專利名稱：：一種腈水解酶基因、載體、工程菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種編碼腈水解酶的腈水解酶基因、含有該基因的重組載體、該重組載體轉(zhuǎn)化得到的重組基因工程菌，以及其在制備重組腈水解酶中的應(yīng)用。(二)
背景技術(shù)：
：腈水解酶(EC3.5.5)能夠催化腈水解生成相應(yīng)的羧酸和氨，是一類在自然界中廣泛存在的水解酶。腈水解酶是具有廣泛的底物適應(yīng)性的生物催化劑，由于天然腈化合物的廣泛存在，為發(fā)現(xiàn)和利用這種具有降解腈化合物的酶提供和創(chuàng)造了有利的條件。腈水解酶具有立體選擇性，利用這一特點(diǎn)，它可以催化合成各種光學(xué)純的酸。腈水解酶高效單一的反應(yīng)，優(yōu)良的選擇性使之在有機(jī)合成中表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力，不僅具有廣泛的工業(yè)應(yīng)用前景，而且也可以發(fā)展為合成手性分子及手性化合物的有力工具。腈水解酶在自然界廣泛存在。植物中主要有大麥科、十字花科、香蕉科以及蘿卜、燕麥、小麥的秧苗等。最近發(fā)現(xiàn)昆蟲和人體內(nèi)也存在腈水解酶。腈水解酶最多的來源是微生物，第一個(gè)能產(chǎn)腈水解酶的微生物菌種是可以利用天然腈化合物蓖麻堿(N-甲基_3-氰基-4-甲氧基-2-吡啶酮)作為唯一碳源篩選得到的假單孢菌(Pseudomonas)?？梢援a(chǎn)生腈水解酶的微生物菌株還有紅球菌屬(Rhodococcus)、桿菌屬(Alcaligenes)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、食酸菌屬(Acinetobacter)、以及曲霉菌屬(Aspergillus)和青霉菌屬(Penicillium)等。在不同底物的誘導(dǎo)下，同一微生物來源的腈水解酶有不同的活性。腈水解酶活性中心含有Glu-Lys-Cys三個(gè)殘基，腈水解酶中的半胱氨酸殘基上的巰基有強(qiáng)親核性，使整個(gè)催化水解反應(yīng)過程類似于一般化學(xué)反應(yīng)中堿催化下的氰基水解，巰基首先親核進(jìn)攻腈中的碳原子形成酶-亞胺中間體，再水合產(chǎn)生四面體中間體，該中間體除去氨轉(zhuǎn)變?yōu)轷；?酶中間體，后者水解產(chǎn)生羧酸，并使酶恢復(fù)原形。腈水解酶的活性部位不含金屬離子，因此絕大多數(shù)金屬離子及金屬離子螯合劑如氰基、重氮基、EDTA等對(duì)酶活力都沒有抑制作用。目前已經(jīng)有多種腈水解酶基因被克隆和測序，并且實(shí)現(xiàn)了在不同宿主中的表達(dá)。為了進(jìn)一步研究腈水解酶的結(jié)構(gòu)、探索酶的功能、并對(duì)酶進(jìn)行改良，國內(nèi)外不少研究者嘗試?yán)没蛲蛔兗夹g(shù)對(duì)腈水解酶基因進(jìn)行改造。1992年，Michihiko等克隆了RhodococcusrhodochrousK22的腈水解酶并利用定點(diǎn)突變的方法對(duì)該酶進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，cysl70位于該酶的活性位點(diǎn)上。張銳等人在進(jìn)行腈水解酶bxn基因克隆和改造時(shí)發(fā)現(xiàn)4處突變中2處突變能使基因表達(dá)產(chǎn)物喪失功能，l處使基因表達(dá)產(chǎn)物活性降低，1處對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)物活性基本無影響。進(jìn)一步將完全回復(fù)突變的bxn基因轉(zhuǎn)化煙草，獲得的轉(zhuǎn)基因煙草具有抗溴苯腈除草劑特性，結(jié)果證明結(jié)構(gòu)中的3處突變與活性中心功能有關(guān)。但由于定點(diǎn)突變位點(diǎn)的選擇比較困難，再加上研究周期長、效率低，因此在腈水解酶的應(yīng)用方面尚沒有突破。在腈水解酶家族中，由于目前發(fā)現(xiàn)的腈水解酶存在酶活較低，而且穩(wěn)定性較差等問題，利用腈水解酶進(jìn)行大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)存在一定的難度，這使得構(gòu)建腈水解酶基因工程菌具有重要意義，利用基因工程的手段來改善野生型產(chǎn)腈水解酶菌株的不足，為腈水解酶的工業(yè)化應(yīng)用提供了新思路并奠定了基礎(chǔ)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種腈水解酶基因、含有該基因的重組載體、該重組載體轉(zhuǎn)化得到的重組基因工程菌，以及其在制備重組腈水解酶中的應(yīng)用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是—種腈水解酶基因，具有SEQIDNO:l所示的核苷酸序列。該腈水解酶基因由如下方法得到利用PCR技術(shù)，在引物1(ATGGATCACCCGAAATTCAAAGC)、引物2(AATACCTTCTTGGTCAGTCGGC)的作用下，以來源于節(jié)桿菌(Arthrobacternitroguajacolicus)CCTCCM208252菌株中的總基因組DNA為模板克隆長約0.8kb的腈水解酶基因片段。將該片段連接到pMD18-T載體上獲得克隆載體pMD18-T-NIT和轉(zhuǎn)化了pMD18-T-NIT的重組大腸桿菌。對(duì)重組質(zhì)粒測序，并利用軟件對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行分析，該序列含有一個(gè)長為819bp的開放閱讀框。該基因核苷酸序列為1ATGGATCACCCGAAATTCAAAGCAGCTGCTATCCAGGCCGCACCGGTCTTCCTGAACCTG61GACGCGACCATTGATAAAGCGGTTGCCCTGATCGAAGAAGCCAGCAGCAATGGTGCTGAA121GTTATCGCGTTCCCGGAGACTTGGCTGCCGGGCTACCCTTGGTACGCATGGCTGGACGCG181CCTGCCCTGTGGCTGGCTAAATTCGGCCAGCGTTATTATGATAACTCTCTGGAGTACGGC241ACGCCGCAGGCTGAACGCCTGGCAAAAGCAGCAAAGGATAACAACATTATGGTAGGTATG301GGTCTGTCTGAGCGCTCTGGTAGCTCCCTGTACATTGCGCAGTGGATCATTGGCAACGAC361GGTAAAACCATCGCGCAGCGTCGTAAGCTGAAGCCGACGCACGTGGAACGTACCATCTAC421GGTGAAGGCGATGGTTCTGACCTGTCCGTATGGGACACGAAACTGGGTCGTGTTGGCGGT481CTGTGTTGTTGGGAACATCTGCAGCCACTGTCCAAGTACGCGATGTATGCCCAAAACGAA541CAGGTGCACTTCGCGGCGTGGCCGTCCTTCAGCATTTATGAAGGTGGTGCTTACGCACTG601TCTGGCGAAGCAAACGTTGCAGCGTCCCGTGTATACGCTCTGGAGGGTTCCTGTTATGTC661CTGGCACCTACTGCCATTGTTAGCCAGGAGATGCAGGACG4AAATGTGCGAGACTGATCTG721CAGAAAGCTCTGCTGAAAACTGGTGGTGGCTATTCCCGTATTTTCGGTCCGGACGGCAAA利用軟件對(duì)該基因序列進(jìn)行分析，推知所述腈水解酶基因編碼SEQIDNO:2所示的氨基酸序列1MDHPKFKAAAIQAAPVFLNL21DATIDKAVALIEEASSNGAE41VIAFPETWLPGYPWYAWLDA61PALWLAKFGQRYYDNSLEYG81TPQAERLAKAAKDNNIMVGM101GLSERSGSSLYIAQWIIGND121GKTIAQRRKLKPTHVERTIY141GEGDGSDLSVWDTKLGRVGG161LCCWEHLQPLSKYAMYAQNE181QVHFAAWPSFSIYEGGAYAL201SGEANVAASRVYALEGSCYV221LAPTAIVSQEMQDEMCETDL241QKALLKTGGGYSRIFGPDGK261QLHESLPTDQEGI所述腈水解酶基因源自節(jié)桿菌(Arthrobacternitroguajacolicus)CCTCCNo:M208252。該節(jié)桿菌(Arthrobacternitroguajacolicus)(菌株編號(hào)ZJUTB06-99)保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國武漢武漢大學(xué)，430072，保藏編號(hào)CCTCCNo:M208252，保藏日期2008年12月21日，已在在先申請(qǐng)200910100875.8中提交了相關(guān)菌種保藏信息。本發(fā)明還涉及一種含有所述腈水解酶基因的重組載體，以及用所述重組載體轉(zhuǎn)化得到的重組基因工程菌。本申請(qǐng)發(fā)明人根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計(jì)胞內(nèi)表達(dá)引物3(cgcgaa^atggatcacccgaaattcaaagcagc)禾口弓I凈勿4(gttgtcgacttaaataccttcttggtcagtcggcag)、分泌表達(dá)弓I凈勿5(cgcgaattegatcacccgaaattcaaagcagc)禾口弓I物6(attgtcgacaataccttcttggtcagtcggcag)，以克隆載體pMD18-T-NIT為模板，獲得了用于胞內(nèi)表達(dá)和分泌表達(dá)的腈水解酶基因。本發(fā)明將腈水解酶基因同胞內(nèi)表達(dá)載體pTrc99a(PharmaciaBiotech,Inc.,Piscataway)或分泌表達(dá)載體pET20b(Initrogencompany)連接，構(gòu)建了含有腈水解酶基因的胞內(nèi)表達(dá)重組質(zhì)粒pTrc99a-NIT或分泌表達(dá)重組質(zhì)粒pET20b_NIT。將胞內(nèi)表達(dá)重組質(zhì)粒pTrc99a-NIT轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109菌株中，獲得含有胞內(nèi)表達(dá)重組質(zhì)粒pTrc99a-NIT的重組大腸桿菌JM109/pTrc99a-NIT，或?qū)⒎置诒磉_(dá)重組質(zhì)粒pET20b-NIT轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21菌株中，獲得含有分泌表達(dá)重組質(zhì)粒pET20b_NIT的重組大腸桿菌BL21/pET20b-NIT。以重組菌為酶源，進(jìn)行生物催化與轉(zhuǎn)化。本發(fā)明還涉及所述的腈水解酶基因在制備重組腈水解酶中的應(yīng)用。具體的，所述的應(yīng)用為構(gòu)建含有所述腈水解酶基因的重組載體，將所述重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)液分離得到含有重組腈水解酶的菌體細(xì)胞。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供了一種來源于節(jié)桿菌(Arthrobacternitroguajacolicus)CCTCCNo:M208252的腈水解酶基因核苷酸序列；該腈水解酶基因可與表達(dá)載體連接構(gòu)建得到含該基因的胞內(nèi)表達(dá)重組質(zhì)?；蚍置诒磉_(dá)重組質(zhì)粒，再分別對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株中，獲得重組大腸桿菌，該重組大腸桿菌含有重組腈水解酶，可以利用重組大腸桿菌為酶源進(jìn)行生物催化與轉(zhuǎn)化。重組腈水解酶作為轉(zhuǎn)化用酶，分別以外消旋扁桃腈、丙烯腈、亞氨基二乙腈或2，2-二甲基環(huán)丙烷甲腈等為底物，可以進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)制備相應(yīng)的R-扁桃酸、丙烯酸、亞氨基二乙酸或手性2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸等。(四)圖1為克隆載體pMD18-T-NIT物理圖譜；圖2為pTrc99a-NIT重組質(zhì)粒物理圖譜；圖3為pET20b-NIT重組質(zhì)粒物理圖譜；圖4為腈水解酶基因PCR擴(kuò)增argrose電泳圖；其中，14為利用引物1和引物2擴(kuò)增得到的腈水解酶基因片段；5為DL2000DNAMarker;圖5陽性重組質(zhì)粒pTrc99a-NIT的酶切結(jié)構(gòu)圖；其中，1為腈水解酶基因片段；2為pTrc99a-NIT/EcoRIandSail樣品；3為pTrc99a樣品；4為pTrc99a-NIT/EcoRI樣品；5為pTrc99a-NIT/Sa11樣品；6為入DNA/Hi慮IDNAMarker;圖6陽性重組質(zhì)粒pET20b-NIT的酶切結(jié)構(gòu)圖；其中，1為腈水解酶基因片段；2為pET20b-NIT/EcoRIandSail樣品；3為pET20b樣品；4為pET20b-NIT/EcoRI樣品；5為pET20b-NIT/Sa11樣品；6為ADNA/HindIIIDNAMarker。(五)具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例1:用核酸快速提取儀提取節(jié)桿菌(Arthrobacternitroguajacolicus)CCTCCNo:M208252菌體的總基因組DNA，以該基因組DNA為模板，在引物1(ATGGATCACCCGAAATTCAAAGC)、弓|物2(AATACCTTCTTGGTCAGTCGGC)的作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系各組分加入量(總體積50iiL):lOXPfuDNAPolymeraseBuffer5iiL，10mMdNTPmixture(dATP、dCTP、dGTP禾口dTTP各2.5mM)lyL，濃度為50iiM的克隆引物l、弓l物2各lyL，基因組DNAlyL，PfoDNAPolymerase1uL，無核酸水40uL。采用Biorad的PCR儀，PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性94°C5min，然后進(jìn)入溫度循環(huán)94。C30s，53°Clmin，72°C1.5min，共30個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸10min，終止溫度為8°C。6取5iiLPCR反應(yīng)液用0.9%瓊脂糖凝膠電泳檢測。切膠回收該片段并純化，利用TaqDNA聚合酶向片段5'端引入堿基A。在T4DNA連接酶作用下將該片段同T載體進(jìn)行連接，得到克隆重組質(zhì)粒pMDT-18-NIT見圖1。將該重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109中，利用籃白斑篩選系統(tǒng)進(jìn)行篩選，隨機(jī)挑取白色克隆測序，利用軟件分析測序結(jié)果，結(jié)果表明經(jīng)引物l和引物2擴(kuò)增到的核苷酸序列長度為819bp(其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示)，該序列編碼一個(gè)完整的開放閱讀框。實(shí)施例2:根據(jù)實(shí)施例1分析結(jié)果設(shè)計(jì)引物3(cgcgaMteatggatcacccgaaattcaaagcagc)、引物4(gttgiegaettaaataccttcttggtcagtcggcag)，并分別在弓I物3和引物4中引入了EcoRI和Sail限制性酶切位點(diǎn)。在引物3和引物4的引發(fā)下，利用高保真PyrobestDNA聚合酶(TaKaRa)進(jìn)行擴(kuò)增，獲得長為819bp的腈水解酶基因片段(其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示)，測序后利用EcoRI和Sail限制性內(nèi)切酶(TaKaRa)對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行處理，并利用T4DNA連接酶(TaKaRa)將該片段同用相同的限制性內(nèi)切酶處理的商業(yè)化載體pTrc99a(Invitrogen)進(jìn)行連接，構(gòu)建表達(dá)載體pTrc99a-NIT。將構(gòu)建的胞內(nèi)表達(dá)載體pTrc99a-NIT電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109(Invitrogen)中，涂平板37。C下培養(yǎng)過夜，隨機(jī)挑取克隆抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，鑒定結(jié)果見圖5。實(shí)施例3:根據(jù)實(shí)施例1分析結(jié)果設(shè)計(jì)引物5(cgcgaaSegatcacccgaaattcaaagcagc)、引物6(attgiegaeaataccttcttggtcagtcggcag)，并分別在引物5和引物6中引入了EcoRI和Sail限制性酶切位點(diǎn)。在引物5和引物6的引發(fā)下，利用高保真PyrobestDNA聚合酶(TaKaRa)進(jìn)行擴(kuò)增，獲得長為819bp的腈水解酶基因片段，測序后利用EcoRI和Sail限制性內(nèi)切酶(TaKaRa)對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行處理，并利用T4DNA連接酶(TaKaRa)將該片段同用相同的限制性內(nèi)切酶處理的商業(yè)化載體pET20b進(jìn)行連接，構(gòu)建分泌表達(dá)載體pET20b-NIT。將構(gòu)建的表達(dá)載體pET20b-NIT電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(Invitrogen)中，涂平板37"下培養(yǎng)過夜，隨機(jī)挑取克隆并抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，鑒定結(jié)果見圖6。實(shí)施例4:將實(shí)施例2、實(shí)施例3驗(yàn)證后的含有胞內(nèi)表達(dá)重組質(zhì)粒pTrc99a-NIT的重組大腸桿菌JM109/pTrc99a-NIT或含有分泌表達(dá)重組質(zhì)粒pET20b_NIT的重組大腸桿菌BL21/pET20b-NIT分別用含有50yg/ml氨芐青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)12h，再以1%接種量(v/v)接種到新鮮的含有50iig/ml氨芐青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至菌體濃度ODe。。約0.6左右，再向LB液體培養(yǎng)基加入終濃度為0.5mM的IPTG，誘導(dǎo)培養(yǎng)8h后，4°C、5000rpm離心10min，收集含有重組腈水解酶的菌體細(xì)胞。實(shí)施例5:以實(shí)施例4中獲得的含有胞內(nèi)表達(dá)重組質(zhì)粒pTrc99a-LAC的重組大腸桿菌JM109/pTrc99a-NIT或含有分泌表達(dá)重組質(zhì)粒pET20b_NIT的重組大腸桿菌BL21/pET20b-NIT濕菌體作為轉(zhuǎn)化用酶，以丙烯腈為底物，進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)制備丙烯酸。轉(zhuǎn)化體系組成及轉(zhuǎn)化操作如下在250mL三角瓶中加入5g濕菌體和底物濃度為2%(v/v)的50mL反應(yīng)液，3(TC搖床150r/min條件下反應(yīng)60min，離心去除菌體，上清液為含有丙烯酸的水溶液。采用外標(biāo)定量法來測定轉(zhuǎn)化液中丙烯腈、丙烯酸的含量。各成分的量用氣相色譜Agilent6890N測定，色譜柱類型FFAP毛細(xì)管柱；色譜條件柱溫15(TC，進(jìn)樣室溫度22(TC，F(xiàn)ID檢測器22(TC，N2流量為60mL/min;分流比為30:1。酶活單位(U)定義為在30°C、pH7.0條件下，在lmin內(nèi)催化丙烯腈生成1Pmol丙烯酸所需要的酶量定義為1U。根據(jù)體系中丙烯酸的生成量推知重組菌酶活。測定結(jié)果見表l和表2。表l:以重組大腸桿菌JM109/pTrc99a-NIT為酶源測定的腈水解酶酶活力測定結(jié)果菌株/質(zhì)粒酶活(U/g(wetcells))大腸桿菌JM1090大腸桿菌JM109/pTrc99a0大腸桿菌JM109/pTrc99a-NIT-l87大腸桿菌JM109/pTrc99a-NIT-292表2:以重組大腸桿菌BL21/pET20b-NIT為酶源測定的腈水解酶酶活力測定結(jié)果菌株/質(zhì)粒酶活(U/g(wetcells))大腸桿菌JM1090大腸桿菌JM109/pET20b0大腸桿菌BL21/pET20b-NIT-l185大腸桿菌BL21/pET20b-NIT-2174實(shí)施例6:以實(shí)施例4中獲得的含有胞內(nèi)表達(dá)重組質(zhì)粒pTrc99a-NIT的重組大腸桿菌JM109/pTrc99a-NIT或含有分泌表達(dá)重組質(zhì)粒pET20b_NIT的重組大腸桿菌BL21/pET20b-NIT濕菌體作為轉(zhuǎn)化用酶，以外消旋扁桃腈為底物，進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)制備R-扁桃酸。轉(zhuǎn)化體系組成及轉(zhuǎn)化操作如下在250mL三角瓶中加入5g濕菌體和底物濃度為lX(v/v)的50mL反應(yīng)液，3(TC搖床150r/min條件下反應(yīng)30min，離心去除菌體，清液為含有R-扁桃酸的水溶液。采用高效液相色譜法檢測扁桃酸和扁桃腈濃度，具體色譜條件為色譜柱為C18硅膠柱(250mmX4.60mm);流動(dòng)相組成為10mM磷酸二氫銨甲醇(v/v)=4:1。柱溫為室溫；檢測波長228nm;流動(dòng)相流速lml/min。酶活定義(U):87/12頁在3(TC，pH8.0的條件下，lmin生成lymol扁桃酸所需要的酶量定義為1U。根據(jù)體系中R-扁桃酸的生成量推知重組菌酶活。測定結(jié)果見表3和表4。表3:以重組大腸桿菌JM109/pTrc99a-NIT為酶源測定的腈水解酶酶活力測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表4:以重組大腸桿菌BL21/pET20b-NIT為酶源測定的腈水解酶酶活力測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)施例7:以實(shí)施例4中獲得的含有胞內(nèi)表達(dá)重組質(zhì)粒pTrc99a-NIT的重組大腸桿菌JM109/pTrc99a-NIT或含有分泌表達(dá)重組質(zhì)粒pET20b_NIT的重組大腸桿菌BL21/pET20b-NIT濕菌體作為轉(zhuǎn)化用酶，以亞氨基二乙腈為底物，進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)制備亞氨基二乙酸。轉(zhuǎn)化體系組成及轉(zhuǎn)化操作如下在100mL3X(w/w)的亞氨基二乙腈水溶液中加入5g濕菌體進(jìn)行水解反應(yīng)，控制溫度3(TC、攪拌轉(zhuǎn)速200r/min，氨水自動(dòng)流加調(diào)節(jié)pH7.0，水解12h后離心去除菌體，清液為含有亞氨基二乙酸的水溶液。采用液相測定亞氨基二乙酸含量取O.lmL水解液，力口lmL0.5M的NaHCO3溶液、0.4mL1%(w/w)的2，4-二硝基氟苯-乙腈溶液和lmL蒸餾水，在6(TC下避光反應(yīng)30min，衍生化完后，再加7.5mL0.2MpH7.0的磷酸緩沖液，然后進(jìn)行HPLC分析檢測，色譜柱為EliteC18色譜柱(250nmX4.6nm);流動(dòng)相為甲醇0.05M的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH4.5)(55:45，v/v);流速為1.0mL/min;檢測波長為365nm;柱溫為30°C。酶活單位(U)定義為在30°C、pH7.0條件下，在lmin內(nèi)催化亞氨基二乙腈生成lymol亞氨基二乙酸所需要的酶量定義為1U。根據(jù)體系中亞氨基二乙酸的生成量推知重組菌酶活。測定結(jié)果見表5和表6。表5:以重組大腸桿菌JM109/pTrc99a-NIT為酶源測定的腈水解酶酶活力測定結(jié)果菌抹/質(zhì)粒酶活(U/g(wetcells))大腸桿菌JM1090大腸桿菌JM109/pTrc99a0大腸桿菌JM109/pTrc99a-NIT-1117大腸桿菌JM109/pTrc99a-NIT-2_^表6:以重組大腸桿菌BL21/pET20b-NIT為酶源測定的腈水解酶酶活力測定結(jié)果菌株/質(zhì)粒酶活(U/g(wetcells))大腸桿菌BL210大腸桿菌BL21/pET20b0大腸桿菌BL21/pET20b-NIT-l226大腸桿菌BL21/pET20b-NIT-2247實(shí)施例8:以實(shí)施例4中獲得的含有胞內(nèi)表達(dá)重組質(zhì)粒pTrc99a-NIT的重組大腸桿菌JM109/pTrc99a-NIT或含有分泌表達(dá)重組質(zhì)粒pET20b_NIT的重組大腸桿菌BL21/pET20b-NIT濕菌體作為轉(zhuǎn)化用酶，以外消旋2，2-二甲基環(huán)丙烷甲腈為底物，進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)制備(R)-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸。轉(zhuǎn)化體系組成及轉(zhuǎn)化操作如下在500mL三角瓶中加入8g濕菌體和底物濃度為0.7%(v/v)的100mL反應(yīng)液，3(TC搖床150r/min條件下反應(yīng)70min，離心去除菌體。采用手性氣相色譜法測定2，2-二甲基環(huán)丙烷甲腈及2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸的濃度和光學(xué)純度。具體色譜條件為BGB-175手性氣相色譜柱；載氣為氦氣，流速lml/min;進(jìn)樣口、檢測器溫度均為220°C，柱溫130°C;分流比50:1。酶活定義(U):在3(TC，pH7.0的條件下，lmin生成1ymol2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸所需的酶量定義為1U。測定結(jié)果見表7和表8。表7:以重組大腸桿菌JM109/pTrc99a-NIT為酶源測定的腈水解酶酶活力測定結(jié)果10<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表8:以重組大腸桿菌BL21/pET20b-NIT為酶源測定的腈水解酶酶活力測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>結(jié)論由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，將本發(fā)明腈水解酶基因轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到重組大腸桿菌具有較強(qiáng)產(chǎn)腈水解酶能力，可直接以含酶的菌體細(xì)胞為酶源進(jìn)行生物催化或轉(zhuǎn)化反應(yīng)。重組腈水解酶作為轉(zhuǎn)化用酶，可以分別以外消旋扁桃腈、丙烯腈、亞氨基二乙腈或2，2-二甲基環(huán)丙烷甲腈等為底物，進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)制備相應(yīng)的R-扁桃酸、丙烯酸、亞氨基二乙酸或手性2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸等。SEQUENCELISTING<110>浙江工業(yè)大學(xué)<120>—種腈水解酶基因、載體、工程菌及其應(yīng)用<130><160>8<170>PatentInversion3.4<210>1<211>819<212>DNA<213>Arthrobactersp.<400>1atggatcacccgaaattcaaagcagctgctatccaggccgcaccggtcttcctgaacctgGOgacgcgaccattgataaagcggttgccctgatcgaagaagccagcagcaatggtgctgaa120gttatcgcgttcccggagacttggctgccgggctacccttggtacgcatggctggacgcg180cctgccctgtggctggctaaattcggccagcgttattatgataactctctggagtacggc240acgccgcaggctgaacgcctggcaaaagcagcaaaggataacaacattatggtaggtatg300ggtctgtctgagcgctctggtagctccctgtacattgcgcagtggatcattggcaacgac360ggtaaaaccatcgcgcagcgtcgtaagctgaagccgacgcacgtggaacgtaccatctac420ggtgaaggcgatggttctgacctgtccgtatgggacacgaaactgggtcgtgttggcggt■ctgtgttgttgggaacatctgcagccactgtccaagtacgcgatgtatgcccaaaacgaa540caggtgcacttcgcggcgtggccgtccttcagcatttatgaaggtggtgcttacgcactg600tctggcgaagcaaacgttgcagcgtcccgcgtatacgctctggagggttcctgttatgtc660ctggcacctactgccattgttagccaggagatgcaggacgaaatgtgcgagactgatctg720cagaaagctctgctgaaaactggtggtggctattcccgtattttcggtccggacggcaaa780cagctgcacgaatctctgccgactgaccaagaaggtatt819<210>2<211>273<212>PRT<213>Arthrobactersp.<400>2MetAspHisProLysPheLysAlaAlaAlalieGinAlaAlaProVal151015PheLeuAshLeuAspAlaThrlieAspLysAlaValAlaLeulieGlu202530GluAlaSerSerAsnGlyAlaGluVallieAlaPheProGluThrTrp354045LeuProGlyTyrProTrpTyrAlaTrpLeuAspAlaProAlaLeuTrp505560LeuAlaLysPheGlyGinArgTyrTyrAspAsnSerLeuGluTyrGly65707580ThrProGinAlaGluArgLeuAlaLysAlaAlaLysAspAsnAsnlie859095MetValGlyMetGlyLeuSerGluArgSerGlySerSerLeuTyrlie100105110AlaGinTrplielieGlyAsnAspGlyLysThrlieAlaGinArgArg115120125LysLeuLysProThrHisValGluArgThrlieTyrGlyGluGlyAsp130135140GlySerAspLeuSerValTrpAspThrLysLeuGlyArgValGlyGly145150155160LeuCysCysTrpGluHisLeuGinProLeuSerLysTyrAlaMetTyr165170175:0141]AlaGinAsnGluGinValHisPheAlaAlaTrpProSerPheSerlie:0142]180185190:0143]TyrGluGlyGlyAlaTyrAlaLeuSerGlyGluAlaAsnValAlaAla:0144]195200205:0145]SerArgValTyrAlaLeuGluGlySerCysTyrValLeuAlaProThr:0146]210215220:0147]AlalieValSerGinGluMetGinAspGluMetCysGluThrAspLeu:0148]225230235240:0149]GinLysAlaLeuLeuLysThrGlyGlyGlyTyrSerArgliePheGly:0150]245250255:0151]ProAspGlyLysGinLeuHisGluSerLeuProThrAspGinGluGly:0152]260265270:0153]lie:0154]<210>3:0155]<211>23:0156]<212>DNA:0157]<213>Unknown:0158]<220>:0159]<223>人工序列:0160]<400>3:0161]atggatcacccgaaattcMage23:0162]<210>4:0163]<211>22:0164]<212>DNA:0165]<213>Unknown:0166]<220>:0167]<223>人工序列<400>4aataccttcttggtcagtcggc22<210>5<211>35<212>DNA<213>Unknown<220><223>人工序列<400>5cgegaatteatggatcacccgaaattcaaagcagc35<210>6<211>36130180]<212>DNA0181]<213>Unknown0182]<220>0183]<223>人工序列0184]<400>60185]gttgtcgacttaaataccttcttggtcagtcggcag360186]<210>7:0187]<211>32:0188]<212>DNA:0189]<213>Unknown:0190]<220>:0191]<223>人工序列:0192]<400>7:0193]cgcga甜cgatracccgaa敏caaagragc32<210>8<211>33<212>DNA<213>Unknown<220><223>人工序列<400>8attgtcgacaataccttcttggtcagtcggcag331權(quán)利要求一種腈水解酶基因，具有SEQIDNO1所示的核苷酸序列。2.如權(quán)利要求1所述的腈水解酶基因，其特征在于所述腈水解酶基因編碼SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。3.如權(quán)利要求1所述的腈水解酶基因，其特征在于所述腈水解酶基因源自節(jié)桿菌(Arthrobacternitroguajacolicus)CCTCCNo:M208252。4.一種含有權(quán)利要求1所述腈水解酶基因的重組載體。5.—種用權(quán)利要求4所述重組載體轉(zhuǎn)化得到的重組基因工程菌。6.如權(quán)利要求1所述的腈水解酶基因在制備重組腈水解酶中的應(yīng)用。7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為構(gòu)建含有所述腈水解酶基因的重組載體，將所述重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)液分離得到含有重組腈水解酶的菌體細(xì)胞。8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述重組腈水解酶作為轉(zhuǎn)化用酶，分別以外消旋扁桃腈、丙烯腈、亞氨基二乙腈或2，2-二甲基環(huán)丙烷甲腈為底物，進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)制備相應(yīng)的R-扁桃酸、丙烯酸、亞氨基二乙酸或手性2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸。全文摘要本發(fā)明提供了及一種編碼腈水解酶的腈水解酶基因、含有該基因的重組載體、該重組載體轉(zhuǎn)化得到的重組基因工程菌，以及其在制備重組腈水解酶中的應(yīng)用。該腈水解酶基因可與表達(dá)載體連接構(gòu)建得到含該基因的胞內(nèi)表達(dá)重組質(zhì)粒或分泌表達(dá)重組質(zhì)粒，再分別對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株中，獲得重組大腸桿菌，該重組大腸桿菌含有重組腈水解酶，可以重組大腸桿菌為酶源進(jìn)行生物催化與轉(zhuǎn)化。重組腈水解酶重組腈水解酶作為轉(zhuǎn)化用酶，分別以外消旋扁桃腈、丙烯腈、亞氨基二乙腈或2，2-二甲基環(huán)丙烷甲腈等為底物，進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)制備相應(yīng)的R-扁桃酸、丙烯酸、亞氨基二乙酸或手性2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸等。文檔編號(hào)C12N1/21GK101691574SQ20091015243公開日2010年4月7日申請(qǐng)日期2009年9月8日優(yōu)先權(quán)日2009年9月8日發(fā)明者柳志強(qiáng),沈寅初,薛亞平,鄭仁朝,鄭裕國申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)