專利名稱：Rg1、Rb1、甘草酸組方的抗抑郁藥物組合物及制法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以人參皂甙Rgl、Rbl、甘草酸(或甘草次酸)為原料制成的用于治療 抑郁癥的藥物組合物，可將其作為藥物、營養(yǎng)劑和保健食品使用。本發(fā)明還涉及上述用于治 療抑郁癥的藥物組合物的制備方法。
背景技術(shù)：
抑郁癥是一種常見的疾病，據(jù)統(tǒng)計在一般人口中大約有25%女性在其一生中經(jīng)歷 過抑郁癥，男性中約有10%左右經(jīng)歷過抑郁癥(張春興著《現(xiàn)代心理學(xué)》)。世界衛(wèi)生組 織(WHO)提供的數(shù)據(jù)抑郁癥在全世界的發(fā)病率約為11%，目前全球約有3. 4億精神憂郁 患者，而且這個數(shù)字仍成上升趨勢，調(diào)查發(fā)現(xiàn)在今后20年，抑郁癥將會上升為全球第二大 常見疾病?，F(xiàn)有技術(shù)中，抗抑郁藥物以百憂解、賽樂特、左洛復(fù)等(SSRI、SNRI, NDRI等類的 5-HT、NE、DA再攝取抑制劑)為主，其作用機(jī)制是通過調(diào)節(jié)人體內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)(5-HT、NE 等)含量以緩解抑郁癥狀。但是，已問市的抗憂郁藥物都有不同程度的副作用，例如增加 自殺率、頭痛、頭暈、暈眩、失眠、嗜睡、耳鳴、□干、厭食、食欲增力卩、體重上升、血壓上升、腸 胃不適、反胃、惡心、嘔吐、消化不良、腹瀉、便秘、下肢痛、皮膚出疹、顫抖、痙攣、多汗、水腫、 性欲降低、性無能等。近年來百憂解等抗憂郁藥物已成為社會嚴(yán)重關(guān)注的問題，美國食品暨 藥物管理局(Food and Drug Administration,FDA)更于2004年要求藥廠將市場上主要的 32種抗抑郁藥物重新標(biāo)示其副作用和警告的部分，并對醫(yī)護(hù)人員強(qiáng)調(diào)這些藥物可能增加兒 童及青少年自殺的機(jī)率。其中，賽樂特早在1996年就被發(fā)現(xiàn)存在有安全隱患，自2001年開 始陸續(xù)被從市場上召回。2004年6月，美國紐約州總檢察長指控英國葛蘭素史克公司為了 獲取利潤，欺騙性隱瞞了服用賽樂特與“增加青少年自殺傾向及行為的風(fēng)險”之間有關(guān)聯(lián)的 研究報告。在這種背景下，如何研發(fā)新一代副作用低又能有明顯抗憂郁作用的藥物已成為 全球醫(yī)藥界所關(guān)注的問題。近年來，國際醫(yī)藥界的科學(xué)家們在抑郁癥致病機(jī)理的研究方面出現(xiàn)了新的突破， 發(fā)現(xiàn)除了以5-HT、NE、DA的再攝取抑制方式治療憂郁癥之外，還可以通過調(diào)節(jié)受體后治療 抑郁癥，而其代表藥物羅列普拉(Rolipram)的問世，使受體后作用機(jī)制的抗抑郁藥物成為 醫(yī)藥界研發(fā)的熱點。羅列普拉是4型磷酸二酯酶(phosphodiesterase 4，PDE4)的抑制劑， 臨床試驗表明其具有明顯的抗憂郁作用，但由于服用羅列普拉會出現(xiàn)強(qiáng)烈嘔吐，故被迫終 止臨床試驗，然而羅列普拉卻開拓了新一代“受體后作用機(jī)制抗憂郁藥物”的研發(fā)思路。綜上所述，申請人在了解了公知技術(shù)中所具有的局限性后，經(jīng)過悉心研究與探索， 并本著鍥而不舍的精神，終于發(fā)現(xiàn)了 “以人參皂甙Rgl、Rbl、甘草酸(或甘草次甘草酸)為 原料治療憂郁癥的藥物組合物及其制法”。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有抗抑郁藥物的不足，發(fā)明人結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和藥理學(xué)理論對傳統(tǒng)中藥治療憂郁癥的病機(jī)和作用機(jī)理進(jìn)行了研究，并在此基礎(chǔ)之上提出本發(fā)明，目的在于提供一 種以人參皂甙Rgl、Rbl、甘草酸(或甘草次酸)為原料、按優(yōu)選配比制成的用于治療抑郁癥 的藥物組合物或保健食品。這種受體后抗抑郁的藥物組合物，特點是組方的三種原料人參 皂甙Rgl、Rbl和甘草酸(或甘草次酸)均為高純度的單體提取物(30 98% )，其功效成 分明確，作用機(jī)理清楚，可以量化，因此，用其制備的藥物質(zhì)量可控，穩(wěn)定，療效明顯，安全性 高，服用方便，且可快速起效。本發(fā)明的另一目的，是提供上述以人參皂甙Rgl、Rbl、甘草酸(或甘草次酸)為原 料所制成的用于治療憂郁癥的藥物組合物或保健食品的制備方法。本發(fā)明藥物的解決方案和組方是經(jīng)發(fā)明人潛心研究探索和篩選的結(jié)果，依據(jù)現(xiàn)代 醫(yī)學(xué)治療憂郁癥的病理及藥理學(xué)理論，特別是結(jié)合受體后作用機(jī)制抗憂郁藥靶標(biāo)研究，經(jīng) 過大量的動物實驗證明人參皂甙Rgl、Rbl、甘草酸(或甘草次酸)均為cAMP磷酸二酯酶 抑制劑，它們相互配伍，協(xié)同作用，可透過血腦屏障，快速激活海馬區(qū)cAMP-PKA通路，提升 CREB和BDNF的表達(dá)，故其具有明顯的抗抑郁功能。另外，人參皂甙Rgl、Rbl、甘草酸(或甘 草次酸)，雖各自都有一定程度的抗抑郁作用，但小鼠懸尾正交實驗篩選的結(jié)果證明，它們 三者優(yōu)選配比組合物(即本發(fā)明的優(yōu)選藥物組合物)的抗抑郁作用要明顯強(qiáng)于其中任何一 個單體，因此，本發(fā)明藥物組合物相對于人參皂甙Rgl、Rbl、甘草酸(或甘草次酸)在抗抑 郁作用上具有新穎性和創(chuàng)造性。人參、甘草是中醫(yī)食補(bǔ)藥膳常用的藥材和食品，在千百年的 食用和臨床使用中已充分證明人參、甘草二者配伍的安全性、合理性，而從人參、甘草中提 取的人參皂甙Rgl、Rbl、甘草酸(或甘草草次酸)三者配伍制成的藥物或保健食品，同樣副 作用小，可以長期服用，用于進(jìn)行調(diào)理性的治療。為完成本發(fā)明的目的，特提出以下技術(shù)方案。本發(fā)明揭露了一組用于治療抑郁癥的藥物組合物，所述藥物組合物是由包括人參 皂甙Rgl、Rbl、甘草酸(或甘草次酸)為原料所制成。本發(fā)明的藥物組合物，是由包括1 100重量份人參皂甙Rgl、0. 5 100重量份 人參皂甙Rbl、0. 5 100重量份甘草酸(或甘草次酸)的原料所制成。優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物組合物，是由包括10重量份的人參皂甙Rgl、5 10重量份 的人參皂甙Rbl、5 10重量份的甘草酸(或甘草次酸)的原料制成。本發(fā)明的藥物組合物，人參皂甙Rgl的純度為30 98 %、Rbl的純度為30 98 %、 甘草酸(或甘草次酸)的純度為30 98 %。本發(fā)明的藥物組合物，人參皂甙Rgl的優(yōu)選純度為90%，Rbl的優(yōu)選純度為90%， 甘草酸(或甘草次酸)的優(yōu)選純度為90%。本發(fā)明還揭露了一種用于治療憂郁癥的藥物組合物的制備方法(a)將1 100重量份人參皂試RgUO. 5 100重量份人參皂試RbUO. 5 100 重量份甘草酸(或甘草次酸)混合粉碎，即得本發(fā)明藥物組合物。(b)將1 100重量份人參皂試RgUO. 5 100重量份人參皂試RbUO. 5 100
重量份甘草酸(或甘草次酸)與淀粉、乳糖、微粉硅膠等輔料一起混合粉碎，即得本發(fā)明藥 物組合物。上述制備方法中三種原料的優(yōu)選配比，是由包括10重量份的人參皂甙Rgl、5 10 重量份的人參皂甙Rbl、5 10重量份的甘草酸(或甘草次酸)的原料制成。
優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物組合物可以加工制成劑型，該劑型選自錠劑、膠囊劑、散劑、 片劑、粉劑、溶液劑、微囊劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、滴丸劑、丸劑及藥劑學(xué)上的口服藥物劑
型之一。優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物組合物可以包括藥學(xué)上可接受的載體或添加劑。優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物組合物還可用來制成保健食品和營養(yǎng)劑。上述的藥物組合物是實現(xiàn)本發(fā)明目的的核心配方，在本發(fā)明公開后，本領(lǐng)域的技 術(shù)人員可以根據(jù)中醫(yī)理論或是相關(guān)現(xiàn)代藥理學(xué)理論，對上述藥物組合物進(jìn)行常規(guī)的加減化 裁。這種常規(guī)的加減化裁是本領(lǐng)域技術(shù)人員的一般性技術(shù)活動，只要是在本發(fā)明藥物組合 物的配方基礎(chǔ)上所進(jìn)行的一般性技術(shù)加減，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。通過參閱附圖及詳細(xì)說明可以更好地了解本發(fā)明。附圖概述

圖1制備本發(fā)明實施例1、實施例3藥物的方法流程示意2制備本發(fā)明實施例2藥物的方法流程示意圖。圖3實施例3小鼠強(qiáng)迫游泳不動時間試驗結(jié)果圖。圖4實施例1給藥8h后，大鼠海馬組織中Cyclic AMP的含量變化結(jié)果圖。圖5為實施例1給藥8h后，cAMP-D印endent PKA活性實驗中典型的凝膠電泳照 片。圖6為實施例1給藥8h后，大鼠海馬組織中cAMP-D印endent PKA活性差異結(jié)果 圖。圖7實施例1給藥8h后，大鼠海馬組織中P-CREB的含量變化結(jié)果圖。圖8實施例1對大鼠海馬組織中PDE活性的影響結(jié)果圖。
具體實施例以下將結(jié)合附圖和具體實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。實施例1按圖1制備本發(fā)明實施例1藥物。按圖1的方法流程示意圖，直接將已制備成純 度為90%的IOOg人參皂甙Rgl、純度為90%的IOOg人參皂甙Rbl和純度為90%的IOOg 甘草酸混合粉碎，即得300g本發(fā)明藥物實施例1。實施例2按圖2制備本發(fā)明實施例1藥物。按圖2的方法流程示意圖，直接將已制備成純 度為92%的IOOg人參皂甙Rgl、純度為95%的IOOg人參皂甙Rbl、純度為93%的IOOg甘 草酸，與20g淀粉、IOg乳糖、IOg微粉硅膠一起混合粉碎，制成1000粒膠囊，即得本發(fā)明藥 物實施例2。實施例3按圖1制備本發(fā)明實施例3藥物。按圖1的方法流程示意圖，直接將已制備成純 度95%的IOOg人參皂甙Rgl、純度92%的50g人參皂甙Rbl和純度91 %的50g甘草次酸 混合粉碎，即得200g本發(fā)明藥物實施例3。具體實驗例實驗例1
(1)實驗名稱人參皂甙Rgl、Rbl、甘草酸各種不同組合抗抑郁作用的篩選研究(2)實驗?zāi)康暮Y選人參皂甙Rgl、Rbl、甘草酸三種原料抗抑郁的優(yōu)選配比組合。(3)實驗材料動物ICR小鼠，雄性，體重20 士 lg，由維通利華動物實驗中心提供。藥物受試藥物人參皂甙Rgl、Rbl與甘草酸，北京歐納爾生物工程技術(shù)有 限公司提供；陽性藥物鹽酸氟西汀膠囊(百優(yōu)解)，禮來蘇州制藥有限公司，批號 A333341-070608，國藥準(zhǔn)字 了20030017，日服用量，20mg/ 日。(4)實驗器材JZ型300g張力換能器(高碑店市新航積淀設(shè)備有限公司)，Medlab生物信號采 集處理系統(tǒng)(南京易美)(5)實驗方法1、人參皂甙Rgl (A)、Rbl⑶、甘草酸(C)組合的正交設(shè)計采用正交試驗的方法，以小鼠懸尾不動時間為指標(biāo)，對Rgl (A)、Rbl (B)、甘草酸 (C)的劑量和組合進(jìn)行優(yōu)選。因素水平表、正交試驗表分別如下表1 因素水平表 根據(jù)因素水平表和正交試驗表，給藥方案如下表所示表3 給藥方案表 2、分組給藥每組實驗將正常小鼠按體重隨機(jī)分成11個組，每組20只，即給藥1-9組、陽性藥 鹽酸氟西汀膠囊(Y組，3. 5mg/kg/d)，空白對照組。各組均按0. 2ml/10g體重給藥，連續(xù)給 藥2天。3、測試方法以上各組均連續(xù)給藥2天，分別于第2天給藥后Ih進(jìn)行實驗。將小鼠尾端(在距 尾尖2cm處)用膠布固定在IOOg張力換能器的連線上，使其呈倒懸狀態(tài)，頭部離實驗臺約 15cm,每次同時測試2只動物，相互之間用紙板隔開。換能器連接到Medlab生物信號采集 處理系統(tǒng)，適應(yīng)2min后，記錄4min之內(nèi)的結(jié)果，將不動狀態(tài)換算成時間(s)。4、實驗結(jié)果表4小鼠懸尾實驗結(jié)果
劑量(mg/kg)樣本數(shù)不動時間(x±s)
nnj OH nrrj nnj DH DH nzd π& Rn OH mj
自訇自經(jīng)經(jīng)經(jīng)紹經(jīng)經(jīng)經(jīng)經(jīng) 白性一 二三四五六七八九 空陽第第第第第第第第第
與空白組比較，*P< 0. 05**P < 0. 01表5 L9 (34)正交試驗表 分析結(jié)果①最佳組合是AlBlCl 和 A1B2C2，即 Rg1IOmg, Rb1IOmg,甘草酸 IOmg 和 Rg1IOmg, Rb^mg、甘草酸 5mg。②Rg1W貢獻(xiàn)度最大。③單獨的Rgl10mg、RbJOmg、甘草酸5mg都有抗實驗性抑郁功效，但從篩選實驗數(shù) 據(jù)上可看出效果是呈遞減的趨勢6、結(jié)論通過正交實驗的比較，提示RgJOmg、Rb1IOmg甘草酸IOmg組合用藥 (10mg+10mg+10mg)具有顯著而穩(wěn)定的抗抑郁藥效，單獨的Rgl、Rb1、甘草酸雖然也可抗抑 郁，但不如三者組合用藥的功效強(qiáng)和穩(wěn)定(本發(fā)明藥物組合物實施例1、實施例2即按該優(yōu) 化配比進(jìn)行組方制備的)。實驗例2實施例3對小鼠強(qiáng)迫游泳實驗的影響動物KM小鼠，雄性(20士2g)，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所(合格證號 SCXK(京)2004-0001)，動物飼養(yǎng)于明暗交替(12h:12h)清潔級動物房中，自由進(jìn)食飲水。動 物在動物房中適應(yīng)環(huán)境3天后開始進(jìn)行實驗。強(qiáng)迫游泳實驗中，實施例3對慢性應(yīng)激抑郁小鼠的不動時間的影響.實驗結(jié)果顯示實施例3可縮短小鼠在強(qiáng)迫游泳試驗中的不動時間，且低劑量組 顯示出更好的趨勢，但兩個劑量組之間無明顯差異。實驗結(jié)果表明，實施例3可減少小鼠強(qiáng)迫游泳不動時間，與對照組相比*P <0. 05, **P < 0. 01，means +SD, η = 12(見圖 3)。實驗例3 實施例1對正常小鼠海馬內(nèi)cAMP、PKA、CREB, BDNF的影響1.實驗器材1. 1實驗動物
健康雄性SD大鼠，體重180_200g，70只，購于北京維通利華動物試驗中心。1. 2 試劑Parameter Cyclic AMP Assay Kit，KGE002 (美國 R&D Systems, Inc. ) ；DuoSet IC Human/Mouse/Rat Phospho-CREB (S133) ELISA Kit，DYC2510-2 (美國 R&D Systems, Inc.)；PepTag Assay for Non-Radioactive Detection of cAMP-DependentProtein Kinase Kit, V5340 (美國 Promega Corporation.)；PDE-Glo Phosphodiesterase Assay Kit, V1361 (美國 Promega Corporation.)；Pierce BCA Protein Assay Kit, 23227,(美國 Thermo)；鹽酸帕羅西汀(批號08030078，中美天津史克制藥有限公司)；環(huán)磷酸腺苷、腺苷等對照品購自中國藥品生物制品檢定所；實施例1由北京歐納爾生物工程技術(shù)有限公司提供；NaH2P04、Na2HP04、KH2P04、KC1、NaCl、MgCl2、Tris Base、Tris-HCl 等試劑均為細(xì)胞 培養(yǎng)級生化試劑，購自美國Sigma公司；E-64、APROTININ、LEUPEPTIN、P印statin A、PMSF、NaF、EDTA、EGTA、DTT、NaV04、 Sodium pyrophosphate、瓊脂糖、甘油等試劑均為高純級，購自加拿大BioBasic公司；乙腈、甲醇(色譜純，德國MERCK公司)；超純水(MilliQ純水，本單位自制)。1. 3實驗儀器FlexStation 3 多功能微子L板分析儀(美國 Molecular DevicesCorporation.)； Waters600E高效液相色譜儀(四元泵、在線脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、紫外檢測器，美國 Waters 公司)；冷凍離心機(jī)(美國BECKMAN公司)；電子超聲勻菜器(美國UNTRAS0UND TECHNOLOGY公司)；電泳儀(北京六一儀器廠)；凝膠成像儀(SYN GENE公司)；ULTRA LOW超低溫冰箱(日本SANYO公司)；mLine單道移液器、8道移液器(芬蘭Biohit公司)。2.給藥大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)三天后，隨機(jī)分為3個組，分別標(biāo)記為A生理鹽水組、B帕羅西汀 組、C實施例1組。鹽酸帕羅西汀片碾碎，用超純水配成一定濃度的混懸液，大鼠灌胃給藥 劑量為5mg/kg ；實施例1取其內(nèi)容物用水配成一定濃度的溶液，大鼠灌胃給藥劑量為30mg/ kg ；生理鹽水組給予等體積的0. 9%生理鹽水；給藥之前所有大鼠稱重并用苦味酸標(biāo)記，所 有藥物均在37°C下預(yù)熱30min后給藥。3.取材 A、B、C三組實驗動物給藥8h后，乙醚麻醉，股動脈放血處死，冰上斷頭取腦，分取 海馬組織，精細(xì)切割成三份，分別置于預(yù)先編號標(biāo)記的1. 5mL彩蓋螺口凍存管中，準(zhǔn)確稱重 后迅速投入液氮中速凍15min，再置于-80°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?.樣本檢測4. 1大鼠海馬組織中Cyclic AMP含量測定將海馬組織樣本解凍，用少量生理鹽水沖洗，再按1 20(g mL)的比例加入試劑盒提供的細(xì)胞裂解液(將5倍濃縮液稀釋后使用)，電子超聲勻漿器勻漿30s，4°C下 lOOOOrpm冷凍離心5min，取上清液置于預(yù)先編號的1. 5mL彩色Eppendorf離心管中，置于 冰盒內(nèi)，待測。應(yīng)用美國R&D Systems公司Parameter Cyclic AMP Assay ELISA試劑盒進(jìn) 行樣本檢測。將樣品恢復(fù)至室溫，按試劑盒說明書采用競爭性ELISA法測定樣品中Cyclic AMP含量。用多孔板分析儀在450nm下測定0D值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣本中Cyclic AMP 含量。4. 2大鼠海馬組織中cAMP-D印endent PKA活性測定將海馬組織樣本解凍，用少量生理鹽水沖洗，再按1 10 (g mL)的比例加入PKA extraction buffer (按照試劑盒中配方配制)，電子超聲勻漿器勻漿30s，4°C下lOOOOrpm 離心5min，取上清液置于預(yù)先編號的1. 5mL彩色Eppendorf離心管中，置于冰盒內(nèi)，待測。應(yīng) 用美國 Promega 公司 PepTag Assayfor Non-Radioactive Detection of cAMP-Dependent Protein Kinase試劑盒進(jìn)行檢測分析。在預(yù)先編號的200 y L PCR八聯(lián)管中按照試劑盒說明 書加入預(yù)混的試劑，分別取L各樣本對號加入各管中，渦旋混勻，離心，室溫反應(yīng)30min， 然后置于PCR儀中98°C5min對酶進(jìn)行滅活。實驗中按照說明書要求分別設(shè)置正對照與負(fù)對 照管，隨行實驗。制備0.8%的瓊脂糖凝膠，將酶反應(yīng)后的樣本各取lOyL加入凝膠的梳孔 中，100V，130mA電泳30min,電泳液為50mM Tris-HCl (pH 8. 0)緩沖液。電泳后將瓊脂糖凝 膠取出，凝膠成像儀照相，然后置于紫外分析儀上，將已磷酸化反應(yīng)的P印Tag A1P印tide斑 點切下，分別置于預(yù)先編號標(biāo)記的1. 5mL彩蓋螺口凍存管中。加熱使瓊脂糖凝膠融化，用超 純水定容到250 iiL，迅速取出125 iiL加入預(yù)先編號的1. 5mL彩色Eppendorf離心管中，再 加入75 y L試劑盒提供的溶膠液和50L冰醋酸，渦旋混勻，取200 y L加入96孔酶標(biāo)板中，以 負(fù)對照管正極方向瓊脂糖為空白對照，在多孔板分析儀上進(jìn)行熒光分析。設(shè)定Excitation Wavelength 568nm, Emission Wavelength 592nm。以樣本焚光強(qiáng)度表示 PKA 活性。4. 3大鼠海馬組織中p-CREB含量測定應(yīng)用美國R&D Systems 公司 DuoSet IC Human/Mouse/Rat Phospho-CREB(S133) ELISA試劑盒進(jìn)行樣本檢測。將海馬組織樣本解凍，用少量生理鹽水沖洗，再按 1 20(g mL)的比例加入組織勻漿液(按照試劑盒中IC DELUENT6#配方配制)，電子 超聲勻漿器勻漿30s，4 °C下lOOOOrpm離心5min，取上清液置于預(yù)先編號的1. 5mL彩色 Eppendorf離心管中，置于冰盒內(nèi)，待測。測定時將樣品恢復(fù)至室溫，按試劑盒說明書采用 sandwich ELISA法測定樣品中p_CREB含量。用多孔板分析儀在450nm下測定0D值，根據(jù) 標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣本中p-CREB含量。4. 4大鼠海馬組織中總蛋白測定為了更準(zhǔn)確標(biāo)定樣本中每毫克蛋白所含的p-CREB蛋白的量，需要對樣本的總蛋 白含量進(jìn)行測定。取P-CREB測定試驗中的組織勻漿離心后的上清液，用PBS稀釋25倍后， 作為測試樣本，按照Pierce BCA Protein Assay Kit試劑說明書，用多孔板分析儀在562nm 下測定0D值，以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣本中總蛋白含量。4.5磷酸二酯酶(PDE)活性測定使用美國Promega公司生物發(fā)光法(Bioluminescent) PDE-GloPhosphodiesterase Assay試劑盒測定實施例1對大鼠腦海馬組織中PDE活性的影 響。
4. 5.1藥液配制實施例1取內(nèi)容物配制成0. 02mg/mL、0. 05mg/mL和1. Omg/mL三個濃度。4. 5. 2樣品制備取一定量的海馬組織，少量生理鹽水沖洗后，按1 10(g mL)的比例加入 PDE-Glo Reaction Buffer (Tris-HCl 40mM, MgCl210mM, BSA 0. lmg/ml，另加入 PMSF ImM, leupetin 2 u M/mL, aprotinin 2 u M/mL, E-642 ii M/mL)，電子超聲器勻漿，4°C下 14000rpm 離心30分鐘，取上清液作為酶液，備用。4. 5. 3生物發(fā)光法測定按照試劑盒說明書提供的方法進(jìn)行操作，酶反應(yīng)液部分，加入1 P L藥液，1.5UL 酶液，共2. 5 ii L ；加入含有2 u mol Cyclic AMP的底物溶液2. 5 u L,混勻，37°C反應(yīng)30min, 然后加入含有PDE強(qiáng)抑制劑IBMX的反應(yīng)終止溶液2. 5 y L，混勻；加入測試溶液2. 5 y L，混 勻，室溫反應(yīng)20min ；最后加入發(fā)光試劑10 y L，室溫反應(yīng)lOmin后在多功能微孔板分析儀上 進(jìn)行測試。五、實驗結(jié)果1.大鼠海馬組織中Cyclic AMP含量用ELISA法測定了大鼠海馬組織勻漿液中Cyclic AMP濃度，除以稱量的組織樣本 重量，得到海馬組織中含有的Cyclic AMP的含量，以pmol/g Tissue表示。實施例1組與生理鹽水組和帕羅西汀組比較，大鼠海馬組織中Cyclic AMP的含量 顯著升高，*P < 0. 05，n = 10 (見圖4)。2.大鼠海馬組織中cAMP-D印endent PKA活性酶反應(yīng)后，樣本進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀照相，進(jìn)行粗略分析。泳道自左至右1-4生理鹽水組；5-8帕羅西汀組；9-11實施例1組；12正對照樣 本；13負(fù)對照樣本(見圖5)。磷酸化的A1肽帶有負(fù)電荷，向正極方向移動；未磷酸化的A1肽帶有正電荷，向負(fù) 極方向移動，將二者分開。其中向正極方向移動的已磷酸化的A1肽斑點亮度越高，表明磷 酸化水平越高，樣本中cAMP-Dependent PKA活性越高。圖中可見實施例1組樣本正極方向 斑點亮度較生理鹽水組和帕羅西汀組亮度更高。切割瓊脂糖凝膠斑點，熔膠后定容，以熒光法測定大鼠海馬組織中 cAMP-Dependent PKA活性，以熒光強(qiáng)度表示給藥8h后，實施例1組與空白對照組和帕羅西汀組比較，大鼠海馬組織中 cAMP-D印endent PKA 活性顯著升高，*P < 0. 05，n = 10 (見圖 6)。3.大鼠海馬組織中總蛋白含量用BCA法測定了大鼠海馬組織樣本勻漿液中總蛋白的濃度，用以標(biāo)定每Pg總蛋 白中含有P-CREB的量。結(jié)果見表1 :表1大鼠海馬組織樣本勻漿液總蛋白濃度(P g/mL) 4.大鼠海馬組織中p-CREB含量采用sandwich ELISA法測定了大鼠海馬組織樣品勻漿液中p_CREB濃度，并以 p-CREB(pg)/總蛋白(yg)表示大鼠海馬組織中p-CREB含量。給藥8h后，實施例1組與生理鹽水組和帕羅西汀組比較，大鼠海馬組織中p-CREB 的含量升高，統(tǒng)計學(xué)無顯著性差異，n = 10(見圖7)。5.藥物對大鼠海馬組織中磷酸二酯酶(PDE)活性影響用生物發(fā)光法測定了海馬組織中PDE的活性以及體外給予藥物后對PDE活性的抑 制作用。以發(fā)光強(qiáng)度表示PDE活性，與對照組比較，發(fā)光強(qiáng)度較高，說明PDE活性較高；發(fā)光 強(qiáng)度較低，說明PDE活性被抑制。與對照組相比，實施例1中劑量組PDE活性受到明顯抑制，*P < 0. 05，n = 4(見 圖8)。六、結(jié)論1.本實驗研究表明實施例1中劑量組可顯著抑制大鼠海馬組織中磷酸二酯酶的 活性，由于磷酸二酯酶是Cyclic AMP的滅活酶，其受到抑制后可使大鼠海馬組織中Cyclic AMP含量升高。2.大鼠灌胃給藥8小時后，實施例1組與生理鹽水組和帕羅西汀組比較，腦海馬組 織Cyclic AMP含量顯著升高；cAMP-D印endent PKA活性顯著增強(qiáng)；p-CREB含量也有提高。3.本實驗證實了實施例1可以通過第二信使Cyclic AMP細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮 藥理作用，并在給藥8小時后即可快速激活cAMP-PKA-CREB(p-CREB)通路(與生理鹽水組 和帕羅西汀組相比有顯著差異，*P < 0. 05)。 4.同樣8小時給藥，陽性對照藥帕羅西汀不能激活cAMP-PKA-CREB (p-CREB)通路。
權(quán)利要求
一組用于治療憂郁癥的藥物組合物，所述藥物組合物是由包括人參皂甙Rg1、Rb1、甘草酸(或甘草次酸)為原料所制成。
2.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物進(jìn)一步由包括1 100重量 份人參皂甙Rgl、0. 5 100重量份人參皂甙Rbl、0. 5 100重量份甘草酸(或甘草次酸) 的原料所制成。
3.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其優(yōu)選為由包括10重量份的人參皂甙Rgl、5 10重量份的人參皂甙Rbl、5 10重量份的甘草酸(或甘草次酸)的原料制成。
4.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，人參皂甙Rgl的純度為30 98%、Rbl的純度為 30 98%、甘草酸(或甘草次酸)的純度為30 98%。
5.如權(quán)利要求4所述的藥物組合物，人參皂甙Rgl的優(yōu)選純度為90%、Rbl的優(yōu)選純 度為90%、甘草酸(或甘草次酸)的優(yōu)選純度為90%。
6.本發(fā)明揭露了一種用于治療憂郁癥的藥物組合物的制備方法(a)將1 100重量份人參皂甙Rgl、0.5 100重量份人參皂甙Rbl和0. 5 100重 量份甘草酸(或甘草次酸)混合粉碎，即得本發(fā)明藥物組合物。(b)將1 100重量份人參皂甙Rgl、0.5 100重量份人參皂甙Rbl、0. 5 100重量 份甘草酸(或甘草次酸)與設(shè)定量的淀粉、乳糖、微粉硅膠等輔料一起混合粉碎，即得本發(fā) 明藥物組合物。上述制備方法中三種原料的優(yōu)選配比，是由包括10重量份的人參皂甙Rgl、5 10重 量份的人參皂甙Rbl、5 10重量份的甘草酸(或甘草次酸)的原料制成，它們的純度為 30 98%，其中優(yōu)選純度為90%。
7.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述藥物含有選自藥學(xué)上可接受的載體、添 加劑及其組合。
8.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物制成劑型，該劑型選自錠劑、 膠囊劑、散劑、片劑、粉劑、溶液劑、微囊劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、滴丸劑、丸劑及藥劑學(xué)上 的口服藥物劑型之一。
9.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，還可將其制成保健食品或營養(yǎng)劑。
全文摘要
本發(fā)明公開一組包括以人參皂甙Rg1、Rb1、甘草酸(甘草次酸)為原料制成的用于治療抑郁癥的藥物組合物。本發(fā)明同時還公開有關(guān)上述藥物組合物的制備方法。實驗證明，本發(fā)明藥物組合物可明顯減少受試小鼠懸尾和強(qiáng)迫游泳不動時間，可快速激活大鼠海馬區(qū)CAMP-PKA通路，提升CREB、BDNF的表達(dá)，故本發(fā)明系受體后作用機(jī)制的抗抑郁藥物。
文檔編號A61P25/24GK101890032SQ20091014333
公開日2010年11月24日 申請日期2009年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月21日
發(fā)明者張作光 申請人:張作光