專利名稱：山羊支原體肺炎二聯(lián)滅活疫苗及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及山羊支原體肺炎疫苗領域，具體說是一種山羊支原體肺炎二聯(lián)滅活疫
苗及其制備方法。
背景技術：
山羊支原體肺炎是指由支原體引起的發(fā)生于山羊的一種接觸性呼吸道傳染病，其
臨診特征為高熱、咳嗽，胸和胸膜發(fā)生漿液性和纖維素性炎癥，取急性和慢性經(jīng)過，發(fā)病率
在22 30%，有的高達60 80%，死亡率在15 30%。本病常見于世界各養(yǎng)羊國家和地
區(qū)，嚴重影響世界養(yǎng)羊業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展。在我國，本病流行已久，最早文字記載可追溯到1922
年，尤其隨著近年來我國養(yǎng)羊業(yè)的迅速發(fā)展，該病的流行區(qū)域增大，迄今已有甘肅、寧夏、新
疆、青海、四川、貴州、廣西、河北、遼寧、江蘇、內蒙、江蘇、湖南、河南等十余省市報道流行，
病情復雜，危害加重，每年給我國的養(yǎng)羊業(yè)生產(chǎn)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失。 山羊支原體肺炎的防制面臨較大困難，主要原因是其病原學因素復雜。除了我國
流行的優(yōu)勢病原絲狀支原體山羊亞種和綿羊肺炎支原體外，目前世界上已報道的本病病原
還包括山羊支原體山羊肺炎亞種、山羊支原體山羊亞種和絲狀支原體絲狀亞種大菌落型。
這些病原之間無交叉保護，且各國流行的優(yōu)勢病原不盡相同，加上支原體基因組較小，同一
種支原體也易發(fā)生變異而導致抗原差異，因此世界各國一般都根據(jù)本地具體流行情況針對
性地研制適合于本地區(qū)的滅活疫苗進行免疫預防。 流行于我國的山羊支原體肺炎病原絲狀支原體山羊亞種和綿羊肺炎支原體之間缺乏交叉保護，而所致疾病臨床上很難區(qū)分，且常會混合感染，因此應用單一病原制成的疫苗很難適應我國生產(chǎn)實際，而目前我國還沒有可以同時預防這兩種病原的二聯(lián)滅活疫苗。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種可同時預防絲狀支原體山羊亞種和綿羊肺炎支原體這
兩種病原的二聯(lián)滅活疫苗及其制備方法，用于山羊支原體肺炎的免疫預防。 本發(fā)明的目的是通過下述技術方案來實現(xiàn)的。 —種山羊支原體肺炎二聯(lián)滅活疫苗，含有絲狀支原體山羊亞種和綿羊肺炎支原體滅活抗原以及ISA206油佐劑，所述的山羊支原體肺炎二聯(lián)滅活疫苗按照下述步驟和方法制備 a制苗用培養(yǎng)基及其制備方法制苗用培養(yǎng)基為改良KM2培養(yǎng)基。
a. 1培養(yǎng)基成分最低要素培養(yǎng)基MEM占總量的50%， 1. 7%水解乳蛋白Hank's緩沖液占總量的35 % ， 25 %酵母浸液占總量的2 % ，健康馬血清占總量的10 % ， 1 %醋酸鉈溶液占總量的1%，2萬IU青霉素占1%，0.4%酚紅占總量的1%。 a. 2培養(yǎng)基制備方法將1. 7%水解乳蛋白Hank' s緩沖液、25%酵母浸液、1 %醋酸鉈溶液和0. 4%酚紅經(jīng)10磅20分鐘高壓滅菌，冷卻后加入用微孔濾膜濾過除菌的最低要素培養(yǎng)基(MEM)、健康馬血清和青霉素，用lmol/L氫氧化鈉溶液調整pH值至7. 4 7. 8，無菌分裝，2 『C保存?zhèn)溆谩?br> b增殖支原體的程序 b. 1支原體的增殖將絲狀支原體山羊亞種和綿羊肺炎支原體分別接種改良KM2培養(yǎng)基，經(jīng)3 5天培養(yǎng)，當培養(yǎng)物pH值下降至6. 8 7. 0時，按培養(yǎng)基總量的5%進行3 5次連續(xù)擴大培養(yǎng)，當培養(yǎng)物pH值下降至6. 8 7. 0時，收獲支原體菌液，測定生長滴度并進行超濾濃縮。 b. 2支原體的濃縮用超濾膜系統(tǒng)將支原體菌液進行濃縮，使絲狀支原體山羊亞種和綿羊肺炎支原體菌液濃度均達到6. 0 10. OX 108ccu/ml。
c.支原體滅活的程序 c. 1滅活給已濃縮的絲狀支原體山羊亞種和綿羊肺炎支原體菌液分別加入濃度40%的甲醛溶液，使菌液中甲醛的濃度達到0. 2%，在37t:下各持續(xù)滅活10小時，期間每2 4小時搖振1次，滅活終止，進行滅活檢驗。 c. 2滅活檢驗將滅活的支原體菌液進行抽樣，各接種改良KM2培養(yǎng)基2支，進行IO倍系列稀釋至10—s，置37t:培養(yǎng)10日，均無支原體生長者為滅活完全。
d.疫苗配制程序 采用一步乳化法，制成雙相油乳劑疫苗。 液相成分絲狀支原體山羊亞種和綿羊肺炎支原體滅活抗原按體積比1 : l等比例混合后，按抗原總量的1%加入1%硫柳汞溶液。液相成分占疫苗總量的45 50% ;
油相成分ISA206油佐劑。油相成分占疫苗總量的50 55% ;
乳化方法先將ISA 206油佐劑進料到均質機內，再將液相成分進料，循環(huán)攪拌至充分混合，在36 38MPa壓力下通過均質機，乳化成略帶粘滯性的水包油包水型(w/o/w)
雙相油乳劑滅活苗。
e疫苗的檢驗 e. 1物理性狀檢驗該疫苗為礦物油雙相乳劑型，外觀應呈乳白色或淡粉紅色略
帶粘滯性流體。3000rpm離心15分鐘應不分層。用出口內徑為1. 2mm的lml吸管，吸取
25°C的疫苗lml ，令其垂直自然流出，記錄流出0. 4ml所需時間，應在8秒鐘以內。 e.2無菌檢驗按中華人民共和國獸藥典(2005年版)附錄15頁進行，應無細菌生長。 e. 3安全檢驗用購自非疫區(qū)的12月齡左右健康易感山羊5只查無絲狀支原體山羊亞種和綿羊肺炎支原體血清抗體，各頸部皮下注射疫苗6ml，觀察30日，應無減食、精神沉郁、體溫反應、注射局部炎癥等不良反應，且全部健活。 e. 4效力檢驗用購自非疫區(qū)的12月齡左右健康易感山羊10只查無絲狀支原體山羊亞種和綿羊肺炎支原體血清抗體，每5只1組分為免疫I組和II組，各頸部皮下注射疫苗3ml，另以條件基本與免疫羊相同的山羊10只，每5只1組分為對照I組和II組。接種后30日，免疫I組和對照I組山羊各氣管接種綿羊肺炎支原體培養(yǎng)物10ml (5X 108ccu/ml)，觀察30日，對照羊全部發(fā)病，免疫羊至少保護4只，或對照羊4只發(fā)病，免疫羊全部保護為合格。免疫II組和對照II組山羊各氣管接種絲狀支原體山羊亞種培養(yǎng)物10ml (5X 108ccu/ml)，觀察30日，對照羊全部發(fā)病，免疫羊至少保護4只，或對照羊4只發(fā)病，免疫羊全部保護為合格。
4
本發(fā)明的優(yōu)點在于(l)使用了高效的支原體培養(yǎng)基，絲狀支原體山羊亞種和綿 羊肺炎支原體在改良KM2培養(yǎng)基中的生長滴度均可達到lX108ccU/ml ;(2)首次將這兩種 優(yōu)勢病原聯(lián)合制備二聯(lián)疫苗，可同時預防兩種病原，避免了用單一病原制備疫苗顧此失彼 的缺點，更適合我國生產(chǎn)實際；(3)該疫苗對不同生理狀況和年齡的山羊均安全，適用于不 同品種、各種年齡的山羊。無論養(yǎng)只大小，各頸部皮下注射疫苗3ml，對絲狀支原體山羊亞種 和綿羊肺炎支原體引起的山羊支原體肺炎的免疫保護率均可達4/5以上。疫苗一次接種的 有效免疫期為10個月，2 『C下保存期為12個月。
具體實施方式

實施例1、
1制備培養(yǎng)基 2005年3月11日 12日，配制改良KM2培養(yǎng)基42000ml 。將1.7%水解乳蛋白 Hank' s緩沖液14700ml、25%酵母浸液840ml、 1 %醋酸鉈溶液420ml和0. 4%酚紅420ml， 混合后經(jīng)IO磅20分鐘高壓滅菌，冷卻后加入用0. 22ym微孔濾膜濾過除菌的最低要素培 養(yǎng)基MEM21000ml、健康馬血清4200ml、2萬IU青霉素420ml，用lmol/L氫氧化鈉溶液調整 pH值至pH值為7. 8， 2t:保存?zhèn)溆谩?
2增殖支原體 2. 1支原體的增殖2005年3月12日將絲狀支原體山羊亞種M87-1菌種，接種改 良KM2培養(yǎng)基5ml，經(jīng)3天培養(yǎng)，培養(yǎng)物pH值下降至7. 0，按培養(yǎng)基總量的5%進行3次連續(xù) 擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)物pH值下降至7. 0時，收獲絲狀支原體山羊亞種M87-l菌液18000ml，測定 其生長滴度為6. 7X 107ccu/ml。 2005年3月12日將綿羊肺炎支原體MoGH3-3菌種，接種改良KM2培養(yǎng)基10ml，經(jīng)3 天培養(yǎng)，培養(yǎng)物PH值下降至7. 0。按培養(yǎng)基總量的5%進行3次連續(xù)擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)物pH值 下降至7. 0時，收獲綿羊肺炎支原體MoGH3-3菌液18000ml，測定其生長滴度為lX108ccu/ ml。 2. 2支原體的濃縮用超濾膜系統(tǒng)(PALL Centrasette 5)將絲狀支原體山羊亞種 M87-l菌液進行10倍濃縮，使菌液濃度為6. 7X 108ccu/ml ;將綿羊肺炎支原體MoGH3-3菌 液進行10倍濃縮，使菌液濃度為10. OX 108ccu/ml。
3滅活支原體 3. 1滅活分別向濃縮的絲狀支原體山羊亞種M87-l和綿羊肺炎支原體MoGH3-3 菌液加入濃度40%的甲醛溶液使其濃度達到0. 2%，在37t:下各持續(xù)滅活10小時，期間每 2小時搖振1次。 3. 2滅活檢驗滅活時間到，將滅活的絲狀支原體山羊亞種M87-1和綿羊肺炎支原 體MoGH3-3菌液各抽樣0. 2ml，各接種改良KM2培養(yǎng)基2支，每支0. lml，進行10倍系列稀 釋至10—5，置371:培養(yǎng)10日，均無支原體生長。
4疫苗配制 采用一步乳化法，制成雙相油乳劑疫苗。 液相成分絲狀支原體山羊亞種和綿羊肺炎支原體滅活抗原按1 : 1比例混合共 3600ml，按抗原總量的1%加入1%硫柳汞溶液36ml，共3636ml，占總量的50%。
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油相成分ISA206油佐劑3636ml，占總量的50%。 乳化方法先將ISA 206油佐劑進料到均質機內，再將液相成分進料，循環(huán)攪拌至 充分混合，在36MPa壓力下通過均質機，乳化成略帶粘滯性的水包油包水型(w/o/w)雙相油 乳劑滅活苗，批號050502，批量6500ml。
5疫苗檢驗 5. 1物理性狀檢驗該疫苗為礦物油雙相乳劑型，外觀呈乳白色。3000rpm離心15 分鐘不分層。用出口內徑為1.2mm的1ml吸管，吸取25t:的疫苗lml，令其垂直自然流出， 流出0. 4ml所需時間為3秒。 5.2無菌檢驗按中華人民共和國獸藥典(2005年版)附錄15頁進行，均無細菌 生長。 5.3安全檢驗用購自非疫區(qū)的12月齡左右健康易感山羊5只(查無絲狀支原體 山羊亞種和綿羊肺炎支原體血清抗體)，各頸部皮下注射疫苗6ml，觀察30日，無減食、精神 沉郁、體溫反應、注射局部炎癥等不良反應，且全部健活。 5.4效力檢驗用購自非疫區(qū)的12月齡左右健康易感山羊10只(查無絲狀支原 體山羊亞種和綿羊肺炎支原體血清抗體)，每5只1組分為免疫I組和II組，各頸部皮下 注射疫苗3ml，另以條件基本與免疫羊相同的山羊10只，每5只1組分為對照I組和II 組。接種后30日，免疫I組和對照I組山羊各氣管接種綿羊肺炎支原體MoGH3-3培養(yǎng)物 10ml(5Xl()8ccu/ml)，觀察30日。結果對照羊全部(5/5)發(fā)病，免疫羊4/5保護。免疫II 組和對照II組山羊各氣管接種絲狀支原體山羊亞種M87-1培養(yǎng)物10ml (5X 108ccu/ml)，觀 察30日。結果對照羊4/5發(fā)病，免疫羊全部(5/5)保護。
實施例2
1制備培養(yǎng)基 2005年4月1日 2日，配制改良KM2培養(yǎng)基42000ml。將1.7%水解乳蛋白 Hank' s緩沖液14700ml ， 25%酵母浸液840ml ， 1 %醋酸鉈溶液420ml ， 0. 4%酚紅420ml ，混 合后經(jīng)10磅20分鐘高壓滅菌，冷卻后加入用0. 22 i！ m微孔濾膜濾過除菌的最低要素培養(yǎng) 基(MEM)21000ml，健康馬血清4200ml，2萬IU青霉素420ml，用lmol/L氫氧化鈉溶液調整 pH值至pH值為7. 4，『C保存?zhèn)溆谩?
2增殖支原體 2. 1支原體的增殖2005年4月10日將絲狀支原體山羊亞種M87-l菌種，接種改 良KM2培養(yǎng)基10ml，經(jīng)5天培養(yǎng)，培養(yǎng)物pH值下降至6. 8。按培養(yǎng)基總量的5%進行3次連 續(xù)擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)物pH值下降至6. 8時，收獲絲狀支原體山羊亞種M87-l菌液20000ml，測 定其生長滴度為lX108ccu/ml。 2005年4月10日將綿羊肺炎支原體MoGH3-3菌種，接種改良KM2培養(yǎng)基10ml，經(jīng)5 天培養(yǎng)，培養(yǎng)物PH值下降至6. 8。按培養(yǎng)基總量的5%進行3次連續(xù)擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)物pH值 下降至6.8時，收獲綿羊肺炎支原體MoGH3-3菌液20000ml，測定其生長滴度為lX108ccu/ ml。 2. 2支原體的濃縮用超濾膜系統(tǒng)(PALL Centrasette 5)將絲狀支原體山羊亞種 M87-l菌液進行6倍濃縮，使菌液濃度為6. 0 X 108ccu/ml ;將綿羊肺炎支原體MoGH3-3菌液 進行6倍濃縮，使菌液濃度為6. 0 X 108ccu/ml 。
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3滅活支原體 3. 1滅活分別向濃縮的絲狀支原體山羊亞種M87-l和綿羊肺炎支原體MoGH3-3 菌液加入濃度40%的甲醛溶液，使其濃度達到0. 2% ，在37t:下各持續(xù)滅活10小時，期間每 4小時搖振1次。 3. 2滅活檢驗滅活時間到，將滅活的絲狀支原體山羊亞種M87-1和綿羊肺炎支原 體MoGH3-3菌液各抽樣0. 2ml，各接種改良KM2培養(yǎng)基2支，每支0. lml，進行10倍系列稀 釋至10-5，置37t:培養(yǎng)10日，均無支原體生長。
4疫苗配制 采用一步乳化法，制成雙相油乳劑疫苗。 液相成分絲狀支原體山羊亞種和綿羊肺炎支原體滅活抗原按1 : l等比例混合 共4000ml，按抗原總量的1%加入1X硫柳汞溶液40ml，共4040ml，占總量的45%。
油相成分ISA206油佐劑4940ml，占總量的55%。 乳化方法先將206油佐劑進料到均質機內，再將液相成分進料，循環(huán)攪拌至充分 混合，在38MPa壓力下通過均質機，乳化成略帶粘滯性的水包油包水型(w/o/w)雙相油乳劑 滅活苗，批號050603，批量8000ml 。
5疫苗檢驗 5. 1物理性狀檢驗該疫苗外觀呈略帶粉紅的乳白色乳劑。3000rpm離心15分鐘 沒有分層。用出口內徑為1.2mm的lml吸管，吸取25t:的疫苗lml，令其垂直自然流出，流 出O. 4ml所需時間為4秒。 5.2無菌檢驗按中華人民共和國獸藥典(2005年版)附錄15頁進行，均無細菌 生長。 5.3安全檢驗用購自非疫區(qū)的12月齡左右健康易感山羊5只(查無絲狀支原體 山羊亞種和綿羊肺炎支原體血清抗體)，各頸部皮下注射疫苗6ml，觀察30日，無減食、精神 沉郁、體溫反應、注射局部炎癥等不良反應，且全部健活。 5. 4效力檢驗用購自非疫區(qū)的12月齡左右健康易感山羊10只查無絲狀支原 體山羊亞種和綿羊肺炎支原體血清抗體，每5只1組分為免疫I組和II組，各頸部皮下 注射疫苗3ml，另以條件基本與免疫羊相同的山羊10只，每5只1組分為對照I組和II 組。接種后30日，免疫I組和對照I組山羊各氣管接種綿羊肺炎支原體MoGH3-3培養(yǎng)物 10ml(5Xl()8ccu/ml)，觀察30日。結果對照羊4/5發(fā)病，免疫羊5/5保護。免疫II組和對 照II組山羊各氣管接種絲狀支原體山羊亞種M87-1培養(yǎng)物10ml (5Xl()8ccu/ml)，觀察30 日。結果對照羊5/5發(fā)病，免疫羊4/5保護。
權利要求
一種山羊支原體肺炎二聯(lián)滅活疫苗，其特征在于含有絲狀支原體山羊亞種和綿羊肺炎支原體滅活抗原以及ISA206油佐劑，采用以下方法和步驟制備而成a制苗用培養(yǎng)基及其制備方法制苗用培養(yǎng)基為改良KM2培養(yǎng)基；a.1培養(yǎng)基成分最低要素培養(yǎng)基MEM占總量的50％，1.7％水解乳蛋白Hank’s緩沖液占總量的35％，25％酵母浸液占總量的2％，健康馬血清占總量的10％，1％醋酸鉈溶液占總量的1％，2萬IU青霉素占1％，0.4％酚紅占總量的1％；a.2培養(yǎng)基制備方法將1.7％水解乳蛋白Hank’s緩沖液、25％酵母浸液、1％醋酸鉈溶液和0.4％酚紅經(jīng)10磅20分鐘高壓滅菌，冷卻后加入濾過除菌的最低要素培養(yǎng)基MEM、健康馬血清和青霉素，用1mol/L氫氧化鈉溶液調整pH值至7.4～7.8，無菌分裝，2～8℃保存?zhèn)溆茫籦增殖支原體的程序b.1支原體的增殖將絲狀支原體山羊亞種和綿羊肺炎支原體分別接種改良KM2培養(yǎng)基，經(jīng)3～5天培養(yǎng)，當培養(yǎng)物pH值下降至6.8～7.0時，按培養(yǎng)基總量的5％進行3～5次連續(xù)擴大培養(yǎng)，當培養(yǎng)物pH值下降至6.8～7.0時，收獲支原體菌液，測定生長滴度并進行超濾濃縮；b.2支原體的濃縮用超濾膜系統(tǒng)將支原體菌液進行濃縮，使絲狀支原體山羊亞種和綿羊肺炎支原體菌液濃度均達到6.0～10.0×108ccu/ml；c.支原體滅活的程序c.1滅活給已濃縮的絲狀支原體山羊亞種和綿羊肺炎支原體菌液分別加入濃度40％的甲醛溶液，使菌液中甲醛的濃度達到0.2％，在37℃下各持續(xù)滅活10小時，期間每2～4小時搖振1次，滅活終止，進行滅活檢驗；c.2滅活檢驗將滅活的支原體菌液進行抽樣，各接種改良KM2培養(yǎng)基2支，進行10倍系列稀釋至10-5，置37℃培養(yǎng)10日，均無支原體生長者為滅活完全；d.疫苗配制程序采用一步乳化法，制成雙相油乳劑疫苗；液相成分絲狀支原體山羊亞種和綿羊肺炎支原體滅活抗原按體積比1∶1等比例混合后，按抗原總量的1％加入1％硫柳汞溶液；液相成分占疫苗總量的45～50％；油相成分ISA206油佐劑，油相成分占疫苗總量的50～55％；乳化方法先將206油佐劑進料到均質機內，再將液相成分進料，循環(huán)攪拌至充分混合，在36～38MPa壓力下通過均質機，乳化成略帶粘滯性的水包油包水型(w/o/w)雙相油乳劑滅活苗。
全文摘要
一種山羊支原體肺炎二聯(lián)滅活疫苗及其制備方法，采用以下方法和步驟制備而成a制苗用培養(yǎng)基及其制備方法制苗用培養(yǎng)基為改良KM2培養(yǎng)基；b增殖支原體的程序；c支原體滅活的程序；d疫苗配制程序采用一步乳化法，制成雙相油乳劑疫苗；液相成分占疫苗總量的45～50％，絲狀支原體山羊亞種和綿羊肺炎支原體滅活抗原按1∶1混合后，按抗原總量的1％加入1％硫柳汞溶液；油相成分占疫苗總量的50～55％，ISA206油佐劑；乳化成略帶粘滯性的水包油包水型(w/o/w)雙相油乳劑滅活苗。本發(fā)明首次將這兩種優(yōu)勢病原聯(lián)合制備二聯(lián)疫苗，可同時預防兩種病原，避免了用單一病原制備疫苗顧此失彼的缺點，更適合我國生產(chǎn)實際。
文檔編號A61P11/00GK101721694SQ20091011757
公開日2010年6月9日 申請日期2009年11月7日 優(yōu)先權日2009年11月7日
發(fā)明者儲岳峰, 賀英, 趙萍, 逯忠新, 高鵬程 申請人:中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所