專利名稱：葛根素在制備P2X₃介導疼痛/神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鎮(zhèn)痛藥物用途發(fā)明領(lǐng)域，尤其是涉及可用于防治疼痛的葛根素 在制備P2X3介導疼痛/神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物中的應用。
背景技術(shù)：
疼痛是大多數(shù)疾病具有的共同癥狀，是人類共有而個體差異4艮大的一種不 愉快的感覺。由于疼痛給人們造成極大痛苦，據(jù)2001年第二期《國際疼痛學 會通迅》報道美國106次國會通過一項決議，宣布從2001年元月一日起的 十年為"疼痛控制和研究的十年"(Decade of Pain Control and Research )。由此 說明各國對疼痛研究的重視。根據(jù)疼痛時程可將疼痛分為急性痛(生理性痛) 和慢性痛(病理性痛)。其中慢性痛包括炎癥痛、神經(jīng)病理痛、癌癥痛，是 臨床上常見主訴之一。由于慢性痛機理復雜，其治療成為臨床上的難題。神經(jīng) 病理痛是指由神經(jīng)系統(tǒng)損傷或疾病所引起的疼痛綜合征，常常表現(xiàn)為自發(fā)性的 疼痛，對機械、冷、熱等傷害性剌激產(chǎn)生痛覺過敏；對非傷害性剌激產(chǎn)生觸誘 發(fā)痛、痛覺倒錯和燒灼痛等神經(jīng)病理性痛覺過敏。由于慢性痛持續(xù)時間長，對 人身心健康危害較大，其研究成為疼痛領(lǐng)域的熱點和重點。燒傷是嚴重的創(chuàng)傷， 燒傷疼痛也是最嚴重的急性痛之一，燒傷后伴隨炎癥反應導致炎癥痛。疼痛往 往是燒傷患者的第一反應， 一般在燒傷后最初1小時內(nèi)，創(chuàng)面出現(xiàn)不同程度的 疼痛或者沒有明顯的疼痛，此后的疼痛往往受以下因素的影響如燒傷深度、 病程*階段、治療措施和患者的個體因素等。燒傷后疼痛是由于燒傷部位皮 膚的傷害性感受器受刺激，并伴隨著炎癥反應和神經(jīng)損傷所引起的，因此它的 治療需要結(jié)合傷害性感受處理和神經(jīng)病理處理。
噪呤類物質(zhì)三磷酸腺苷(ATP)作為重要的信使物質(zhì)參與痛覺信息傳遞。 嘌呤(Purine)受體分為噤呤1和嘌呤2 (Purine 1， Purine 2; Pl， P2 )受體， ATP及其類似物作用于P2受體。P2受體分為配體門控性離子通道型受體(P2X 受體)和G蛋白偶聯(lián)型受體(P2Y受體)。P2X受體有七種亞型(P2Xw)。英 國"自然"雜志報道ATP作用的P2X3受體(P2X受體的一種亞型)特異性地在 感覺傳入的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元克隆表達。疼痛、傷害性剌激使損傷細胞、應激 細胞以及感覺神經(jīng)末梢本身釋放大量ATP， ATP及其作用的P2X受體涉及痛 覺及傷害性信息在初級感覺神經(jīng)元的傳遞，其中主要是同聚性P2X3受體參與 初級感覺神經(jīng)元的痛覺及傷害性信息傳遞?；蚯贸齈2X3受體的小鼠減小了 對福爾馬林致痛試驗的兩相反應。P2X3受體介導神經(jīng)病理痛的痛覺傳遞。神經(jīng) 病理痛剌激時，P2X3受體和P2X3mRNA表達增加，感覺神經(jīng)元P2X3受體介導ATP激活的門控通道電流明顯增強。應用P2X3受體反義寡核苷酸及RNA干擾 技術(shù)可使炎性痛大鼠模型背根神經(jīng)節(jié)的P2X3受體水平下調(diào)，進而明顯減輕 P2X3受體激動劑a，P-meATP和福爾馬林所致的足底傷害性反應。這些發(fā)現(xiàn)為 神經(jīng)病理痛的發(fā)病機理提供了新的依據(jù)。申請人實驗室以前的研究也顯示燒傷 可導致背根感覺神經(jīng)元P2X3受體表達增加。目前國外已有研究生產(chǎn)P2X3受體 拮抗劑(如R03 )用于臨床治療疼痛的報道。
葛根素是從豆科植物野葛及甘葛船艮中提取的一種黃酮苷，臨床上主要用 于心血管疾病和糖尿病的治療。文獻報道[周軍，方素萍，齊云,等.葛#^湯對佐劑 性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)炎液炎癥介質(zhì)的影響.中國實驗方劑學雜志，2001，7(3):29-31.] 以葛根為主藥的葛根湯具有抗炎作用。該文獻提示從葛根中提取的葛根素可能 具有抗傷害性反應和影響痛覺的作用，但目前尚無葛根素直接具有鎮(zhèn)痛作用的 報道，臨床上也無葛根素通過鎮(zhèn)痛作用機制進行疼痛治療的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的在于提供葛根素的第一個新用途，即葛根素在制備治 療慢性痛(即神經(jīng)病理痛)的藥物中的應用。
本發(fā)明的第二個目的在于提供葛根素的第二個新用途，即葛根素在制備治 療急性痛(即燒傷#^乍痛)的藥物中的應用。
本發(fā)明的第三個目的在于提供葛根素的第三個新用途，即葛根素作為P2X3 噪B^^桐吉抗劑在制備治療涉及P2X3受體介導神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理機制防
治藥物中的應用。
葛根素可減輕神經(jīng)病理痛(慢性痛)及燙傷痛大鼠的痛(急性痛)行為反 應。葛根素在治療急性痛/慢性痛的作用機理為阻斷P2X3受體介導的疼痛信 息傳遞，產(chǎn)生防治疼痛的作用。
為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面以實驗和結(jié)果來證明葛根素的用途。 本發(fā)明分為葛根素對神經(jīng)病理痛作用和燒傷痛作用兩部分。 一、材料和方法
(一)葛根素對P2X3受體介導神經(jīng)病理痛作用研究 1.1動物和分組
雄性SD大鼠，220-250g，南昌大學醫(yī)學院實驗動物科學部提供。將大鼠隨 機分成5組，每組12只。實驗分組I (假手術(shù)組)(sham); II(單獨葛根素組) (Puerarin); III(坐骨神經(jīng)'隄性壓迫性損傷組X Chronic constriction injury , CCI); IV (坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+葛根素組)(CCI + puerarin); V(正常組) (control )。葛根素注射液溶解于生理鹽水，濃度為50mg/ml。 I組每天腹腔注 射生理鹽水(4ml/kg); II組每天腹腔注射葛根素注射液(4ml/kg); III組(假 手術(shù)組)切開皮膚暴露坐骨神經(jīng)，不結(jié)扎神經(jīng)即縫合皮膚。IV組CCI術(shù)后第1 天開始每天腹腔注射葛根素注射液(4ml/kg)。
41.2藥物與試劑
葛根素，山東方明藥業(yè)股份有限公司(生產(chǎn)批號0804171 );硫噴妥鈉， 上海新亞藥業(yè)有限公司(生產(chǎn)批號050101 ); SP試劑盒，原位雜交試劑盒及 DAB試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)；P2X3抗體購自美國CHEMICON INTERNATIONAI/^司。三磷酸腺苷(adenosine 5-triphophate， ATP ) ， sigma, DRG細胞外液配制，pH7.4。 a、卩亞曱三磷酸腺苷(a，PmethyleneATP, a,p-meATP ) sigma， DRG細胞外液配制，pH7.4。三硝基三磷酸腺苷(TNP~"ATP )， sigma， DRG細胞外液配制，pH7.4。玻璃孩t電極所充內(nèi)液(internal solution)成份為 (讓ol.L國l): KC1 140，CaCl2 l，MgCl22，HEPES IO，EGTAII， ATP4。電極電阻 2 ~ 5MQ。灌流用之DRG細胞外液(external solution)成份為(mmol.L-l): NaCl 150， KC1 5， CaCl2 2.5， MgCl21, HEPES 10， D-Glucose 10。 1.3主凌—義器
BME-403 VonFrey細絲(中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學工程研究所)；BME410C 型全自動熱痛刺激儀(中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學工程研究所)；消毒紗布、手巾、 棉簽等，碘酒及75%酒精，手術(shù)器械包剪刀、眼科小彎鑷、血管鉗、絲線、 有齒鑷、神經(jīng)剝離子等。
膜片鉗實驗裝置及相關(guān)配件CEZ-2400型全細胞膜片鉗放大器(日本 Nihon-Kohden), SBR--I型二線示波器(汕頭超聲電子儀器廠)，95-B玻璃孩i電 極拉制儀(華中科技大學同濟醫(yī)學院分子及細胞神經(jīng)生物學研究室)，分析天 平(上海天平儀器廠)，刺激器(SEN-7203, Nihon-Kohden,日本)，隔離器(SS-202J, Nihon-Kohden，日本)，LMS—2B型二道生理記錄儀(成都儀器廠)，玻璃微電 極(GG-17，華西醫(yī)科大學儀器修造廠)，倒置顯微鏡(Olympus,日本)，HY—Z 調(diào)速多用恒溫振蕩器(國華電器有限/>司)。 1.4 'ft性神經(jīng)病理痛模型制作
用硫噴妥鈉麻醉大鼠(30mg/kg,腹腔注射)，在無菌條件下于大鼠右大腿 后外側(cè)切開皮膚，鈍性分離出坐骨神經(jīng)，以4-0含鉻腸線輕度結(jié)扎坐骨神經(jīng)， 共結(jié)扎4道，每個結(jié)之間間隔約lmm。結(jié)扎過程中可見坐骨神經(jīng)被結(jié)扎處直徑 略減小，并伴有右后肢一過性抽動，并注意不要結(jié)扎太緊以至于完全阻斷神經(jīng) 外周的血流。大鼠術(shù)后單籠飼養(yǎng)，分別于術(shù)前(0d)及術(shù)后1,3，5，7，9， 11,14d測
量機械縮足反射閾值和熱縮足反射潛伏期(測定時間恒定于每日io : 00-14 : oo:
室溫維持在22士0.5 。C)。
1.5神經(jīng)病理痛大鼠機械痛敏檢測
用BME-403 VonFrey細絲(中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學工程研究所)測定 才幾械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT)。置大鼠于透明的 有機玻璃箱(22xl2x22cm3 )中，有機玻璃箱底為lxlcm2的鐵絲網(wǎng)。術(shù)后大鼠 放置于實驗室祠養(yǎng)，測試前將大鼠放在有機玻璃箱中適應15min。折力分別為0.13， 0.20, 0.33， 0.60， 1.30, 3.60， 5.00， 7.30, 9.90， 20.1g，折力^20.1g時均記為 20.1g。從最小折力開始，4根試驗10次，直至出現(xiàn)縮足反射次數(shù)大于5/10，即 50%反應閾值(即引起10次試驗中5次反應的值。重復三次，取其平均值)。 每次刺激間隔時間至少大于15s，并待刺激引起的反應(如舔足、甩腿等)完全 消失。
1.6神經(jīng)病理痛大鼠熱痛敏檢測
將有機玻璃箱置于3mm厚的玻璃板上，用BME-410C型全自動熱痛刺激儀 (中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學工程研究所)照射大鼠足底。熱輻射刺激4義照射大 鼠足底至出現(xiàn)抬腿回避時間為熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency, TWL)。切斷時間為30秒，以防止組織灼傷。 1.7大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)P2X3受體的表達
五組實驗大鼠于術(shù)后第14天腹腔注射疏噴妥鈉(30mg/kg)深麻醉，經(jīng)升主動 脈灌注4°/。多聚曱醛(0. lmol/L PB， pH7. 4)，分離出大鼠L4、 L5段DRG，取出固 定，ii^4 %多聚曱醛/0.lmPBS(含O. 1 % DEPC)中固定2小時，用20 %蔗糖脫水， 在恒冷箱切片機上行冰凍切片，厚度為15拜.放入4%的多聚甲醛中保存。每 只大鼠的DRG切片隔5張取一張二步法免疫組織化學染色測定DRG神經(jīng)元細 胞P2Xs受體的表達，DAB顯色。與此同時對DRG切片進行原位雜交測定P2X3 受體mRNA的表達，雜交前所用液體和器皿都經(jīng)0.1。/。的DEPC嚴格處理。冰凍 切片在0.05%的11202室溫下作用30分鐘，以去除內(nèi)源性過氧化物酶，胃蛋白酶 消化l-2分鐘，37。C預雜交液中孵育2小時，棄去預雜交液，轉(zhuǎn)入雜交液于水 浴中37。C過夜。次日，用梯度枸櫞酸鹽水(2XSSC,0.5XSSC和0,2XSSC)沖洗 切片各15分鐘。入37 。C封閉液30分鐘，轉(zhuǎn)入生物素化的地高辛中37 。C孵育30 分鐘，0.05。/。的PBS沖洗15分鐘，相繼在SABC-POD和生物素化的過氧化物酶 中各孵育30分鐘，DAB顯色。結(jié)果用圖像分析系統(tǒng)軟件(武漢天平影傳4支術(shù)有限 公司，HMIAS-2000高清晰彩色醫(yī)學圖文分析系統(tǒng))對P2X3陽性神經(jīng)元進行灰度 分析。
1.8葛根素對CCI大鼠DRG神經(jīng)元ATP或a，j3-meATP激活電流的影響 1.8.1標本制備
大鼠DRG神經(jīng)元標本的分離方法概述如下將大鼠擊昏、斷頭后迅速切 開背部皮膚，沿脊柱兩側(cè)剪斷與^目連的肋骨，取出胸腰段脊柱，由脊柱正中 剖開成兩半，置02飽和之DMEM液(Dubecco，s Modified Eagle's medium) 內(nèi)，pH值7.40，溶液滲透壓為340mOsm/kg。由剖開的推管內(nèi)側(cè)取出L4、 L5神 經(jīng)節(jié)及相連的神經(jīng)根(腹、背根)和脊神經(jīng)，在解剖顯微鏡下用精細角膜剪及 游絲鑷仔細剪除相連神經(jīng)和周圍結(jié)締組織被膜，將清除干凈的DRG盡可能地剪 碎,置培養(yǎng)瓶內(nèi)并力口入trypsin (typeIII， sigma) 0.5 g/L， collagenase (type IA, sigma) 1.0 g/L在恒溫振蕩水浴器(35°C， 80次/分)中孵育20~30分鐘，完成后力口入適量的Soya beam trypsin inhibitor (type II-s， sigma)以終止酶的消4lM乍 用。將上述酶和機械分離的DRG細胞轉(zhuǎn)移至35mm培^J^內(nèi)，放在倒置顯微鏡 的載物臺上換液靜置30min。然后應用全細胞式膜片鉗技術(shù)記錄葛根素對ATP 或a,P-meATP激活電流的影響。 1.8.2全細胞膜片鉗實驗操作程序
(1) 仔細檢查實驗系統(tǒng)各儀器間的連接和初始設置。
(2) 打開電源開關(guān)。
(3) 電極安裝接好參比電極，充灌玻璃電極，然后將其裝于電極夾持器上。 注意電極充灌不要過滿；裝電極之前將手接觸屏蔽罩排出身體上的靜電。
(4) 相界電位補償和電極電阻的測量在"搜索"方式下將微電極入液，調(diào)節(jié) 相界電位補償，并根據(jù)脈沖電壓方波引起的電流響應幅值測量電極電阻。
(5) 細胞封接調(diào)節(jié)微操縱器使微電極尖端接近細胞表面，并對微電極內(nèi)施 一負壓，形成吉歐封接。
(6) 快電容補償調(diào)節(jié)快電容補償，使輸出信號中不含快電容電流成分。
(7) 吸破細胞膜將工作方式切換到"鉗壓"擋。在電極與細胞之間形成高阻 (1—10GQ)封接后，進一步將膜吸穿。置鉗制電壓(H.P)于"60mV，膜電流
應用低通波(lkHz，-3dB)。
(8) 慢電容補償調(diào)節(jié)慢電容補償，使輸出信號中不舍隄電容電流成分。 串聯(lián)電阻補償調(diào)節(jié)串聯(lián)電阻補償至不產(chǎn)生震蕩為止。
全細胞膜片鉗記錄所用的儀器為CEZ-2400型膜片鉗放大器 (Nihon-Kohden,日本)。在電極與細胞膜之間形成高阻(1 ~ 10GQ)封接后 進一步將膜吸穿，調(diào)節(jié)電容和串聯(lián)電阻補償。置保持電壓(holding potential, HP) 于-60mV，膜電流應用低通濾波(lkHz，-3dB )。實驗結(jié)果由二道記錄儀(LMS-2B， 成都)描記。ATP濃度-效應曲線按照下列公式繪制。I=Imax/[l+(EC50/C)n]式中 C為ATP濃度，I為標準化后的ATP激活電流，Imax為標準化后的ATP激活電流 最大值，ECso或Kd為ATP產(chǎn)生最大效應的半效濃度，n為Hill系數(shù)。給藥系通 過微操縱器移動快速換藥裝置的排管進行，每管直徑為0.2皿，管口距記錄的 細胞約100nm。實驗中需進行藥物胞內(nèi)透析時系通過插入玻璃微電極里的微管 注入藥物。實驗在室溫20 30。C范圍進^f亍。 1.9實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理
各組數(shù)據(jù)以x士sem表示。多組間比較用單因素方差分析,繼以最小顯著差 法(LSD)行兩兩比較。用SPSSll.O軟件包進行數(shù)據(jù)處理。尸O.05為差異有顯著 性。
(二)葛根素對P2X3受體介導燒傷痛作用研究 2.1動物和分組
雄性SD大鼠，220-250g， 60只，南昌大學醫(yī)學院實-驗動物科學部提供，隨機分組。I組為足部皮膚假燙組；1I組為葛根素注射+足部皮膚I度或淺II度 燒傷組；m組為生理鹽水+足部皮膚I度或淺II度燒傷組；IV組為背部皮膚假 燙組，V組為葛根素注射+背部皮膚I度或淺II度燒傷組；YI組為生理鹽水十
背部皮膚i度或淺n度燒傷組。葛根素注射液溶解于生理鹽水，濃度為
50mg/ml。 III組和VI組在燙傷前0.5h尾靜脈注射4ml/kg生理鹽水，每天l次至實驗 結(jié)束；II組和V組燙傷前0.5h^C靜脈注射葛根素注射液4ml/kg，每天一次至實驗 結(jié)束；I組和IV組(假燙組)分別將足部或背部皮膚浸在37 。C溫水中8s。 2.2藥物與試劑
葛根素，山東方明藥業(yè)股份有限^>司(生產(chǎn)批號0804171 );乙醚，天津 市大茂化學試劑廠(生產(chǎn)批號050801 );疏噴妥鈉，上海新亞藥業(yè)有限公司 (生產(chǎn)批號050101 ); SP試劑盒，DAB試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)； P2X3抗體(CHEMICON INTERNATIONAL,美國)；S100抗體(武漢博士德^> 司)。
2.3主要—義器
BME-403 Von Frey細絲(中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學工程研究所)；BME410C 型全自動熱痛刺激儀(中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學工程研究所)；膜片鉗裝置及相 關(guān)配件CEZ-2400型全細胞膜片鉗放大器(Nihon-Kohden,日本)，SBR—I型 二線示波器(汕頭超聲電子儀器廠)，95-B玻璃微電極拉制儀(華中科技大學 同濟醫(yī)學院分子及細胞神經(jīng)生物學研究室)，分析天平(上海天平儀器廠)，刺 激器(SEN-7203， Nihon-Kohden,日本)，隔離器(SS-202J， Nihon-Kohden，日本)， LMS—2B型二道生理記錄儀(成都儀器廠)，玻璃微電極(GG-17,華西醫(yī)科 大學儀器修造廠)，倒置顯微鏡(Olympus, Japan), HY—Z調(diào)速多用恒溫振蕩 器(國華電器有限公司)等。 2.4燒傷模型制作與確定 2.4.1燒傷才莫型制作 2.4丄1足部淺II度燙傷大鼠模型
用乙醚麻醉大鼠后，將大鼠右后足部浸入70 。C水中5s或8s，燙傷后單籠飼 養(yǎng)，分別于燙傷前(0h)及燙傷后1，24，48,72，96， 120, 144h測量右后足部機械 縮足反射閾值和熱縮足反射潛伏期(室溫維持在22i0.5 。C)。 2.4丄2背部淺II度皮膚燒傷大鼠模型
用乙醚麻醉大鼠后，將大鼠背部皮膚剪去毛發(fā)后浸入70 。C水中5s或8s,燙傷 面積大約30%，形成背部皮膚淺II度燒傷大鼠模型，燙傷后單籠飼養(yǎng)，創(chuàng)面暴露， 不做任何處理。
2.4.2 I度和淺II度燒傷大鼠的確定
I度燒傷大鼠的皮膚浸入70 。C水中5s后,15分鐘左右可以觀察到有紅斑和 輕微水腫形成，病理切片HE染色證實為I度燒傷。淺II度燒傷大鼠皮膚浸入
870。C水中8s后，15分鐘左右可以觀察到有紅斑和輕微水腫形成，3小時后可以看
到有水皰形成，病理切片HE染色證實為淺II度燒傷。燒傷大鼠在處死之前沒
有明顯感染發(fā)生。
2.5足部燒傷大鼠機械痛敏測定
用BME-403 Von Frey細絲測定枳"喊縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT)。置大鼠于透明的有機玻璃箱(22 xl2 x22 cm3)t，有機玻璃 箱底為lxlcm2的鐵絲網(wǎng)。術(shù)后大鼠放置于實驗室飼養(yǎng)，測試前將大鼠放在有 機玻璃箱中適應15 min。折力分另，J為0.13，0.20，0.33，0.60， 1.30，3.60，5.00， 7.30，9.90,20.1g。從最小折力開始，每根試驗10次，直至出現(xiàn)縮足反射次數(shù)大約5 /10,即50%反應閾值(即引起10次試驗中5次反應的值)。最大折力為20.1g， 大于此值時記為20.1g。每次試驗至少間隔15 s,并待刺激引起的反應(如舔足、 甩腿等)完全消失。 2.6足部燒傷大鼠熱痛敏測定
將有機玻璃箱置于3 mm厚的玻璃板上,用BME-41 OC型全自動熱痛刺激儀 照射大鼠足底。熱輻射刺激儀照射大鼠足底至出現(xiàn)抬腿回避時間為熱縮足反射 潛伏期(thermal withdrawal latency, TWL)。切斷時間為25秒，以防止組織灼傷。 2.7背部燒傷大鼠皮膚神經(jīng)末梢P2X3受體表達實驗
燙傷大鼠每天尾靜脈注射葛根素或生理鹽水5ml/kg,連續(xù)3天后，各組大 鼠腹腔注射硫噴妥鈉(30mg/kg)深麻醉，剪取大鼠背部燒傷皮膚，大小為 1.5-2cm2，取出固定,石蠟包埋。免疫組化測定時橫斷切片，片厚4nm。 二步法免 疫組織化學染色，DAB顯色。每只大鼠的皮膚隔5張取連續(xù)二張切片， 一張切 片做皮膚神經(jīng)末梢P2X3受體表達測定，另 一張切片做皮膚神經(jīng)末梢S100表達測 定。結(jié)果用圖像分析系統(tǒng)軟件(武漢天平影像技術(shù)有限公司，HMIAS-2000高清晰 彩色醫(yī)學圖文分析系統(tǒng))分析P2X3陽性神經(jīng)元灰度。 2.8實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理
各組數(shù)據(jù)以x ± "w表示。多組間比較用單因素方差分析，繼以最小顯著差 法(LSD)行兩兩比較。用SPSSll.O軟件包進行數(shù)據(jù)處理。PO.05為差異有顯著 性。
二、結(jié)果
(一)葛根素對P2X3受體介導的神經(jīng)病理痛作用的研究結(jié)果
各組大鼠術(shù)后均未見肢體運動障礙和自殘現(xiàn)象。 l.l行為學研究
1.1.1神經(jīng)病理痛大鼠熱痛敏檢測
坐骨神經(jīng)被結(jié)扎4天后神經(jīng)病理通模型基本形成，III組(坐骨神經(jīng)慢性壓 迫性損傷組；Chronic constriction injury, CCI)和IV組(坐骨神經(jīng)慢性壓迫性 損傷+葛根素組；CCI+ puerarin )的熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency,TWL)較I組(假手術(shù)組，sham)、 II組(單獨葛根素組，puerarin)和V組(正常對 照組，control)顯著性下降(pO.Ol),而I組(sham)、 II組(puerarin)和V組
(control)之間相比較無顯著性差異(pX).05)。 IV組(CCI+puerarin)熱縮足反 射潛伏期與I組(sham)、 II組(puerarin)和V組(control)之間相比較仍下降 (p<0.01)，但與III組(CCI)之間比較顯^性增加(p<0.01 )。 14d后，IV組(CCI+ puerarin)熱縮足反射潛伏期與V組(control)之間相比較無顯著性意義 (p>0.05),而III組(CCI)仍較低(p<0.01)。見圖1。 1.1.2斗經(jīng)病理痛大鼠機械痛敏檢測
坐骨神經(jīng)被結(jié)扎4d^神經(jīng)病理通模型基本形成，III組(Chronic constriction injury , CCI)和IV組(CCI+ puerarin)與I組(sham)、 II組(puerarin)和V組
(control)相比，其才幾械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT) 顯著性下降(pO.Ol)，而I組(sham)、 II組(puerarin)和V組(control)之間相比 較無顯著性差異(pX).05)。坐骨神經(jīng)被結(jié)扎7d后，雖IV組(CCI + puerarin)與 V組(control)相比，其機才成縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT)仍低(p<0.01),但III組(CCI)比V組(control)的械縮足反射閾值 (mechanical withdrawal threshold, MWT)更4氐(p<0.01),而IV組(CCI + puerarin) 與ffl組(CCI)之間比較，枳4成縮足v^射閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT)顯著性增加(pO.Ol)。見圖2。 l丄3大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)P2X3受體的表達變化
術(shù)后14d，用免疫組織化學方法測定大鼠L4、 Ls手術(shù)側(cè)背根神經(jīng)節(jié) (DRG)P2X3受體的表達。每只大鼠背根神經(jīng)節(jié)L4、 Ls段切片中隔5張取一張切 片，用圖像分析系統(tǒng)軟件分析P2X3陽性神經(jīng)元的灰度變化。I組(假手術(shù)組， sham)、 II組(單獨葛根素組，Puerarin)、 III組(坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷組， CCI)、 IV組(坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+葛根素組，CCI +puerarin )、 V組(正 常組，control)的灰度值分別為:112.52±13.59、 115.35±16, 21 、 169.25±23.46、 137.27±17.24、 111.12±12.85。 I組、II組、V組之間P2X3受體表達無顯著性差 異(pX).05); m組DRG的P2X3受體的表達較I組、II組、V組明顯增加
(p〈0.01); IV組DRG的P2X3受體的表達較I組、II組、V組高(p〈0.05)，但 和m組相比仍較低(p<0.05 )。見圖3 。 1.1.4大鼠背根神經(jīng)+(DRG)P2X3受體mRNA的表達變化
術(shù)后14d，采用原位雜交方法測定大鼠U、 Ls段手術(shù)側(cè)背根神經(jīng)節(jié) (DRG)P2X3受體mRNA的表達。每只大鼠L" Ls背根^經(jīng)節(jié)切片中隔5張取一 張切片,用圖像分析系統(tǒng)軟件分析P2X3陽性神經(jīng)元的灰度變化。與免疫組織化 學實驗結(jié)果非常相似，I組(假手術(shù)組，sham)、 n組(單獨葛根素組，Puerarin)、 m組(坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷組，CCI)、 IV組(坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷十 葛根素組，CCI + puerarin)、 V組(正常組，control)的灰度值分別為122.95±15.24、 124.28±14.82、 185.62±26.48、 138.52±31.68、 123.57±9.65。 I組、 II組、IV組、V組之間P2X3受體表達無顯著性差異(p>0.05); III組組DRG的 P2X3受體的表達較I組、II組、V組明顯增加(pO.Ol ); IV組DRG的P2X3受 體的表達較V組低(p<0.05)。見圖4。
1.1.5葛根素對大鼠DRG神經(jīng)元ATP或a,P-meATP激活電流的影響
實驗在各實驗組大鼠新鮮分離的L4/L5手術(shù)側(cè)即右側(cè)DRG細胞上進行， 分離的細胞呈圓形或橢圓形，實驗細胞胞體直徑在25-40 jim之間。多數(shù)細胞 的胞體一側(cè)可見到巻曲的軸突殘根。
實驗分為I組(假手術(shù)組，sham)、 II組(單獨葛根素組，puerarin)、 III 組(坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷組，CCI)、 IV組(坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+葛 根素組，CCI + puerarin )、 V組(正常組，control )。實驗共檢測I組36個細 胞，1I組37個細胞，ni組39個細胞，IV組40個細胞，V組38個細胞，其中 I組88.9% (32/36)， II組89.2%(33/37)， III組87.2%(34/39), IV組87.5%(35/40), V組86.8% (33/38) DRG神經(jīng)元對細胞外加ATP ( 1-1000 pmol/L )敏感。ATP-激活電流(IAW)顯示快失敏和慢失敏兩種形式的內(nèi)向電流(即盡管激動劑持 續(xù)存在且濃度不變，但激活電流上升到達頂峰之后，其幅值隨時間呈指數(shù)性的 逐步衰減直至一穩(wěn)定值)。五組DRG神經(jīng)元lATP的完全恢復時間均約為4-6min, 但CCI組較其它四組DRG神經(jīng)元對同一濃度的ATP產(chǎn)生的lATP明顯增加，且 隨著ATP濃度增加ATP-激活電流增加更明顯(P0.05)，其它四組之間沒有顯著 性差異(P>0.05 )。 P2X3受體激動劑a， P-meATP( 10拜ol/L )-激活電流在I 、 II 、 IV、 V組產(chǎn)生極小的內(nèi)向電流，而在CCI組為一具有明顯去敏感的內(nèi)向電流 (PO.Ol)。各組DRG神經(jīng)元ATP激活電流效應也表明神經(jīng)病理痛大鼠DRG神 經(jīng)元細胞ATP激活電流和I、 II、 V組比明顯增強，葛根素用藥組和I、 II、 V組相比較雖然有所增加，但無顯著性差異(P〉0.05),見圖5。 (二)葛根素對P2X3受體介導的燒傷痛作用的研究結(jié)果 2丄1淺II度燒傷大鼠的確定
淺1I度燒傷大鼠皮膚浸入70 。C水中8s后，15分鐘左右可以X!1察到有紅斑和 輕微水腫形成,3小時后可以看到有水皰形成，病理切片HE染色證實為淺II度燒 傷，見圖6。燒傷大鼠在處死之前沒有明顯感染現(xiàn)象。 2.1.2燒傷大鼠皮膚神經(jīng)末梢P2X3受體表達的變化
應用二步法進行皮膚神經(jīng)末梢免疫組化，連續(xù)切片顯示，S-100顯色陽性 神經(jīng)末梢，同時具有P2X3免疫陽性表達。在鏡下觀察，可以看到皮膚真皮層的 神經(jīng)末梢主要分布在乳頭層靠近表皮層，呈散在分布，或在毛嚢、腺體附近分 布，見圖7。用圖象分析軟件對P2X3免疫陽性皮膚神經(jīng)末梢灰度值進行分析， 結(jié)果表明背部皮膚假燙組、葛根素注射+背部皮膚淺1I度組和生理鹽7jC+背部皮 膚淺II度組的灰度值分別為118.76±18.48、 130.42±13.35、 152.63±22.62。生理鹽水+背部皮膚淺II度組燒傷后，皮膚神經(jīng)末梢P2X3表達明顯升高，與背部
皮膚假燙組相比較具有顯著性差異(p<o.o5),葛根素注射+背部皮膚淺n度組 雖然仍高于背部皮膚假燙組，但顯著性低于生理鹽水+背部皮膚淺n度組
(p<0.05)。表明葛根素可減少燙傷皮膚神經(jīng)末梢P2X3的增強表達，見圖8。 2丄3足部燒傷大鼠熱痛敏測定
將有機玻璃箱置于3mm厚的玻璃板上，用BME-410C型全自動熱痛刺激儀 照射大鼠足底。熱輻射刺激儀照射大鼠足底至出現(xiàn)抬腿回避時間為熱縮足反射 潛伏期(thermal withdrawal latency, TWL)。切斷時間為30秒，以防止組織灼傷。
燒傷后l、 24、 48、 72hlII(足^淺II。C燙傷組，superficial second degree foot burn)、 IV (足部淺H。C燙傷+葛根素組，superficial second degree foot burn + puerarin )與I (足部假燙組，sham foot burn )、 II (單獨葛才艮素組，intraperitoneal injection of puerarin )、 V(正常組，control)之間相比較，III (淺H。C燙傷組)、 IV(淺11。C燙傷+葛根素組)熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency, TWL) 顯著性下降(pO.Ol)， I (足部假燙組)、II (單獨葛根素組)、V(正常組)之間 相比較無顯著性差異(pX).05)。燒傷后24h^， IV (足部淺II。C燙傷+葛根素組) 熱縮足反射潛伏期與I (足部假燙組)、II (單獨葛根素組)、V (正常組)之
間相比較仍下降(p<o.oi)，但與m (足部淺n。c燙傷組)之間比較顯著性增加
(p<0.01)。 144h^， IV (足部淺n。c燙傷+葛根素組)熱縮足反射潛伏期基本
恢復正常(p>0.05)，而III (足部淺II。C燙傷組)仍較低(p<0.01)。見圖9。 2丄4足部燒傷大鼠機械痛敏測定
用BME-403 Von Frey細絲測定才幾械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT)。置大鼠于透明的有機玻璃箱(2^1>22(:1113)中，有機玻璃箱 底為lxlcm2的鐵絲網(wǎng)。術(shù)后大鼠放置于實驗室飼養(yǎng)，測試前將大鼠放在有機 玻璃箱中適應15 min。折力分別為0.13， 0.20, 0.33, 0.60， 1.30， 3.60， 5.00, 7.30, 9.卯，20.1g，折力^20.1g時均記為20.1g。從最小折力開始，每根試驗10次，直 至出現(xiàn)縮足反射次數(shù)大于5/10,即50%反應閾值(即引起10次試驗中5次反應 的值。重復三次，取其平均值)。每次刺激間隔時間至少大于15s,并待刺激引 起的反應(如舔足、甩腿等)完全消失。
燒傷后ih始，ni (足部淺n。c燙傷組)、iv (足部淺n。c燙傷+葛根素組) 與i (足部假燙組)、n (單獨葛根素組)、v(正常組)之間相比較，in(淺n。c
燙傷組)、IV (淺H。C燙傷+葛根素組)機械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold,MWT)顯著性下降(pO.Ol),而I (足部假燙組)、II(單獨葛根素組)、 V(正常組)之間相比較無顯著性差異(pX).05)。 24h后，IV (足部淺11°(:燙傷+ 葛根素組)與III (足部淺H。C燙傷組)之間比較，機械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT)顯著性增加(pO.Ol)。 72h或96h^IV (足部淺II。C 燙傷+葛根素組)的機械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT)與i、 n 、 v組之間相比較基本恢復正常(px).05),而m (足部淺n。c燙傷組)
的機械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT)仍較4氐(p〈0.01)。 見圖IO。
2.1.5免疫組化檢測大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)P2X3表達變化
SD大鼠(體重200士20g)隨機分為I (背部假燙組，sham back burn)、 II (單獨葛根素組，Puerarin, intraperitoneal injection)、 III (背部淺II。C燙傷組， superficial second degree back burn )、 IV(背部淺II °C燙傷+葛根素組，superficial second degree back bum + puerarin )、 V(正常對照組control )。 IV (背部淺II。C 燙傷+葛根素組)大鼠，燙傷前30min和燙傷后每天腹腔注射葛根素(Puerarin, 100mg/kg)，連續(xù)3天。用免疫組織化學方法測定大鼠燙傷部背^bf申經(jīng)節(jié) (DRG)P2X3受體的表達。
免疫組化結(jié)果經(jīng)Hmias-2000高清晰彩色醫(yī)學圖文分析系統(tǒng)分析，結(jié)果顯 示i組、ii組、iii組、iv組、v組的平均光密度值分別為127.2±3.6902(n=10)、 124.2±2.4258(n=10)、 158.6±3.1383( n=10 )、 135.9±4.5227( n=10 )、 125.1±1.8824
(n=io)。m(背部淺ii。c燙傷組)明顯高于i組、n組、iv組、v組(po.oi)，
I、 II、 V組之間P2X3受體表達無顯著性差異(p>0.05); IV(背部淺II。C燙
傷+葛根素組)與i、 ii、 v組之間P2X3受體表i^目比，雖有偏高，但其與ni
(背部淺II°C燙傷組)比較，DRG的P2X3受體的表達量明顯下降(pO.Ol )。
見圖11。
2.1.6原位雜交檢測大鼠背才m申經(jīng)節(jié)(DRG)P2X3的mRNA表達變化
SD大鼠(體重200土20g)隨機分為I (背部假燙組，sham back bum)、 II (單 獨葛根素組，puerarin, intraperitoneal injection)、 III (背部淺II。C燙傷組， superficial second degree back burn )、 IV(背部淺IPC燙傷+葛根素組，superficial second degree back burn + puerarin) 、 V (正常對照組，control )。 IV (背部淺II 。C 燙傷+葛根素組)，燙傷前30min和燙傷后，大鼠每天腹腔注射葛根素(puerarin 100mg/kg)，連續(xù)3天。
原位雜交結(jié)果經(jīng)Hmias-2000高清晰彩色醫(yī)學圖文分析系統(tǒng)測定大鼠燙傷
部背根神經(jīng)節(jié)(DRG)P2X3受體的表達。結(jié)果顯示，i組、n組、m組、IV組、
V組的平均光密度值分別為:111.4 ±2.0342 (n=10)、 105.4±0.7180 (n=10 )、 129.1±1.1494 (n=10)、 101.7±1.7641 (n=10)、 108.5±3.5567 (n=10 )。 III (背 部淺II。C燙傷組)P2X3mRNA^達明顯高于I組、II組、IV組、V組(p0.05), I、 II、 V組之間P2X3 mRNA表達無顯著性差異(p>0.05); IV(背部淺II。C 燙傷+葛根素組)與III (背部淺II。C燙傷組)比較，DRG的P2X3 mRNA的表 達量顯著性下降(pO.Ol)，與I、 II、 V組之間比較亦較低。見圖12。 2丄7蛋白印跡檢測大鼠背才m申經(jīng)節(jié)(DRG)P2X3蛋白表達變化
SD大鼠(體重200士20g)隨機分為I (背部假燙組，sham back burn)、 II (單獨葛根素組，puerarin, intraperitoneal injection)、 III (背部淺II。C燙傷組， superficial second degree back burn )、 IV (背部淺IPC燹傷+葛根素組，superficial second degree back burn + puerarin )、 V (正常對照組，control )。 IV (背部淺II 。C 燙傷+葛根素組)，大鼠燙傷前30min和燙傷后每天腹腔注射葛根素(puerarin, 100mg/kg)，連續(xù)3天。
結(jié)果通過Alpha Imager 2200圖像分析軟件讀取目的條帶在X光膠片上測得 的光密度掃描值，以各組P-actin條帶的掃描值標化其相應組P2X3的蛋白表達 量。結(jié)果顯示，I組、II組、III組、IV組、V組的P2X3的蛋白表達量(經(jīng)對應 的卩-actin標化后)分別為0.9895±0.0703 ( n=10 )、 0.9744±0.0214 ( n=10 )、
I. 2259±0.0588 (n=10)、 0.9286±0.0177 (n=10 )、 0.9771±0.0203 (n=10 )。 III (背 部淺II。C燙傷組)P2X3蛋白的表達明顯高于I組、II組、IV組、V組(pO.Ol )，
i 、 n、 v組之間P2X3蛋白的表達無顯著性差異(px).05)，而iv(背部淺n。c
燙傷+葛根素組)與I 、 II、 V組之間相比，DRG的P2X3蛋白的表W目對量更 低，但無顯著性差異(p>0.05 )，與m (背部淺H。C燙傷組)比較，DRG的P2X3 蛋白的表&目對量明顯下降(p<0.01 )。見圖13。 2.1.8 RT-PCR檢測大鼠背才M申經(jīng)節(jié)(DRG)P2X3的mRNA表達變化
SD大鼠(體重200士20g)隨機分為I (背部假燙組，sham back burn)、 II (單 獨葛根素組，puerarin, intraperitoneal injection)、 III (背部淺II。C燙傷組， superficial second degree back burn )、 IV(背部淺IPC燙傷+葛根素組，superficial second degree back burn + puerarin )、 V (正常對照組，control )。 IV (背部淺II 。C 燙傷+葛根素組)，大鼠燙傷前30min和燙傷后每天腹腔注射葛根素(puerarin， 100mg/kg)，連續(xù)3天。
引物設計選用p-actin作為內(nèi)參，引物序列如下
PrimerP2X3 (產(chǎn)物長度為519bp)
S 5 ， - CAACTTCAGGTTTGCCAAA - 3 ，
A 5' - TGAACAGTGAGGGCCTAGAT-3，
Primer卩-actin (產(chǎn)物長度為240bp)
S 5 ， - TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT - 3'
A 5' - CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC - 3'
采用凝膠成像系統(tǒng)讀取目的電泳條帶的斑點密度(平均光密度)掃描值， 將P2X3條帶與其對應的P-actin條帶的比值作為P2X3 mRNA表達的相對量。結(jié)果 顯示，I組、1I組、ni組、IV組、V組P2X3mRNA反i^目對量(經(jīng)對應的P-actin 標化后)分別為:0.9379±0.0053(n=10)、 0.9513± 0.0049(n=10 )、 1.0391± 0.0097 (n=10)、 0.9133± 0.0033 (n=10)、 0.9517± 0,0085 (n=10)。 III (背部淺II。C 燙傷組)P2X3inRNA的表達明顯高于I組、II組、IV組、V組(p<0.01 )， I 、
II、 V組之間P2X3 mRNA的表達無顯著性差異(p>0.05),而(背部淺II。C燙
14傷+葛根素組)與I、 II、 V組之間相比，DRG的P2X3 mRNA的表達量更低， 有顯著性差異(p<0.05 ),與m (背部淺H。C燙傷組)比較，DRG的P2X3 mRNA 的表達明顯下降(pO.Ol)。見圖14。
申請人實驗室的研究發(fā)現(xiàn)葛根素可減輕神經(jīng)病理痛及燙傷痛大鼠的痛行 為反應。根據(jù)葛根素減小神經(jīng)病理痛和燒傷痛大鼠背才M申經(jīng)節(jié)神經(jīng)元P2X3受 體的表達、抑制P2X3受體激動劑ATP和a，卩-meATP在正常大鼠背根神經(jīng)節(jié) 神經(jīng)元的激活電流的研究結(jié)果，表明葛根素減輕疼痛的作用機理是阻斷P2X3 受體介導的疼痛信息傳遞，具有防治疼痛的作用。此外，由于P2X嘌呤受體涉 及體內(nèi)許多生理功能和病理作用，探尋出新的喋呤受體特異性阻斷劑，將極大 地推動噪呤信息系統(tǒng)在體內(nèi)各種生理功能和病理作用的研究工作。


圖1為葛根素神經(jīng)病理痛大鼠熱痛敏的影響圖； 圖2為葛根素神經(jīng)病理痛大鼠機械痛敏的影響圖3為葛根素對神經(jīng)病理痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)P2X3受體免疫反應性的影響 圖，其中A:假手術(shù)組；B:單獨葛根素組；C:坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷組；D: 坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+葛根素組;E:正常組；
圖4為葛根素對神經(jīng)病理痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)P2X3受體mRNA表達的影響 圖，其中A:假手術(shù)組；B:單獨葛根素組；C:坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷組；D: 坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+葛根素組;E:正常組；
圖5為各組大鼠DRG神經(jīng)元P2X受體激動劑-激活電流圖，其中A:假手 術(shù)組；B:單獨葛根素組；C:坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷組；D:坐骨神經(jīng)慢性壓 迫性損傷+葛根素組;E:正常組；
圖6為淺II度燒傷皮膚HE染色病理切片x40的示意圖7為大鼠皮膚標本連續(xù)切片S-100和P2X3免疫組織化學照片，其中A為神 經(jīng)末梢S-100免疫陽性表達照片；B為神經(jīng)末梢P2X3免疫陽性表達照片，箭頭所 指為免疫陽性神經(jīng)末梢；
圖8為燒傷大鼠皮膚神經(jīng)末梢P2X3受體免疫組化表達照片，其中A為背部 皮膚假燙組；B為葛根素注射+背部皮膚淺II。C燙傷組；C為生理鹽水+背部皮 膚淺n。c燙傷組，箭頭所指為免疫組化陽性神經(jīng)末梢；
圖9為葛根素燙傷痛大鼠熱痛敏的影響圖IO為葛根素燙傷痛大鼠積械痛敏的影響圖ll為葛根素對燙傷痛大鼠背才艮神經(jīng)節(jié)P2X3受體免疫反應性的影響圖，其 中A:假燙組；B:單獨葛根素組；C:淺II。C燙傷組；D:淺II。C燙傷+葛根素組; E:正常組；
圖12為葛根素對燙傷痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)P2X3受體mRNA表達的影響圖，其 中A:假燙組；B:單獨葛根素組；C:淺II。C燙傷組；D:淺II。C燙傷+葛根素組;E:正常組；
圖13為葛根素對燙傷痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)P2X3受體蛋白表達的影響圖，其中 實驗分組順序假燙組；正常對照組；淺II。C燙傷+葛根素組；淺II。C燙傷組; 單獨葛根素組；
圖14為葛根素對燙傷痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)P2X3受體mRNA表達的影響圖，其 中實驗分組順序正常對照組；淺II。C燙傷+葛根素組；淺II。C燙傷組；單獨葛 根素組；假燙組。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例并對照附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。 實施例1:
用本技術(shù)領(lǐng)域公知的方法，制成適用于急性痛/慢性痛治療的口服、注射或 局部(如局敷)的葛根素制劑。 實施例2:
用本技術(shù)領(lǐng)域公知的方法，制成適用于涉及P2X3受體介導神經(jīng)系統(tǒng)疾病 治療的口服、注射或局部(如局敷)的葛根素制劑。
權(quán)利要求
1、葛根素在制備治療慢性痛即神經(jīng)病理痛的藥物中的應用。
2、 葛根素在制備治療急性痛即燒傷^^乍痛的藥物中的應用。
3、 葛根素作為P2X3噪^t^抗劑在制備治療涉及P2X3受體介導神經(jīng)系統(tǒng)疾 病防治藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及葛根素在制藥領(lǐng)域中的新用途，即葛根素在制備P2X₃介導疼痛/神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物中的應用。實驗觀察到葛根素可抑制痛覺行為反應，進而應用免疫組化、原位雜交、RT-PCR及蛋白印跡等技術(shù)觀察到葛根素可抑制神經(jīng)病理痛模型大鼠背根神經(jīng)節(jié)及燒傷模型大鼠背根神經(jīng)節(jié)、感覺神經(jīng)末梢P2X₃受體的mRNA和蛋白表達，用全細胞膜片鉗技術(shù)觀察到葛根素可明顯減小病理痛模型大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元P2X₃受體激動劑激活電流。實驗證實葛根素對急、慢性疼痛具有抑制作用的機理是阻斷初級感覺神經(jīng)元P2X₃受體介導的痛覺信息傳遞。本發(fā)明為防治急、慢性疼痛探明新方法，同時還表明葛根素具有P2X₃受體拮抗劑的作用，這將有助于P2X₃受體所涉及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物防治應用。
文檔編號A61K31/352GK101627990SQ200910115608
公開日2010年1月20日 申請日期2009年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月29日
發(fā)明者晗 劉, 劉雙梅, 君 張, 徐昌水, 欣 李, 李桂林, 林加日, 梁尚棟, 云 高 申請人:南昌大學