專利名稱：一種預(yù)防和治療阿爾茨海默氏癥的藥物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥和保健技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及用于預(yù)防和治療阿爾茨海默氏癥的藥物及其制備方法。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默氏癥(AD)，是一種以進(jìn)行性認(rèn)知障礙和記憶力損害為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，癡呆是其最突出的精神癥狀。由于該病的病因及發(fā)病機(jī)制尚未明了，普遍認(rèn)同和活性氧的增多，淀粉樣蛋白沉積對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞的損傷有關(guān)。臨床上，目前仍缺乏特效的病因治療方法，預(yù)防及早期發(fā)現(xiàn)AD就更為重要。而在中晚期，則是以護(hù)理為主。許多藥物在改善AD患者的記憶能力、認(rèn)知功能及延緩衰老等方面具有良好的作用，例如1、乙酰膽堿酯(AChE )抑制劑，這也是美國(guó)FDA認(rèn)i正的最廣泛和最有效的一類藥物；2、改善腦血液循環(huán)和腦細(xì)胞代謝的藥物；3、鈣離子拮抗；4、非甾體抗炎藥物；5、自由基消除劑和抗氧化劑；6、激素類藥物等。近年來(lái)，研究認(rèn)為使用雌激素可以緩解患有AD婦女的癥狀，并可能延緩或防止患者病情的發(fā)展。雌激素的這方面作用與其抗氧化、減少淀粉樣蛋白沉積對(duì)細(xì)胞的損傷、促進(jìn)神經(jīng)元的修復(fù)、防止神經(jīng)細(xì)胞死亡等有關(guān)。雌激素對(duì)更年期綜合癥和AD的綜合治療，將二者緊密結(jié)合，為治療老年性疾病帶來(lái)了新的啟示。與上述情況相似，雖然雌激素能有效地延緩和防止AD的發(fā)生，但是大量合成雌激素有誘發(fā)癌癥(乳腺癌)的可能。因此，服用雌激素時(shí)，必須經(jīng)常檢查體內(nèi)激素水平，以防過(guò)多的雌激素誘發(fā)癌癥，這為雌激素應(yīng)用于AD帶來(lái)了很大的局限。
黃酮類化合物，又稱植物激素，被認(rèn)為中藥的重要活性成分之一，廣泛存在于食物，植物中，長(zhǎng)期應(yīng)用于臨床治療和食療。黃酮類化合物在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與雌激素相似，與雌激素受體結(jié)合，激活雌激素傳導(dǎo)通路，產(chǎn)生雌激素效應(yīng)。經(jīng)過(guò)多年的體外體內(nèi)研究，黃酮類成分至今未發(fā)現(xiàn)有明顯的副作用，并且越來(lái)越多應(yīng)用于臨床作為雌激素替代品的首選。此外，黃酮類化合物是自然界中抗氧化作用最強(qiáng)的天然產(chǎn)物之一，具有4艮強(qiáng)的抑制活性氧，清除自由基的神經(jīng)保護(hù)作用。因此，經(jīng)過(guò)科學(xué)方法篩選出的既有效又無(wú)副作用的植物激素黃酮類成分用于防治AD,開(kāi)發(fā)成具有治療作用藥物或者保健食品，將是今后幾年的研究目標(biāo)和熱點(diǎn)。并越來(lái)越受到人們的關(guān)注。
著名中藥三七(Panax notoginseng),又稱田七、人參三七、金不換，為五力口矛牛才直4勿三七(戶a/ ai /70fog/;25e/7g (Burk.) F.H.Chen) ^j干燥沖艮，'〖生5顯，味甘、微苦，傳統(tǒng)上用于止血活血，散瘀止血，消肺定痛，治療各種內(nèi)、外出血，胸腹刺痛，跌樸腫痛。三七的臨床建議劑量為5-10克。雖然三七制品的使用量十分巨大但卻很少報(bào)道有副作用，是相對(duì)安全的中藥之一。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)三七具有抗心律失常、抗心肌損傷、抗動(dòng)脈粥樣石更化、抗休克、降血壓、耐缺氧的作用。對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有腦損傷保護(hù)、改善腦梗塞癥狀、耐缺氧、改善記憶、鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛作用。此外，三七還具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、延緩衰老、抗腫瘤、抗病毒、抗真菌、減少血脂和膽固醇等作用。雖然上述的特點(diǎn)普遍已知，三七對(duì)于在神經(jīng)系統(tǒng)的應(yīng)用在中醫(yī)中藥闡述很少，只作為一些治療偏頭痛和機(jī)體損傷的中藥方劑。三七的主要化學(xué)成分有皂苷、黃酮、揮發(fā)油、氨基酸、多糖、淀粉、蛋白質(zhì)等。皂苷是三七最主要有效活性成分，占含量的12%，可以抑制血小板凝集，抗血栓和抗凝血，增加腦血流量，提高機(jī)體耐缺氧，抗腫瘤，研究系統(tǒng)詳細(xì)。作為三七的第二大有效活性成分，黃酮對(duì)于降壓、增加冠脈流量、抗病毒有一定的作用，但是未見(jiàn)其活性成分的分離鑒定和藥理作用報(bào)道，特別是與雌激素和神經(jīng)保護(hù)作用相關(guān)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于預(yù)防和治療阿爾茨海默氏癥的藥物和保健食品及其制備方法，該藥物的有效成分具有雌激素活性、抗氧化活性、抑制A(3聚集和毒性的神經(jīng)保護(hù)作用，可以減少東莨菪堿引起的記憶損傷，可以用來(lái)制備能夠預(yù)防和治療AD的藥物和保健品。
本發(fā)明的目的是通過(guò)以下具體技術(shù)方案完成的， 一種預(yù)防和治療阿爾茨海默氏癥的藥物，其有效成分為從原料藥三七中提取的槲皮素-3-0-p-D-吡喃木糖基(1 — 2) -J3-D-吡喃半乳糖香。
作為一種優(yōu)化方案，該藥物還包含輔料，可制成臨床接受的片劑、口服液、針劑、膠嚢劑。
本發(fā)明的一種預(yù)防和治療阿爾茨海默氏癥的藥物和保健品的制備方法，取三七原藥材粉碎，過(guò)20Q目篩，用70%乙醇提取，濃縮，經(jīng)過(guò)聚酰胺柱，依次以水、30%乙醇和50%乙醇洗脫，30%乙醇洗脫部分溶于甲醇，作為粗黃酮部分，粗黃酮進(jìn)一步經(jīng)過(guò)葡聚糖LH-20柱層析，由甲醇洗脫，洗脫部分再經(jīng)過(guò)RP-C18柱分離，以曱醇-水梯度(30%， 35%， 401 45%， 50°/ )洗脫，30%和35°/ 洗脫部分經(jīng)過(guò)TLC檢測(cè)，得到槲皮素-3-0-(3-D-吡喃木糖基(1 — 2) 吡喃半乳糖苷。
槲皮素-3-0-(3-D-吡喃木糖基(1 — 2) -(3-D-吡喃半乳糖普在預(yù)防和治療阿爾茨海默氏癥的保健品中的應(yīng)用。
本發(fā)明的藥物和保健品的有效成分為槲皮素-3-0-J3-D-吡喃木糖基(1 —2)-(3-D-吡喃半乳糖苷，具有雌激素活性、抗氧化活性、抑制A(3聚集和毒性的神經(jīng)保護(hù)作用，可以減少東萊菪堿引起的記憶損傷，可以用來(lái)制備能夠預(yù)防和治療AD的藥物和保健品，提取用原料藥材常見(jiàn)，獲取容易。


附圖1為本發(fā)明有效成分RNFG的化學(xué)結(jié)構(gòu)；
附圖2為本發(fā)明有效成分RNFG和藥材的HPLC譜附圖3為本發(fā)明有效成分RNFG的雌激素活性示意附圖4為本發(fā)明有效成分RNFG抑制活性氧生成的抗氧化作用效果對(duì)比附圖5為本發(fā)明有效成分RNPG抑制Ap聚集的神經(jīng)保護(hù)作用效果對(duì)比附圖6為本發(fā)明有效成分RNPG抑制AJ3細(xì)胞毒性的神經(jīng)保護(hù)作用效果對(duì)比
附圖7為本發(fā)明有效成分RNPG抑制Ap誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡效果對(duì)比圖；附圖8為本發(fā)明有效成分RNPG抑制Ap誘導(dǎo)的鉤離子內(nèi)流效果對(duì)比圖；附圖9為本發(fā)明有效成分RNPG和結(jié)構(gòu)類似神經(jīng)保護(hù)作用的效果對(duì)比圖；附圖10為本發(fā)明有效成分RNPG對(duì)于東萊菪堿致大鼠記憶損傷的改善作用效杲對(duì)比圖。
具體實(shí)施例方式
黃酮類成分。通過(guò)對(duì)三七黃酮類化學(xué)成分進(jìn)行深入細(xì)致研究，首次分離、鑒定了三七4艮中的主要黃酮類化合物RNFG,進(jìn)一步發(fā)明了 RNFG具有雌激素活性、抗氧化活性、抑制A|3聚集和毒性的神經(jīng)保護(hù)作用，并且闡述了其神經(jīng)保護(hù)機(jī)理是抑制A(3引起的鈣離子內(nèi)流和細(xì)胞凋亡。在動(dòng)物才莫型中，RNFG可以減少東蒗菪堿引起的記憶損傷，進(jìn)一步明確了其神經(jīng)保護(hù)作用，可以用來(lái)制備能夠預(yù)防和治療AD的藥物和保健品。為進(jìn)一步充分說(shuō)明本發(fā)明的有益效果，現(xiàn)通過(guò)以下實(shí)驗(yàn)例來(lái)說(shuō)明。
實(shí)施例1: RNFG的分離鑒定
三七收集于云南省文山，自然晾干，經(jīng)過(guò)生藥鑒定，樣本憑證保存于香港科技大學(xué)生物學(xué)系。美國(guó)人參、韓國(guó)人參購(gòu)買于香港市場(chǎng)。
原藥材三七1公斤粉碎，過(guò)200目篩，70%乙醇提取(2次，每次3升)。乙醇溶液真空濃縮，濃縮物用500毫升tK加熱溶解，離心15 min，取上清液，經(jīng)聚酰胺柱，依次以水、30%乙醇和50%乙醇洗脫，30%乙醇洗脫部分溶于100毫升曱醇，作為粗黃酮部分。粗黃酮進(jìn)一步經(jīng)過(guò)葡聚糖LH-20柱層析，由曱醇洗脫。再經(jīng)過(guò)RP-C18柱分離，以甲醇-水(30%， 35%, 40%. 45%, 50%)梯度洗脫，30%和35。/。洗脫部分經(jīng)過(guò)TLC檢測(cè)，得到單體黃酮化合物，即本發(fā)明藥物的有效成分槲皮素-3-O-p-D-吡喃木糖-(1 —2)-p-D-吡喃半乳糖苷(RNFG)其結(jié)構(gòu)見(jiàn)附圖1。
RNFG為首次從三七中分離得到，純度大于98%,約占總黃酮含量的60%,是三七中總黃酮中含量最大的化合物。經(jīng)過(guò)水解，經(jīng)過(guò)HPTLC分析，結(jié)果顯示糖的存在，并且有Rf值差異。具體結(jié)構(gòu)鑒定如下
RNFG為黃色粉末，熔點(diǎn)173-175 °C,紫外燈下顯示黃色熒光。易溶于甲醇、乙醇和水，難溶于氯仿、乙酸乙酯。HCl-Mg反應(yīng)陽(yáng)性，AICL反應(yīng)陽(yáng)性，Molish反應(yīng)陽(yáng)性，顯示此化合物可能為黃酮苷類。屮NMR (DMSO-數(shù)據(jù)顯示(表l)5 6. I(IH， s)與56. 3(1H, s)兩個(gè)單度芳香氫信號(hào)，分別歸屬于H-6和H-8,5 6.8 (1H, d， J=8. 5Hz)， 57.51 (1H, d， J=2. 0 Hz， )， 57.70 (1H， dd, J=8. 5,2.0 Hz)分別歸屬于H-5， ， H-2， ， H-6， ， 13C NMR (DMSO-cO譜(表l)給出26個(gè)碳信號(hào)，S59-81卯m 給出9個(gè)C信號(hào)，其中S 59. 9 ppm為CIU言號(hào)，5 98.3 ppm與5 104.5 ppra兩個(gè)糖的端基碳信號(hào)，提示化合物含六碳糖和五石友糖。苷元有15個(gè)碳，5ppm 177. 0為典型的黃酮羰基碳信號(hào)，5 ppffl 164. 0, 161. 1,156.3， 154.9, 148.9， 145.0, 132.8， 120.9， 103. l皆為季碳信號(hào)，分別歸屬為C-7, C-5, C-2, C—9， C—4， ， C-3， ， C-3, C—1' , C—l(H言號(hào)，5ppml22. 1, 115.5, 115.1, 99.1, 93. 6皆為CH信號(hào)，分別歸屬為C-6， ， C-5' , C-2', C-6, C-8信號(hào)。RNFG水解后沉淀經(jīng)過(guò)HPTLC鑒定，其Rf值與槲皮素Rf值一致， 糖部分經(jīng)HPTLC與PC鑒定，其Rf值與半乳糖和木糖一致。由此黃酮母核結(jié)構(gòu)為 槲皮素。因?yàn)镃-2向低場(chǎng)位移，說(shuō)明槲皮素C-3位成芬。因?yàn)槎嘶琴|(zhì)子信號(hào) 的偶合常數(shù)均為J=7. 0 Hz，證明半乳糖和木糖皆為P-D構(gòu)型。半乳糖的C-2'， 的位移值由71左右向低場(chǎng)移動(dòng)到79. 7, HMBC譜圖中，C-1， ， ' (5 104.5)與 H-2' ， (5 3.74)有遠(yuǎn)程相關(guān)，所以證明糖的連接順序?yàn)榘肴樘?2 —l)木糖。 ESI-MS中給出619 (M+Na)+的峰,證明分子量為596，符合C26H 28016的分子式，另 外碎片469 (M+Na-xyl-H20)，進(jìn)一步證明木糖(xyl)處于壽唐鏈的外側(cè)。綜上所
,RNFG為槲皮素-3-0-p-D-吡喃木糖基(1 — 2) -p-D-吡喃半乳糖苷。 表1 RNFG的13C NMR與'H NMR數(shù)據(jù)值(5 ppm, DMSO-CRNFG "C醒文獻(xiàn)值RNFG'畫(huà)R 文獻(xiàn)值
2156. 3155. 2
3132. 8133. 0
4177. 0177. 4
5161. 1161. 2
699. 198. 66. 10(s) 6. 18 (s)
7164. 0164. 0
893. 693. 36. 30(s) 6. 39 (s)
9154. 9156. 2
10103. 1103. 8
1，120. 9121. 2
2，115. 1115. 77. 51(d， J=2. 0 7. 51 (d， J=2. 0Hz) Hz)
3， 145.0 144.9
4， 148.9 148.6
5， 115.5 115,2 6.80 (d, J=8. 5 6.81 (d, J=8. 5
Hz) Hz)
6， 122.1 122.3 7.70 (dd, J=8. 5, 7.75 (dd， J=8. 5,
2. 0 Hz) 2. 0 Hz)
1， ' 98.3 98.3 5.68 (d, J=7. 0 5.67 (d, J=7. 6
Hz) Hz)
2, ' 79.7 79.8
3， ' 73.6 73.6
4， ' 67.7 67.7
5， ' 73.8 73.9
6， ' 59.9 59.9
1， ， ' 104.5 104.1 4.55 (d， J=7. 0 4.54 (d， J=7. 4
Hz) Hz)
2， m 75.8 75.9
3， ' ' 76.0 76.2
4， ' ' 69. 3 69.4
5， ' ' 65.5 65.6
經(jīng)過(guò)紫外光248 nm檢測(cè)(Beckman DUR 650 ) , HPLC 4企測(cè)純度大于98%。 HPLC系統(tǒng)(Waters (Milford， MA) 600 p,， 717 auto-sampler and UV/VISPhotodiode Array 2996 Detector ) , C18反向柱(Nova-Pak HR C18 (6 Wn, 7.8X 300 mm)),流動(dòng)向乙腈-水-甲酸(12: 88: 0.1),流速lml/min,最大吸光強(qiáng)度348nm，保留時(shí)間18 min。分離到的化合物經(jīng)過(guò)鑒定，對(duì)比波譜數(shù)據(jù)(紫外、紅外、核磁、質(zhì)譜)，分子式為C26H28016 ,被命名為槲皮素-3-O-(3-D-吡喃木糖-(1 —2)-(3-D-吡喃半乳糖苷(RNFG)。經(jīng)過(guò)水解，樣品30毫克在10%鹽酸的50%乙醇(5毫升)回流5個(gè)小時(shí)，反應(yīng)溶液由水稀釋，并且用辨酸銀中和。中和過(guò)的水層過(guò)濾，然后經(jīng)過(guò)HPTLC分析，結(jié)果顯示糖的存在，并且有Rf值差異，經(jīng)過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品比較，確定為木糖和半乳糖。RNFG為首次乂人三七中分離得到，純度大于98%，是黃酮中含量最大的化合物，約占總黃酮含量的60%。從l公斤三七藥材中，約有O. 68土0. 05g (/2=5)的RNFG可以獲得。參見(jiàn)附圖2， 與韓國(guó)人參(g/0se/2g C. A. Meyer)和美國(guó)人參(戶s/7a;rL.)的化學(xué)成分比較，RNFG是三七中的特有成分。
實(shí)驗(yàn)例2: RNFG的雌激素活性的驗(yàn)證
1. 細(xì)胞培養(yǎng)條件
MCF-7 (含有ERE基因)或者M(jìn)CF-7細(xì)胞培養(yǎng)在MEM培養(yǎng)基，含10%胎牛血清、青酶素100U/ml、慶大酶素100ug/ml、 ImM氨基酸和0. ImM丙酮酸鈉，培養(yǎng)箱溫度37°C,含5% C02空氣和飽和濕度。實(shí)驗(yàn)之前3天將培養(yǎng)基改變?yōu)闊o(wú)酚紅MEMa培養(yǎng)基，含2 %活性炭/葡聚糖處理的胎牛血清，其它條件同上。
2. 雌激素水平測(cè)定
(1)雌激素反應(yīng)元-螢光素酶活性測(cè)定(ERE-luciferase)將MCF-7細(xì)胞(含有ERE基因)種在24孔板上，每孔細(xì)胞密度約5xl04個(gè)細(xì)胞，過(guò)夜讓細(xì)胞貼壁，從第二天開(kāi)始加藥RNFG (1-100 nM)，每24小時(shí)加藥一次，每次加藥之前更換培養(yǎng)液。加藥二次后取細(xì)胞溶解液，樣品進(jìn)行螢光素酶活性測(cè)定(Fluostar Optima, BMG Labtechnology )，實(shí)驗(yàn)資料以三次實(shí)驗(yàn)的平均值，每次平行做三個(gè)孔。對(duì)照結(jié)果參見(jiàn)附圖3, RNFG可以增加雌激素反應(yīng)元表達(dá)的雌激素活性，并呈劑量依賴性，雌二醇(E2)為陽(yáng)性對(duì)照。
(2)雌激素受體磷酸化水平測(cè)定(絲氨酸S118, P-ERa)
將MCF-7細(xì)胞種在24孔板上，每孔細(xì)胞密度約5xl(T個(gè)細(xì)胞，過(guò)夜讓細(xì)胞貼壁，第二天給藥前3個(gè)小時(shí)，培養(yǎng)基改變?yōu)闊o(wú)胎牛血清無(wú)酚紅MEMa培養(yǎng)基，力口藥后不同時(shí)間收集細(xì)胞溶解液，進(jìn)行Western Blot測(cè)定，實(shí)驗(yàn)資料以三次實(shí)驗(yàn) 的平均值。對(duì)照結(jié)果參見(jiàn)附圖3, RNFG通過(guò)促進(jìn)雌激素受體磷酸化(P-ERa)， 促進(jìn)雌激素轉(zhuǎn)錄而實(shí)現(xiàn)其雌激素活性，并呈時(shí)間依賴性，雌二醇(E2)為陽(yáng)性 對(duì)照。
實(shí)驗(yàn)例3: RNFG的神經(jīng)保護(hù)作用
1. 細(xì)胞培養(yǎng)條件
PC12細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基，含6%胎牛血清、含6%馬血清、青酶素 100U/ml、慶大酶素100ug/ml，培養(yǎng)箱溫度37°C,含7. 5% 002空氣和一定的濕度。 原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)細(xì)胞通過(guò)解剖大鼠胚胎(18天)的大腦皮層獲得，大腦皮 層細(xì)胞培養(yǎng)在neural basal培養(yǎng)基，含B27和0. 5 mM的GlutaMAX大于兩周， 培養(yǎng)箱溫度37°C，含5o/ C02空氣和飽和濕度。
2. 活性氧(ROS)測(cè)定
PC-12細(xì)胞種在96孔板上，每孔細(xì)胞密度約5xl(T個(gè)細(xì)胞，過(guò)夜讓細(xì)胞貼壁， 第二天開(kāi)始加藥物RNFG (1-100 W),加藥之前更換培養(yǎng)液。加藥后24小時(shí)， 加入DCFH-DA進(jìn)行焚光標(biāo)記1小時(shí)37 °C,再加入H202 (400 1小時(shí)，進(jìn)行熒 光測(cè)定。實(shí)驗(yàn)資料以三次實(shí)驗(yàn)的平均值，每次平行做三個(gè)孔。對(duì)照結(jié)果參見(jiàn)附 圖4， RNFG可以在神經(jīng)細(xì)胞PC 12中抑制&02誘導(dǎo)的ROS的增加，并呈劑量依賴 性，VitC為陽(yáng)性對(duì)照。 '
3. (3淀粉樣蛋白(A P )聚集測(cè)定
將AP (1-40) lO(iM與藥物RNFG(l-100 |oM)溶解于水中，37 °C溫育4天。 利用熒光試劑ThT (5|oM )測(cè)定A (3的聚集程度(SPECTRA max GEMINI XS)。對(duì)照 結(jié)果參見(jiàn)附圖5， lO)oMAe (1-40)， 37 。C溫育4天可以發(fā)生聚集。RNFG可以 抑制Ap的聚集，并呈劑量依賴性，剛果紅為陽(yáng)性對(duì)照。
4. Ap細(xì)胞毒性測(cè)定
PC-12和腦皮層細(xì)胞種在96孔板上，每孔細(xì)胞密度約5xl()3和3xl(T個(gè)，加 藥之前更換培養(yǎng)液，加藥后48和72小時(shí)加入A P (0-100 yM) , 24小時(shí)后取樣， 樣品進(jìn)行MTT測(cè)定和培養(yǎng)基LDH含量測(cè)定。每孔加0. lmg MTT, 37°C培養(yǎng)1小時(shí)， 每孔加150ul DMSO溶解形成的p夫喃結(jié)晶，在570nm用Opsys Microplate Reader (Thermo Labsystems， MA, USA)測(cè)定光密度。收集培養(yǎng)基離心后的上層，加入LDH反應(yīng)試劑(Roche， Mannheim, Germany),室溫20分鐘，測(cè)定光密度。實(shí)驗(yàn)資料以三次實(shí)驗(yàn)的平均值，每次平行做三個(gè)孔。對(duì)照結(jié)果參見(jiàn)附圖6, PC12細(xì)胞和腦皮層細(xì)月包中，10-100 joM A p可以通過(guò)減少神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)力和增加LDH的釋放，具有神經(jīng)毒性。RNFG可以抑制A p在神經(jīng)細(xì)胞PC12和腦皮層細(xì)胞的毒性，并呈劑量依賴性，NGF為陽(yáng)性對(duì)照。
實(shí)驗(yàn)例4: RNFG的神經(jīng)保護(hù)機(jī)理
1. 細(xì)胞凋亡
DNA降解和內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶(Caspase-3)的活化是細(xì)J包凋亡的重要生化指標(biāo)。培養(yǎng)2周左右的大鼠腦皮層神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)過(guò)RNFG(100nM)給藥24個(gè)小時(shí)，加入AP (10 |_iM) 24小時(shí)后，溶解細(xì)胞，離心，收集上清液，^是取DNA,經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳。對(duì)照結(jié)果參見(jiàn)附圖7, RNFG可以減少A P引起的神經(jīng)細(xì)胞DNA降解，星形孢菌素(Staurosporin)為DM降解陽(yáng)性對(duì)照。另一方面，給藥后的神經(jīng)腦皮層細(xì)胞溶解液，進(jìn)行Western blot測(cè)定。對(duì)照結(jié)果參見(jiàn)附圖7, RNFG可以減少AP引起的神經(jīng)細(xì)胞Caspase-3活化，并呈時(shí)間依賴性，星形孢菌素(Staurosporin)為Caspase-3活化的陽(yáng)性對(duì)照。
2. 細(xì)胞內(nèi)鈣離子流動(dòng)測(cè)定
鈣離子的內(nèi)流是神經(jīng)細(xì)胞凋亡的上游信號(hào)。培養(yǎng)2周左右的大鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞和PC12細(xì)胞經(jīng)過(guò)RNFG (100 (oM)給藥24個(gè)小時(shí)，加入Fluo-4-AM熒光標(biāo)記，加入Ap (10|oM)，實(shí)時(shí)測(cè)定鈣離子的流動(dòng)FlexStation II (MolecularDevices, Sunnyvale, CA)。對(duì)照結(jié)果參見(jiàn)附圖8, RNFG可以減少A p引起的神經(jīng)細(xì)胞4丐離子內(nèi)流。
3. 三七黃酮RNFG神經(jīng)保護(hù)作用的構(gòu)效關(guān)系
選取與RNFG化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的化合物槲皮素(RNFG的黃酮醇母核)和,丁(與RNFG取代位相同的二糖黃酮醇苷，糖鏈組成不同)，在神經(jīng)細(xì)胞中測(cè)定對(duì)A P聚集和細(xì)胞毒性。對(duì)照結(jié)果參見(jiàn)附圖9,槲皮素和,丁不具有抑制AP聚集和引起毒性的作用，NGF為陽(yáng)性對(duì)照。
實(shí)驗(yàn)例5: RNFG的抗癡呆作用
Sprague-Dawley大鼠(雌性，體重240g±20g),進(jìn)行被動(dòng)回避實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中，大鼠放入亮室10秒，之后進(jìn)入暗室，接受電刺激(0.6mA) 3秒，老鼠保 持記憶，學(xué)會(huì)躲避。RNFG、水和陽(yáng)性對(duì)照他克林(Tacrine)腹膜內(nèi)注射大鼠， 45min后，腹腔注射東蒗菪堿48小時(shí)，造成癡呆模型。進(jìn)行記憶保持能力測(cè)試， 測(cè)定步入潛伏期(老鼠)W亮室進(jìn)入暗室的時(shí)間)。對(duì)照結(jié)果參見(jiàn)附圖10, RNFG 增加了步入潛伏期，改善東萊菪堿對(duì)大鼠造成的記憶損傷，并呈劑量依賴性。
實(shí)施例1:
將RNFG和三七黃酮提取物(RNFG重量含量>50% )與輔料混合，輔料的用 量為l-10%,過(guò)篩后，可按照口服制劑的常規(guī)工藝制成口服制劑，如膠囊、片 劑、口服液等，作為防治和預(yù)防老年癡呆病的藥物和保健品。輔料可以為淀 粉、糊精、乳糖、微晶纖維素、羥丙甲基纖維素、聚乙二醇、硬脂酸鎂、微粉 硅膠。
實(shí)施例2:
將RNFG與輔料混合，輔料的用量為1-10%,過(guò)篩后，可按照口服制劑的常 規(guī)工藝制成口服制劑，如膠嚢、片劑、口服液等，作為防治和預(yù)防老年癡呆 病的藥物和保健品。輔料可以為淀粉、糊精、乳糖、微晶纖維素、羥丙曱基 纖維素、聚乙二醇、硬脂酸鎂、微粉硅膠。
實(shí)施例3:
取三七黃酮提取物浸膏，噴霧制粒，干燥，整粒，即得本發(fā)明所述的口服 顆粒劑，作為防治和預(yù)防老年癡呆病的藥物和保健品。
實(shí)施例4
用少量生理鹽水溶解RNFG,加入吐溫80適量，研磨均勻，再加生理鹽水 后脫色，裝于鹽水瓶中，密封> 沸水加熱滅菌，調(diào)節(jié)pH至5，抽濾至溶液澄明， 即得注射液。
實(shí)施例5:
將RNFG與輔料混合，輔料的用量為5-20%,用注射用水溶解，調(diào)節(jié)pH至6-7,脫色，抽濾，至溶液澄明，再用微孔濾膜精濾，冷凍干燥，即得粉針劑。輔料可以為乳糖、葡萄糖、甘氨酸、甘露醇、聚乙二醇。
權(quán)利要求
1、一種預(yù)防和治療阿爾茨海默氏癥的藥物，其特征在于其有效成分為從原料藥三七中提取的槲皮素-3-0-β-D-吡喃木糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷RNFG。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種預(yù)防和治療阿爾茨海默氏癥的藥物，其特征在于該藥物還包含輔料，制成臨床接受的片劑、口服液、針劑、膠嚢劑。
3、 一種制備如權(quán)利要求1所述的預(yù)防和治療阿爾茨海默氏癥的藥物的方法，其特征在于取三七原藥材粉碎，過(guò)200目篩，用70%乙醇提取，濃縮，經(jīng)過(guò)聚酰胺柱，依次以水、30°/。乙醇和50%乙醇洗脫，30%乙醇洗脫部分溶于曱醇，作為粗黃酮部分進(jìn)一步經(jīng)過(guò)葡聚糖LH40柱層析，由曱醇洗脫，洗脫部分再經(jīng)過(guò)RP-C18柱分離，以30%、 35%、 40%、 45%、 50%的甲醇-水梯度洗脫，經(jīng)過(guò)TLC檢測(cè)，得到槲皮素-3-0-P-D-吡喃木糖基(1 —2)-p-D-吡喃半乳糖苷RNFG。
4、 從原料藥三七中提取的槲皮素-3-0-(3-D-吡喃木糖基(1 — 2) -p-D-吡喃半乳糖苷RNFG在預(yù)防和治療阿爾茨海默氏癥的保健品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種預(yù)防和治療阿爾茨海默氏癥的藥物，其有效成分為從原料藥三七中提取的槲皮素-3-O-β-D-吡喃木糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷。本發(fā)明的藥物的有效成分RNFG，具有雌激素活性、抗氧化活性、抑制Aβ聚集和毒性的神經(jīng)保護(hù)作用，可以減少東莨菪堿引起的記憶損傷，可以用來(lái)制備能夠預(yù)防和治療AD的藥物和保健品，提取用原料藥材常見(jiàn)，獲取容易。
文檔編號(hào)A61P25/28GK101543505SQ20091013816
公開(kāi)日2009年9月30日 申請(qǐng)日期2009年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月29日
發(fā)明者董婷霞, 詹華強(qiáng) 申請(qǐng)人:香港科技大學(xué)