專利名稱：毛鉤藤堿在制備治療心肌損傷藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬制藥領(lǐng)域，涉及中藥鉤藤生物堿提取物毛鉤藤堿在制備靶器官保護(hù)藥物中的用途，尤其是在制備治療心肌損傷性心臟病藥物中的用途。
背景技術(shù)：
缺血缺氧心肌損傷，是近幾十年來在發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家導(dǎo)致死亡的首要原因。降低此類疾病的發(fā)病率和死亡率非常重要。心臟的
內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,S0D)、過氧化氫酶(catalase, CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx )和其它抗氧化劑。體內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species, R0S)產(chǎn)生增加，超過了內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的清除能力，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，可加速人體的衰老、增加腫瘤的發(fā)生率，也可引起心血管系統(tǒng)的損傷，加重心肌破壞的程度。動脈粥樣硬化、糖尿病、中風(fēng)等疾病過程中，氧化應(yīng)激的機(jī)制也不容忽視。
鉤藤是茜草科植物鉤藤、大葉鉤藤、毛鉤藤、華鉤藤或無柄果鉤藤的干燥帶鉤莖枝。已知鉤藤性甘、涼。歸肝、心包經(jīng)。具有清熱、平肝，息風(fēng)定驚的功效。現(xiàn)有技術(shù)公開了鉤藤具有持久、明確的降壓作用。
毛鉤藤堿(Hirsutine)屬吲哚類生物堿，是鉤藤中的天然有機(jī)化合物，是中藥鉤藤生物堿提取物中的主要有效成分。文獻(xiàn)報道Hirsutine具有抗甲型流感病毒，抑制利什曼原蟲，抗心律失常等活性。但至今未見有關(guān)Hirsutine對缺血缺氧損傷心肌細(xì)胞以及心肌損傷的作用的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供中藥鉤藤生物堿提取物毛鉤藤堿在制藥中
3的新用途，具體涉及毛鉤藤堿在制備治療心肌損傷性心臟病藥物中的用途，尤其是毛鉤藤堿在制備治療缺血缺氧心肌損傷心臟病藥物中的用途。
本發(fā)明按常規(guī)方法通過下述步驟制備鉤藤醇提取物毛鉤藤堿，
1) 取正品中藥鉤藤，粉碎后加濃度大于70%的乙醇，加熱提取
數(shù)次，過濾，合并濾液；
2) 濾液減壓濃縮成稠浸膏，加O. 1-10%鹽酸溶解、洗滌，取濾
液；
3) 堿性條件下，濾液加氯仿數(shù)次萃取后合并氯仿液；
4) 將氯仿液減壓濃縮后得鉤藤醇提取物；
5) 經(jīng)高壓液相色譜儀分離，獲或得式(I )結(jié)構(gòu)的鉤藤醇提取物毛鉤藤堿。
本發(fā)明所述的毛鉤藤堿分子式(:2211280^，1^368，結(jié)構(gòu)如下述<formula>formula see original document page 4</formula>
本發(fā)明對上述毛鉤藤堿進(jìn)行了缺氧心肌細(xì)胞實驗，檢測了經(jīng)毛鉤藤堿處理的缺氧心肌細(xì)胞的上清液，實驗結(jié)果顯示其中NO的濃度明顯提高，表明毛鉤藤堿能促進(jìn)體內(nèi)NO的生成。
本發(fā)明通過體外心肌細(xì)胞培養(yǎng)實驗，結(jié)果表明，毛鉤藤堿能提高細(xì)胞存活率，促進(jìn)NO生成；能可降低缺氧損傷心肌細(xì)胞LDH的漏出率；能可提高SOD的活性；可以抑制脂質(zhì)過氧化以及具有抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用，實驗結(jié)果表明所述的毛鉤藤堿可作為藥物用于治療心肌損傷尤其是缺氧缺糖心肌損傷心臟病。


圖.1是毛鉤藤堿對缺氧缺糖6 h損傷心肌細(xì)胞的存活率的影響， 其中，Control:正常對照組；Vehicle:模型組；a:模型組與正
常對照組相比，/ <0. 05; *:毛鉤藤堿各濃度處理組與模型組相比，
-0. 05。
圖2是毛鉤藤堿對缺氧缺糖6 h損傷心肌細(xì)胞的N0釋放量的影
響，
其中，Control:正常對照組；Vehicle:模型組，a:模型組與正 常對照組相比，；KO. 05 ; *:毛鉤藤堿各濃度處理組與模型組相比， ;KO. 05。
圖3是毛鉤藤堿對缺氧缺糖6 h損傷心肌細(xì)胞LDH漏出率的影響， 其中，Control:正常對照組；Vehicle:模型組；a:模型組與正
常對照組相比，/K0.05; *:毛鉤藤堿各濃度處理組與模型組相比，
-0. 05。
圖4是毛鉤藤堿對缺氧缺糖6 h損傷心肌細(xì)胞總SOD活力的影響， 其中，Control:正常對照組；Vehicle:模型組；a:模型組與正
常對照組相比，,0.05; *:毛鉤藤堿各濃度處理組與模型組相比，
/K0. 05。
圖5是毛鉤藤堿對缺氧缺糖6 h損傷心肌細(xì)胞MDA的影響， 其中，Control:正常對照組；Vehicle:模型組；a:模型組與正
常對照組相比，；KO. 05; *:毛鉤藤堿各濃度處理組與模型組相比，
;KO. 05。
圖6是毛鉤藤堿對缺氧缺糖6 h損傷心肌細(xì)胞Bcl-2、 Bax蛋白 表達(dá)的影響，
其中，1:正常對照組(Control); 2:模型組(Vehicle); 3毛鉤 藤堿10、01/1; 4:毛鉤藤堿l(T6 mol/l; 5:毛鉤藤堿l(T7 mo1/1。
具體實施方式
實施例l毛鉤藤堿提高細(xì)胞存活率，促進(jìn)N0生成實驗
原代培養(yǎng)3日齡SD乳鼠，無菌條件下取心臟于PBS中清洗，剪 碎，移入含有0. 08%胰酶的三角燒瓶中37。C消化IO分鐘，持續(xù)磁力 攪拌下共消化8次。每次消化后收集上清液，血清中止消化，2000 轉(zhuǎn)離心5分鐘，收集細(xì)胞沉淀調(diào)細(xì)胞密度為l(T6，培養(yǎng)在含10%小牛 血清的DMEM中，第三天用于實驗。分為正常對照組(不給于藥物千 預(yù)，不缺氧缺糖)、模型組(不給于藥物干預(yù)，缺氧缺糖6h)、毛鉤 藤堿藥物組(分別給予藥物10 —5mol/L、 10 —6mol/L、 10 —7mol/L缺氧 缺糖6h)。 MTT法檢測細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示(圖l)顯示，模型組 存活率明顯低于正常對照組，毛鉤藤堿各濃度均能明顯提高細(xì)胞存活 率，單因素方差分析；KO. 05。
取細(xì)胞上清液100jal，按NO試劑盒測定方法檢測NO。結(jié)果顯示 (圖2),模型組較正常對照組相比NO濃度明顯下降，單因素方差分 析/K0. 05,而毛鉤藤堿各濃度均能明顯提高上清液中H2S濃度 ;KO. 05。
實施例2.毛鉤藤堿降低缺氧缺糖損傷心肌細(xì)胞的LDH的漏出實驗
每組(n = 6)每個樣本取106個細(xì)胞，充分裂解，丙酮酸法檢測 細(xì)胞內(nèi)LDH的含量，正常對照組細(xì)胞內(nèi)LDH為100%，各濃度用藥組 與模型組細(xì)胞內(nèi)LDH與正常對照組的差值為LDH漏出率，在反應(yīng)體系 中產(chǎn)生l jamol丙酮酸為l單位，計算每單位/mg蛋白。結(jié)果顯示(圖 3),各濃度用藥組的LDH漏出率較模型組均明顯降低。
實施例3.毛鉤藤堿提高SOD活性實驗
羥胺法檢測S0D，每毫克組織蛋白在lml反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá) 50。/。時所對應(yīng)的SOD量為一個SOD活力單位(U)。結(jié)果顯示(圖4), 毛鉤藤堿各濃度用藥組均能夠明顯提高總SOD的活力，較模型組顯著 升高(,O. 05)。
6實施例4.毛鉤藤堿抑制脂質(zhì)過氧化實驗
氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作 用，并因此產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物丙二醛(MDA)。 MDA可與硫代巴比妥酸 (TBA)縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸收峰。結(jié)果顯示 (圖5),模型組MDA含量與正常對照組相比顯著增高，；K0.05。毛 鉤藤堿各濃度處理組較模型組均明顯降低，證實毛鉤藤堿可抑制活性 氧誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化。
實施例5.毛鉤藤堿可提髙Bel-2和降低Bax蛋白水平的表達(dá)
模型組Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低、Bax蛋白水平顯著增加 (-0. 05與正常對照組相比)，毛鉤藤堿各濃度處理組較模型組均明 顯增加Bcl-2蛋白表達(dá)水平和降低Bax蛋白水平的表達(dá)。毛鉤藤堿在 蛋白水平降低了凋亡相關(guān)因子Bax，提高抗凋亡因和子Bcl-2(圖6)。
權(quán)利要求
1、式(I)的毛鉤藤堿在制備治療心肌損傷性心臟病藥物中的用途，
2、 按權(quán)利要求1所述的用途，其特征是所述毛鉤藤堿通過提高細(xì)胞 存活率，促進(jìn)N0生成、降低缺氧缺糖損傷心肌細(xì)胞的LDH的漏出率、 提高SOD活性、抑制脂質(zhì)過氧化和/或抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用治療 心肌損傷性心臟病。
3、 按權(quán)利要求l所述的用途，其特征是所述心肌損傷性心臟病是缺 血缺氧心肌損傷心臟病。
全文摘要
本發(fā)明屬制藥領(lǐng)域，涉及毛鉤藤堿在制備心肌損傷藥物中的用途，尤其是在制備治療缺血缺氧心肌損傷藥物中的用途。本發(fā)明通過體外心肌細(xì)胞培養(yǎng)實驗，結(jié)果證明毛鉤藤堿可以提高細(xì)胞存活率，促進(jìn)NO生成；可降低缺氧缺糖損傷心肌細(xì)胞的LDH的漏出率；可提高SOD活性；可以抑制脂質(zhì)過氧化以及具有抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用，所述的毛鉤藤堿可作為治療藥物應(yīng)用于治療心肌損傷尤其是缺血缺氧心肌損傷心臟病。
文檔編號A61K31/4375GK101683338SQ20091015121
公開日2010年3月31日 申請日期2009年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月27日
發(fā)明者吳利新, 朱依純, 朱依諄 申請人:復(fù)旦大學(xué)