(fā)癥，反而可誘發(fā)和加重這些 并發(fā)癥。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)1) 1, 6-二磷酸果糖可顯著改善癲癇動物的性功能增加性行為和升高性激素水平；2) 1， 6-二磷酸果糖可明顯糾正癲癇動物的神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂 癲癇動物的腎上腺皮質(zhì)功能允進，而1, 6-二磷酸果糖可減輕腎上腺重量和降低血中 糖皮質(zhì)激素水平；3) 1, 6-二磷酸果糖可改善癲癇動物的精神行為障礙癲癇動物攻 擊行為顯著的增加，1, 6-二磷酸果糖可完全消除癲癇動物的攻擊行為。這些作用支持 了 1， 6-二磷酸果糖治療癲癇病并發(fā)癥的臨床應(yīng)用。
改善現(xiàn)有癲癇藥物療效是指降低現(xiàn)有抗癲癇藥物的毒副作用和提高現(xiàn)有抗癲癇藥 物的抗癲癇療效。現(xiàn)有抗癲癇藥物的顯著缺陷為不能預(yù)防、不能治愈癲癇，還有嚴 重副作用。1, 6-二磷酸果糖具有預(yù)防和治愈癲癇的活性，從而可改善現(xiàn)有抗癲癇藥物 的臨床療效。本發(fā)明進一步證明，1, 6-二磷酸果糖還可從以下兩方面改善現(xiàn)有抗癲 癇藥物的療效1) 1， 6-二磷酸果糖不僅能降低它們的抗癲癇有效劑量，而且可進一 步提高它們的抗癲癇效果；2)1， 6-二磷酸果糖可直接對抗現(xiàn)有抗癲癇藥物的毒性。 所述預(yù)防癲癇的藥物，根治癲癇的藥物，治療癲癇并發(fā)癥的藥物，或者改善現(xiàn)有抗癲 癇藥物療效的藥物，包含治療有效量的1, 6-二磷酸果糖、其前藥或者其藥學上可接 受的鹽，以及藥學上可以接受的賦形劑或者載體。
所述的"治療有效量的l,6-二磷酸果糖、其前藥或者藥學上可以接受的鹽"可單 獨，或者與其它具有抗癲癇作用的化合物一起，用于制備上述藥物。
所述其它具有抗癲癇作用的藥物可以是臨床上已用的抗癲癇藥物，如①乙內(nèi)酰脲 類苯妥英鈉等；②巴比妥類苯巴比妥、撲米酮等；③亞芪胺類卡馬西平等； 琥珀酰亞胺類乙琥胺等；⑤側(cè)鏈脂肪酸類戊酸鈉等；⑥苯二氮卓類地西泮、氯 硝西泮等。優(yōu)選的，1，6-二磷酸果糖、其前藥或者藥學上可以接受的鹽與苯巴比妥、 苯妥英鈉、丙戊酸鈉、卡馬西平、乙琥胺、地西泮聯(lián)合應(yīng)用于制備所述的藥物。
所述包含治療有效量的1， 6-二磷酸果糖、其前藥或者其藥學上可接受的鹽的預(yù) 防癲癇的藥物，根治癲癇的藥物，治療癲癇并發(fā)癥的藥物，或者改善現(xiàn)有抗癲癇藥物 療效的藥物可以是口服制劑，也可以是非口服給藥途徑制劑。
所述的口服制劑包括片劑、口服液、丸劑、滴丸、膠囊、顆粒劑、口服緩釋劑、 口服控釋劑、口服靶向制劑。
所述的非口服制劑包括注射劑、粉針、大輸液、栓劑。
本文所定義的治療有效量,是指可對人和/或動物產(chǎn)生功能或者活性的且可被人和 /或動物接受的量。本文所定義的藥學上可接受的賦形劑或者載體，是指用于治療給藥 的賦形劑或者載體，它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。治 療有效量的1，6-二磷酸果糖、其前藥或者藥學上可以接受的鹽的用量介于 0.001-500mg/kg體重/天之間，任何介于上述范圍內(nèi)的用量皆為本發(fā)明的有效量。優(yōu) 選的，本發(fā)明的化合物的用量介于0.05-300mg/kg體重/天之間；更優(yōu)選的，本發(fā)明的化合物的用量介于0. 01-100mg/kg體重/天之間。所述的"治療有效量的1，6-二磷酸 果糖、其前藥或者藥學上可以接受的酸加成的鹽"可用于預(yù)防癲癇、根治癲癇、治療 癲癇并發(fā)癥，或者改善現(xiàn)有抗癲癇藥物療效的單一用藥或者聯(lián)合用藥治療。本領(lǐng)域技 術(shù)人員能夠理解，在實際給藥時的用量可高于或者低于上述劑量范圍。針對某一對象 (如哺乳動物或者人)的"治療有效量"和具體治療方案可受諸多因素的影響，包括 給藥對象的年齡、體重、 一般情況、性別、飲食、給藥時間、疾病進程以及收治醫(yī)生 的判斷等。
本發(fā)明所述的藥物可以是適合口服給藥的劑型例如片劑或者膠囊，也可以是例如 以無菌溶液、懸浮液或者乳液用于胃腸外注射(包括靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、血管內(nèi) 或輸注)，也可以是例如以栓劑直腸給藥。如沒有特別說明，通常本發(fā)明所述的藥物可 以以常規(guī)方法使用本技術(shù)領(lǐng)域已知的常規(guī)賦形劑或者載體制備。
藥學上可以接受的固體賦形劑或者載體包括淀粉、玉米淀粉、乳糖、葳糖、碳 酸鈉、磷酸鈣、磷酸二醇、碳酸鈣、藻酸、微晶纖維素、明膠；藥學上可以接受的液 體載體包括例如無菌水、聚乙二醇、非離子表面活性劑(如羥丙基纖維素)和油例如 玉米油、花生油、芝麻油、橄攬油或者液體石蠟；只要適合活性成分，即l，6-二磷酸 果糖、其前藥或者藥學上可以接受的酸加成的鹽的特性和所需要的特定給藥方式。在 制備所述藥物中通常使用的佐劑也可以被包括，例如調(diào)味劑、色素、防腐劑(如乙基 或丙基-羥基苯甲酸酯)和抗氧化劑例如維生素E、維生素C、 BHT和BHA。
片劑可以不包衣或者包衣以改變它們的崩解和隨后活性成分在胃腸道內(nèi)的吸收或 者增強它們的穩(wěn)定性和/或外觀，在所述后兩種情況下可以使用本技術(shù)領(lǐng)域已知的常規(guī) 包衣劑和方法。
用于口服的藥物還可以是硬膠囊的形式，其中活性成分與惰性固體賦形劑例如碳 酸鈣、磷酸鈣、微晶纖維或者高嶺土，或是軟膠囊的形式，其中活性成分與水或者油 例如玉米油、花生油、芝麻油、橄欖油或者液體石蠟混合。
適于注射的藥物包括無菌水溶液、分散液或者無菌粉(用于臨時制備無菌注射液 或者分散液)。在所有情況下，這些形式必須是無菌的且必須是流體易于從注射器排出。 在制備和儲存條件下必須是穩(wěn)定的，且必須能防止微生物如細菌和真菌的污染和影響。 載體可以是溶劑或者分散介質(zhì)，例如水、醇、它們的適當混合物和植物油。
口服緩釋劑包括以一定比例混合的速釋部分和緩釋部分。速釋部分包括了未包衣 的單次給藥有效劑量的活性成分和常規(guī)賦形劑或載體。緩釋部分包括包衣的多次給藥 有效劑量的活性成分和必要的賦形劑或載體。緩釋部分的包衣材料可以是水凝膠、生 物降解聚合物或離子交換樹脂。水凝膠可以選自①天然膠，例如明膠、果膠、海藻酸 鹽、角叉菜膠、瓜耳豆膠、西黃蓍膠等；②纖維素衍生物，例如甲基纖維素(MC)、乙基纖維素(EC)、羥乙基纖維素(HEC)、羥丙甲基纖維素(HPMC)、羥丙基纖維素(HPC)、 羧甲基纖維素(CMC)等；③非纖維素多糖，例如甲殼素、脫乙酰殼多糖、半乳糖甘露 聚糖等；④合成聚合物，例如聚乙烯醇、卡波姆(Carbomer);⑤改性淀粉，例如預(yù)凝 膠淀粉等。生物降解聚合物可以選自聚乳酸、聚氨基酸類、聚羧乙酸、聚丙烯酸類等。 離子交換樹脂可以選自微孔型離子交換樹脂、大孔型離子交換樹脂、均孔型離子交換 樹脂和大孔網(wǎng)狀吸附樹脂。可以利用水凝膠制備親水凝膠骨架片的緩釋制劑。可以利 用生物降解聚合物包埋活性成分，制成微囊、微球，用熔融法或直接壓片法制備溶蝕 性骨架片的緩釋制劑。還可以利用離子交換樹脂制備不溶性骨架片的緩釋制劑?；旌?好的速釋部分和緩釋部分可以以常規(guī)方法制備成片劑、膠囊劑、混懸劑等口服緩釋制 劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，速釋部分和緩釋部分的比例、起到緩釋作用的載體的 種類和用量、其他賦形劑或載體的選擇，都是為了達到理想的釋放速率和治療效果。


圖1是1,6-二磷酸果糖二鈉鹽分子結(jié)抅示意圖。
圖2是1,6-二磷酸果糖預(yù)防戊四氮所致大鼠急性癲癇的作用，圖中FBP表示1,6-二磷 酸果糖，PTZ表示戊四氮，Latency of seizures (s)表示癲癇發(fā)作潛伏期(秒)。 圖3是l,6-二磷酸果糖預(yù)防戊四氮化學點燃的作用，圖中Saline表示生理鹽水，F(xiàn)BP 表示1,6-二磷酸果糖，PTZ表示戊四氮，Seizures score表示癲癇級別。 圖4是1, 6-二磷酸果糖消除自發(fā)性癲癇的作用，圖中Conl表示生理鹽水對照組，F(xiàn)BP1 和FBP2表示1，6-二磷酸果糖治療組，Seizures numbers/Day表示癲癇發(fā)作次數(shù)/天。 圖5是1， 6-二磷酸果糖升高腦中還原型谷胱甘肽水平的作用，圖中Nonnal表示正常 動物組，Pilo 2h表示注射毛果蕓香堿后兩小時，10d表示注射毛果蕓香堿發(fā)生SE10 天(還未出現(xiàn)癲癇)，Epilepl表示癲癇初期(出現(xiàn)自發(fā)性癲癇10-15天)，Epilep2表 示癲癇后期(出現(xiàn)癲癇50-60天)，GSH levels (nmol/mg proten)表示還原性谷胱甘肽 水平(納摩爾/毫克蛋白質(zhì))。
圖6是l，6-二磷酸果糖提高苯妥英鈉和丙戊酸抗戊四氮誘導大鼠急性癲癇的作用，圖 中PTZ表示戊四氮，PHT表示苯妥因鈉，VPA表示丙戊酸鈉，F(xiàn)BP表示1，6-二磷酸果糖， latency of Seizures (s)表示癲癇發(fā)作潛伏期(秒)。
圖7是1,6-二磷酸果糖提高苯妥英鈉和丙戊酸抗毛果蕓香堿誘導大鼠急性癲癇的作 用，圖中Pilo表示生理鹽水對照組，PHT表示苯妥因鈉，VPA表示丙戊酸鈉，F(xiàn)BP表 示1,6-二磷酸果糖，Duration of Seizures (h)表示癲癇持續(xù)時間(小時)，Seizures score表示癲癇級別。
圖8是1，6-二磷酸果糖提高丙戊酸抗海藻酸誘導大鼠急性癲癇的作用，圖中KA表示 海藻酸，VPA表示丙戊酸鈉，F(xiàn)BP表示1,6-二磷酸果糖，Seizures score表示癲癇級別，Duration of Seizures (h)表示癲癇持續(xù)時間(小時)。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為本發(fā)明僅限于這些說明。
具體實施方式
中出現(xiàn)的英文簡稱及其中文含義如下 FBP: 1,6-二磷酸果糖 PTZ:戊四氮 TLE:顳葉癲癇 GSH:還原性谷胱甘肽 PHT:苯妥因鈉 VPA:丙戊酸鈉 KA:海藻酸 GSH:還原性谷胱甘肽 (一)1、 6-二磷酸果糖可預(yù)防癲癇病發(fā)生
首先，用一種急性動物模型觀測了 1, 6-二磷酸果糖的預(yù)防癲癇作用，而后用2 種世界上公認的慢性癲癇模型——戊四氮化學點燃模型(PTZ kindling model)和毛果 蕓香堿誘導的顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy, TLE)模型研究了 1, 6-二磷酸果 糖的預(yù)防癲癇作用。1， 6-二磷酸果糖對以上3種癲癇模型的癲癇發(fā)作均有顯著的預(yù)防 作用。
實施例l戊四氮(PTZ)急性癲癇模型
方法
成年雄性SD大鼠(180-200克)分為PTZ模型組和1, 6-二磷酸果糖預(yù)防治療組， 每組動物數(shù)9只。模型組動物，接受正常飲水，而給藥組每只動物每天飲用0.5%1,6-二磷酸果糖水溶液30mL (相當于0.25克/公斤/每天)，連續(xù)給藥7天。于第7天，所 有動物腹腔注射戊四氮(50mg/kg)，并觀測癲癇發(fā)作情況包括癲癇發(fā)作潛伏期(秒)和 癲癇發(fā)作動物數(shù)，不發(fā)生癲癇動物其癲癇潛伏期按5分鐘(600秒)計數(shù)。
結(jié)果見圖2
模型組的9只動物均出現(xiàn)癲癇大發(fā)作，給藥組動物的9只動物有6只無癲癇發(fā)作， 3只發(fā)生癲癇的潛伏期延長。.
研究結(jié)果不僅證明1，6-二磷酸果糖能有效預(yù)防戊四氮誘導的急性癲癇，而且證實 飲用方式也是l，6-二磷酸果糖的有效給藥途徑。所以，在后面的慢性癲癇實驗中，1,6-二磷酸果糖釆用這種給藥途徑。 實施例2 PTZ化學點燃模型 方法
成年雄性SD大鼠(180-200克)分為癲癇模型組和1, 6-二磷酸果糖大小劑量預(yù)防 治療組，動物數(shù)每組10只，模型組動物接受正常飲水，每天腹腔注射PTZ(40mg/kg)， 連續(xù)6天；然后戊四氮劑量改為每天35mg/kg，直到所有動物連續(xù)3天至少有2次癲 癇大發(fā)作，最后一次戊四氮劑量為30tng/kg。 1, 6-二磷酸果糖小劑量組動物每只每天 飲用0.5%1,6-二磷酸果糖水溶液30mL沐當于0.25克/公斤/每天)，大劑量組飲用 1%的1, 6-二磷酸果糖溶液(相當于0.5克/公斤/每天)，于給l， 6-二磷酸果糖的第 二天，注射PTZ， PTZ劑量同模型組。
結(jié)果
1,6-二磷酸果糖大小劑量均能顯著對抗PTZ的點燃作用。最后一次腹腔注射 35mg/kg PTZ后，模型組動物均出現(xiàn)癲癇大發(fā)作，這種癲癇發(fā)作可被低劑量的PTZ (30tng/kg)進一步加??；1,6-二磷酸果糖兩個劑量組的動物的癲癇等級明顯低于模型 組。結(jié)果見圖3。
實施例3毛果蕓香堿誘導的顳葉癲癇(TLE)模型
方法
成年雄性SD大鼠(180-200g)腹腔注射毛果蕓香堿(300mg/kg)。出現(xiàn)前肢陣攣(3 級癲癇)或站立和趺倒(4級癲癇)并維持2小時的動物定義為該動物有SE (status epilepticus)。 2小時后，SE動物腹腔注射安定(5mg/kg)以提高動物存活率。于第二 出現(xiàn)SE的動物隨機分為模型組和l, 6-二磷酸果糖預(yù)防治療組 模型組動物接受正常 飲水，而l, 6-二磷酸果糖組動物飲用05%的1， 6-二磷酸果糖溶液(相當于0.5克/ 公斤/每天)，當模型組9(W動物出現(xiàn)自發(fā)性癲癇時，停止l, 6-二磷酸果糖的治療。在 停止l， 6-二磷酸果糖治療后繼續(xù)觀測癲癇活動3天。于給毛果蕓香堿的第7天開始， 每天從早上8點到下午6點觀察各組動物的癲癇行為。
結(jié)果
模型動物(n-6 )所有動物在10到40夭內(nèi)出現(xiàn)幾種癲癇行為包括面部陣攣、肌
肉抽搐、前肢陣攣或站立和趺倒。出現(xiàn)第一次前肢陣攣定義為第一次自發(fā)性癲癇。出 現(xiàn)第一次自發(fā)性癲癇的時間為21±2.7天。而且隨著時間的延長，動物每天癲癇的發(fā)作 次數(shù)不斷增加。1、 6-二磷酸果糖組(n-6)未出現(xiàn)自發(fā)性癲癇。為排除1， 6-二磷酸果 糖的急性抗癲癇作用，于停止1， 6-二磷酸果糖后繼續(xù)觀測癲癇活動一周，結(jié)果未見
9任何動物出現(xiàn)癲癇發(fā)作。以上結(jié)果證明，1， 6-二磷酸果糖可顯著預(yù)防顳葉癲癇的形成。
(二) 1、 6-二磷酸果糖可治愈癲癇病
毛果蕓香堿誘導的顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy, TLE)模型模擬臨床顳葉 癲癇臨床癥狀、腦的形態(tài)改變和發(fā)病機制，在世界范圍內(nèi)被廣泛用于尋找有效的抗癲 癇藥物。所以，發(fā)明人用此模型觀測了l， 6-二磷酸果糖能否治愈癲癇。
實施例4 消除癲癇癥狀 方法
自發(fā)性癲癇動物分為生理鹽水對照組和l, 6-二磷酸果糖治療組，每組動物6只。 動物飲用生理鹽水或0.5%1,6-二磷酸果糖(每只動物每天30mL)連續(xù)4周。每隔2 天觀測一次癲癇行為，直到停藥后的第12天。 結(jié)果見圖4
1， 6-二磷酸果糖逐漸降低癲癇的發(fā)作次數(shù)，到第9天完全阻止癲癇發(fā)作，停止用 藥后的第1天至第12天里未見癲癇復發(fā)。
與此形成明顯對比的是已知現(xiàn)有抗癲癇藥物對本模型無這種作用，停止給藥的 第二天癲癇發(fā)作會出現(xiàn)顯著的反彈，癲癇發(fā)作次數(shù)甚至高于給藥前。發(fā)明人的研究結(jié) 果證明，1, 6-二磷酸果糖可治愈本模型的癲癇，這完全不同于現(xiàn)有的抗癲癇藥物。這 一作用支持了 1, 6-二磷酸果糖治愈癲癇的臨床應(yīng)用前景。
實施例5 升髙腦中還原型谷胱甘肽水平
還原性谷胱甘肽(GSH)為哺乳動物腦中最重要的抗氧化應(yīng)激損傷物質(zhì)，對神經(jīng)功 能的維持和保護具有非常重要的作用，近年發(fā)現(xiàn)GSH還是一種重要的內(nèi)源性抗癲癇物 質(zhì)。大量研究表明，癲癇病人腦中的還原性谷胱甘肽(GSH)水平嚴重缺乏，這種缺乏 不僅與癲癇發(fā)作有關(guān)，也可能與癲癇病人的各種并發(fā)癥有關(guān)。所以，發(fā)明人研究了 1, 6-二磷酸果糖對癲癇動物腦中GSH水平的影響。
用毛果蕓香堿誘導的顳葉癲癇模型，研究了腦中GSH含量隨癲癇發(fā)生和發(fā)展的變 化及FBP對GSH含量變化的影響。
方法
動物分為正常動物組(生理鹽水組)；給毛果蕓香堿后的4時間點組分別為注射 毛果蕓香堿后兩小時(Pilo2h)，發(fā)生SE10天后(還未出現(xiàn)癲癇，10d)，癲癇初期(出現(xiàn) 自發(fā)性癲癇10-15天，Epilepl)和癲癇后期(出現(xiàn)癲癇50-60天，Epilep2); 1, 6-二磷 酸對正常動物治療組和1, 6-二磷酸果糖對癲癇初期動物治療組及對癲癇后期動物治 療組。動物通過飲水接受1，6-二磷酸果糖(每只每天飲用30mL0.5W的1，6-二磷酸果糖)，連續(xù)給藥7天。
GSH水平由高效液相色譜(HPLC)方法測定。儀器HP-1100型高效相色譜儀。色譜 條件色譜柱Eclipse AAA 150 x 4. 6 mm, 3.5戶；檢測波長338 nm,參比波長390 腦；溫度40°C;流速1. 5 mL/min;流動相-A 40 mM Na2HP04, pH 7. 8, 流動相-B乙 腈/甲醇/水45/45/10。對照品還原型的谷胱甘肽(GSH,純度大于98%,購于SIGMA 公司，參照氨基酸衍生物的標準制備方法，將GSH與OPA試劑反應(yīng)制成O. 5mg/mL的對 照品標準液。標準曲線的制備取濃度為0.5rag/mL的對照品標準液分別以 0.1， 0. 2, 0. 5, 5. 0,10. 0, 20. 0， 30. OpL進樣，在上述色譜條件下分析。以峰面積(Y)為 縱坐標和樣品濃度(X， ng)為橫坐標作圖得標準曲線并計算回歸方程為Y=1378.9397X + 4.5802,其樣品濃度在0. 2到6. Opg之間呈良好線型關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9999。 精密度試驗取濃度為0.5rag/mL的GSH對照品液連續(xù)進樣6次，每次5pL,在前述色 譜條件下測定GSH的峰面積，其峰面積的RSD為2.14%。穩(wěn)定性試驗取濃度為0. 5mg/mL 的GSH對照品液分別在O、 1、 6、 8、 12小時進樣，每次5(iL,在前述色譜條件下測定 GSH的峰面積，其峰面積的RSD為4.56%(n=5)。樣品的制備及分析將樣品采用對照 品相同方法制備成樣品供試液在上述色譜條件下測定其吸收度并從回歸方程為中計算 樣品中GSH含量。
結(jié)果見圖5。
研究結(jié)果證明，注射毛果蕓香堿后腦中GSH水平呈現(xiàn)一個動態(tài)變化過程兩小時 后GSH水平與正常動物無明顯差異；第10天即自發(fā)性癲癇發(fā)作前GSH水平顯著升高； 在癲癇初期GSH水平降到正常水平；在癲癇后期GSH水平繼續(xù)降到正常水平的1/2。 FBP不影響正常動物腦中GSH水平；有趣的是FBP對于癲癇動物，在完全消除癲癇癥 狀的同時，可將腦中GSH水平保持在正常水平。由于GSH對維持神經(jīng)的功能和形態(tài)起 著至關(guān)重要的作用、同時又是一個有效的內(nèi)源性抗癲癇物質(zhì)，以上結(jié)果證明維持腦中 GSH正常水平為FBP根治癲癇的作用機制之一。
3. 1，6-二轔酸果糖對神經(jīng)的保護作用
癲癇是一個不斷發(fā)展和惡化的疾病，最后可稱為難治性癲癇。神經(jīng)損傷引起的腦 神經(jīng)功能紊亂或退化為癲癇疾病發(fā)展和惡化的重要原因。所以，發(fā)明人進一步研究了 1,6-二磷酸果糖對兩種致癲癇物質(zhì)——毛果蕓香堿和海藻酸誘導的神經(jīng)損傷的保護作 用。
實施例6 1，6-二磷酸果糖對毛果蕓香堿誘導的神經(jīng)損傷的保護作用
方法
成年雄性SD大鼠(200-230g)分為毛果蕓香堿癲癇對照組和1,6-二磷酸果糖處理組。動物分別接受生理鹽水和1, 6-二磷酸果糖(500rag/kg， ip)， l小時后腹腔注射 毛果蕓香堿(300mg/kg)。監(jiān)測各組癲癇活動6小時，于24小時對存活動物取腦，用 Nissl染色(染正常神經(jīng)細胞，可反映神經(jīng)細胞丟失情況)和Fluoro-Jade B熒光染 色(染退化和損傷神經(jīng)細胞)反映神經(jīng)細胞檢測神經(jīng)損傷情況。 結(jié)果
癲癇組6只動物有過癲癇等級大于5、嚴重長時間癲癇而且24小時后仍然存活， 腦皮層神經(jīng)細胞出現(xiàn)嚴重丟失，損傷程度為2. 8±0. 2級。這些動物的海馬CA4和齒狀 腦回區(qū)的神經(jīng)細胞也有嚴重神經(jīng)損傷，損傷和退化細胞數(shù)為282±33。 1,6-二磷酸果糖 藥物組中未出現(xiàn)癲癇的動物，大腦皮層和海馬的神經(jīng)未見任何異常(n=5) ; 4只動物 有過中等程度的癲癇，大腦皮層神經(jīng)細胞損傷程度顯著低于癲癇對照組，損傷程度僅 為0.9±0.2級。這些動物的海馬CA4和齒狀腦區(qū)回的神經(jīng)細胞損傷也遠低于對照組， 平均損傷細胞數(shù)為78±23。以上結(jié)果表明，1，6-二磷酸果糖對毛果蕓香堿誘導的神經(jīng) 細胞損傷有明顯的保護作用。
實施例7 1，6-二磷酸果糖對海藻酸誘導的神經(jīng)損傷的保護作用
方法
成年雄性SD大鼠(200-230g)分為海藻酸(10mg/kg,ip)對照組和l， 6-二磷酸果 糖(500mg/kg， ip)處理組。方法同前。
結(jié)果
海藻酸組(n-9)， Fluoro-JadeB熒光染色顯示海馬神經(jīng)細胞出現(xiàn)嚴重損傷(50% 動物出現(xiàn)在CAl/2區(qū)，100y。動物出現(xiàn)在CA3/4區(qū))，平均損傷細胞數(shù)為61±13 Nissl 染色顯示CA3/4區(qū)的細胞丟失清晰。1，6-二磷酸果糖對海藻酸誘導的神經(jīng)細胞損傷具 有顯著的保護作用(n-10 ): 5只動物未出現(xiàn)任何神經(jīng)細胞損傷，5只動物出現(xiàn)輕度神 經(jīng)細胞損傷，平均損傷細胞數(shù)為15±3。 (三)1、 6-二磷酸果糖治療癲癇病并發(fā)癥
實施例8用毛果蕓香堿誘導的顳葉癲癇(temporal lobe印ilepsy， TLE)模型研究 了 1， 6-二磷酸果糖對癲癇病并發(fā)癥的影響
方法
按前述方法用毛果蕓香堿誘導長時間癲癇大發(fā)作，而后動物飼養(yǎng)于正常條件下， 待自發(fā)性癲癇的形成。于給毛果蕓香堿的第7天，觀察動物的自發(fā)性癲癇行為，觀測 時間為每天從早上8點到下午6點。所有動物發(fā)生穩(wěn)定的自發(fā)性癲癇，出現(xiàn)第一次自 發(fā)性癲癇的時間為給毛果蕓香堿后的第20. 5±3天。癲癇的動物分為生理鹽對照組(11=6)
12和l, 6-二磷酸果糖治療組(n=6)。動物分別飲用生理鹽水和0.5%的1,6-二磷酸果 糖，連續(xù)3周。于給藥的第2周開始觀測動物的性行為和動物精神行為，每周一次， 共2次。于最后一次觀測后，取血樣測定睪酮和皮質(zhì)酮水平，并觀測腎上腺的重量。按 常規(guī)方法觀測動物的性行為。由于本模型癲癇動物的攻擊行為非常顯著以至于需要單 獨詢養(yǎng)，所以用2只動物處于同一籠中1小時內(nèi)發(fā)生的打斗次數(shù)為指標觀測動物精神 行為變化及1, 6-二磷酸果糖對癲癇動物精神行為障礙的改善作用。
結(jié)果
毛果蕓香堿誘導的顳葉癲癇(temporal lobe印ilepsy， TLE)模型動物與同齡動 物相比，攻擊行為顯著增加而性行為明顯缺損(15min內(nèi)跨騎數(shù)正常動為5. 8 ± 3. 2; 癲癇動物為0. 8 ± 1. 0 )、血漿睪酮水平顯著低下(正常動物為3. 6 ± 1. 18 p mol/ml; 癲癇動物為1. 52 ± 0. 26 p mol/ml )、但血漿皮質(zhì)酮水平明顯升高(正常動物為n. 23 ±1.43ng/dl;癲癇動物為25. 3士2.7ng/dl); —致地，動物的腎上腺重量/體重指 數(shù)顯著高于正常動物。1, 6-二磷酸果糖可顯著對抗癲癇動物的上述改變，以上參數(shù) 基本保持在正常水平。
(四)1、 6-二磷酸果糖改善現(xiàn)有抗癲癇藥物療效 1.提高抗癲癇效果
丙戊酸鈉和苯妥英鈉為臨床上常用的抗癲癇藥物，長期用藥均可產(chǎn)生明顯的毒副 作用。由于藥物的毒副作用常常與藥物用量成正比，所以我們研究了 1， 6-二磷酸果 糖是否能降低丙戊酸鈉(VPA)和苯妥英鈉(PHT)的抗癲癇有效劑量。苯妥因鈉(PHT)和 丙戊酸鈉(VPA)均為第一代抗癲癇藥物，在臨床上仍然被廣泛應(yīng)用，尤其丙戊酸鈉還 是目前世界上使用最為廣泛的抗癲癇藥物之一。 實施例9戊四氮模型 方法
成年雄性SD大鼠(200-230克)分為以下組別生理鹽水對照組；PHT低劑量組 (60mg/kg, ip)、 PHT高劑量組(80mg/kg, ip); VPA低劑量組(200mg/kg, ip )、 VPA髙
劑量組(300mg/kg， ip ); PUT低劑量+ FBP (500mg/kg， ip)組、VPA低劑量+ FBP (500mg/kg,ip)組。然后連續(xù)觀察20分鐘動物的癲癇行為包括癲癇發(fā)作潛伏期或/
和癲癇級別、癲癇持續(xù)時間和死亡情況。
結(jié)果見圖6
戊四氮(PZT)癲癇組所有9只動物均有陣攣性癲癇，癲癇發(fā)作潛伏期為76±6秒， 癲癇持續(xù)時間為170±54秒。苯妥因鈉小劑量和大劑量均未見明顯的抗癲癇作用；而1，6-二磷酸果糖與苯妥因鈉合用時，苯妥英鈉小劑量能顯著預(yù)防癲癇的發(fā)作，延長癲癇 發(fā)作的潛伏期和縮短癲癇發(fā)作持續(xù)的時間。丙戊酸鈉小劑量和大劑量組(11=8)均有嚴重 癲癇發(fā)作，大劑量的丙戊酸能明顯延長癲癇發(fā)作的潛伏期、降低癲癇等級和縮短癲癇
持續(xù)時間；而1, 6-二磷酸果糖與丙戊酸鈉合用時，丙戊酸鈉小劑量就可完全預(yù)防癲 癇發(fā)作。丙戊酸鈉小劑量未見明顯的抗癲癇作用，而大劑量有顯著明顯的抗癲癇作用， 其中8只動物中有2只無癲癇發(fā)作，6只動物的癲癇發(fā)作時間明顯延長而癲癇持續(xù)時 間縮短；丙戊酸與1，6-二磷酸果糖合用時，小劑量就有顯著的抗癲癇作用，表現(xiàn)為癲 癇發(fā)作潛伏期明顯延長而癲癇持續(xù)時間顯著縮短，而且10只動物有4只無癲癇發(fā)作。 實施例IO毛果蕓香堿(Pilo)模型 方法
生理鹽水對照組(Pilo);PHT組(80mg/kg, ip)、 PHT + FBP(500mg/kg, ip)組; VPA組(300mg/kg， ip)、 VPA+ FBP ( 500mg/kg, ip)組。每組動物數(shù)8-10只。然后連 續(xù)觀察6小時動物的癲癇行為包括癲癇發(fā)作潛伏期或/和癲癇級別、癲癇持續(xù)時間和死 亡情況。 結(jié)果見圖7
癲癇組10只動物均產(chǎn)生癲癇，癲癇發(fā)作潛伏期為14±1分鐘，并持續(xù)至少5小時， 癲癇等級為5.5±0.4級，4只動物在24小時內(nèi)死亡。苯妥因鈉未見明顯的抗癲癇作用， 1， 6-二磷酸果糖與苯妥因鈉合用時，苯妥英鈉幾乎能完全預(yù)防癲癇的發(fā)作。丙戊酸鈉 (0.3g/kg, 11=9)能降低癲癇等級和癲癇持續(xù)時間，其中9只動物中有6只發(fā)生癲癇并 有1只動物死亡；FBP與丙戊酸鈉合用幾乎可完全預(yù)防癲癇的發(fā)作。 實施例ll海藻酸(KA)模型 方法
生理鹽水對照組(KA)、 VPA ( 300mg/kg, ip)組、VPA + FBP ( 500mg/kg， ip)組。 每組動物數(shù)8-IO只。腹腔注射(ip)生理鹽水或各種藥物l小時后，腹腔注射戊四氮 (50fflg/kg)或毛果蕓香堿(300mg/kg)或海藻酸(10tng/kg)。然后連續(xù)觀察6小時動物
的癲癇行為包括癲癇發(fā)作潛伏期或/和癲癇級別、癲癇持續(xù)時間和死亡情況。 結(jié)果見圖8
海藻酸誘導的癲癇組10只動物中有9只有嚴重癲癇(等級大于或等于3), 1只動 物有輕微的癲癇(節(jié)律性點頭)，其癲癇發(fā)作的潛伏期為38±4分鐘，癲癇等級為3.7 ±0.3，癲癇持續(xù)時間為3. 7±0. 2小時。沒有動物死亡。丙戊酸組(n-8)均有嚴重癲癇 發(fā)作，但能明顯延長癲癇發(fā)作的潛伏期、降低癲癇等級和縮短癲癇持續(xù)時間；而1,6-二磷酸果糖與丙戊酸鈉合用時，丙戊酸鈉抗癲癇效果顯著加強。 2.降低毒性
丙戊酸鈉的一個顯著的急性毒性為給藥數(shù)分鐘內(nèi)動物會出現(xiàn)煩躁和抽搐現(xiàn)象，所 以發(fā)明人研究了 1, 6-二磷酸果糖對丙戊酸這種急性毒性的影響。 實施例12 方法
成年雄性SD大鼠(200-230克)分為以下組別生理鹽水對照組；VPA (400mg/kg， ip)組;FBP( 500mg/kg， ip)+ VPA組。每組動物數(shù)10只。VPA( 400mg/kg， ip) 組動物腹腔注射(ip)生理鹽水1小時后，給VPA; FBP ( 500mg/kg, ip) + VPA組動 物腹腔注射l， 6-二磷酸果糖30分鐘后，給丙戊酸鈉。生理鹽水組動物接受2次同等 體積的生理鹽水。給丙戊酸鈉即刻觀測動物的行為改變。 結(jié)果
生理鹽水對照組動物行為正常，而丙戊酸組動物于給藥5分鐘內(nèi)全部出現(xiàn)短暫的 抽搐行為，1， 6-二磷酸果糖可完全對抗高劑量的丙戊酸引起的抽搐行為。證明1) 1， 6-二磷酸果糖不僅能降低苯妥因鈉和丙戊酸鈉的抗癲癇有效劑量，而且可進一步提 高它們的抗癲癇效果；2)1， 6-二磷酸果糖可完全對抗丙戊酸
權(quán)利要求
1.1，6-二磷酸果糖、其前藥或者其藥學上可接受的鹽在制備預(yù)防癲癇的藥物，根治癲癇的藥物，治療癲癇并發(fā)癥的藥物，或者改善現(xiàn)有抗癲癇藥物療效的藥物中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的1， 6-二磷酸果糖、其前藥或者其藥學上可接受的鹽的 應(yīng)用，其特征在于所述l, 6-二磷酸果糖藥學上可接受的鹽包括鈉鹽、鉀鹽、鉤鹽、 鎂鹽、錳鹽、銨鹽或者胺鹽。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的l， 6-二磷酸果糖、其前藥或者其藥學上可接受的鹽的 應(yīng)用，其特征在于預(yù)防癲癇是指預(yù)防癲癇病人的癲癇發(fā)作及癲癇病的發(fā)生和發(fā)展。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的l， 6-二磷酸果糖、其前藥或者其藥學上可接受的鹽的 應(yīng)用，其特征在于改善現(xiàn)有癲癇藥物療效是指降低現(xiàn)有抗癲癇藥物的毒副作用和提 高現(xiàn)有抗癲癇藥物的抗癲癇療效。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的l, 6-二磷酸果糖、其前藥或者其藥學上可接受的鹽的 應(yīng)用，其特征在于所述癲癇并發(fā)癥包括生殖功能低下、神經(jīng)內(nèi)分泌功能紊亂和神經(jīng) 精神障礙。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的1, 6-二磷酸果糖、其前藥或者其藥學上可接受的鹽的 應(yīng)用，其特征在于所述神經(jīng)內(nèi)分泌功能紊亂和神經(jīng)精神障礙是指失眠、心理障礙、 認知能力低下、學習和工作能力的降低。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6任一所述的1， 6-二磷酸果糖、其前藥或者其藥學上可接 受的鹽的應(yīng)用，其特征在于所述藥物包含治療有效量的1， 6-二磷酸果糖、其前藥 或者其藥學上可接受的鹽，以及藥學上可以接受的賦形劑或者載體。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的1， 6-二磷酸果糖、其前藥或者其藥學上可接受的鹽的 應(yīng)用，其特征在于所述藥物還包括其它抗癲癇化合物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的1， 6-二磷酸果糖、其前藥或者其藥學上可接受的鹽的 應(yīng)用，其特征在于所述抗癲癇化合物選自苯巴比妥、苯妥英鈉、丙戊酸鈉、卡馬西 平、乙琥胺、地西泮中的一種或幾種。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的1, 6-二磷酸果糖、其前藥或者其藥學上可接受的 鹽的應(yīng)用，其特征在于所述藥物包括片劑、口服液、丸劑、滴丸、膠囊、顆粒劑、 口服緩釋劑、口服控釋劑、靶向制劑、注射劑、粉針、大輸液或栓劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了1，6-二磷酸果糖、其前藥或者其藥學上可接受的鹽在制備預(yù)防癲癇的藥物，根治癲癇的藥物，治療癲癇并發(fā)癥的藥物，或者改善現(xiàn)有抗癲癇藥物療效的藥物中的應(yīng)用；其中，所述1，6-二磷酸果糖藥學上可接受的鹽包括鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽、錳鹽、銨鹽或者胺鹽。所述藥物包含治療有效量的1，6-二磷酸果糖、其前藥或者其藥學上可接受的鹽，以及藥學上可以接受的賦形劑或者載體；還可以包括其它抗癲癇化合物。所述藥物可以是片劑、口服液、丸劑、滴丸、膠囊、顆粒劑、口服緩釋劑、口服控釋劑、靶向制劑、注射劑、粉針、大輸液或栓劑。
文檔編號A61K31/7024GK101590066SQ200910115588
公開日2009年12月2日 申請日期2009年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月26日
發(fā)明者連曉媛 申請人:連曉媛