專利名稱：：一種多烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物及其制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種多烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物及其制備與應(yīng)用。(二)
背景技術(shù)：
：臨床上病原微生物日益嚴(yán)重的耐藥性問(wèn)題以及艾滋病、SARS、禽流感等新型疾病的相繼出現(xiàn)，使研究開(kāi)發(fā)應(yīng)對(duì)新藥顯得更加迫切與重要。自從Fleming發(fā)現(xiàn)青霉素以來(lái)，微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物逐漸被公認(rèn)為具有新穎化學(xué)骨架治療藥物的經(jīng)典來(lái)源。上世紀(jì)4060年代多種重要抗生素相繼從放線菌尤其是鏈霉菌中的發(fā)現(xiàn)，使而后的幾十年，放線菌成為篩選新抗生素特別關(guān)注的微生物類群。目前大部分上市抗生素是由放線菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物及其衍生物。隨著大規(guī)模菌株篩選的進(jìn)行，大量常見(jiàn)放線菌被重復(fù)分離，使新抗生素篩得幾率逐漸降低。而未被人們充分認(rèn)識(shí)的微生物可能是新的天然活行物質(zhì)的重要來(lái)源，故微生物新類群的代謝產(chǎn)物研究日趨受到重視。類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)是Ash于1993年根據(jù)16SrRNA基因序列比對(duì)結(jié)果，將其從芽孢桿菌屬中分離出來(lái)而創(chuàng)建的。研究發(fā)現(xiàn)，類芽孢桿菌能產(chǎn)生豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物，僅2002年被美國(guó)環(huán)保署(EPA)列為商業(yè)應(yīng)用微生物的多粘類芽孢桿菌(P.polymyxa)，就能產(chǎn)生包括多粘菌素(Polymyxin)、喬利肽菌素(Jolip印tin)、谷纈菌素(Gatavalin)、FusaricidinsA-D、Saltavidin以及LI-F抗生素(含12種不同組分)等在內(nèi)的幾十種次級(jí)代謝產(chǎn)物。其中多粘菌素B和E作為抗細(xì)菌感染藥物已用于臨床治療。Lorentz在研究從環(huán)境中分離的類芽孢桿菌對(duì)細(xì)菌、絲狀真菌及酵母的拮抗性時(shí)，發(fā)現(xiàn)有近50%的類芽孢桿菌菌株具有廣譜的抗細(xì)菌及病原真菌的能力。然而，到目前為止除了多粘類芽孢桿菌外，其它類芽孢桿菌所產(chǎn)生的、結(jié)構(gòu)解析清楚的新化合物卻鮮見(jiàn)報(bào)道，故類芽孢桿菌特別是其中的新種資源可能是新次級(jí)代謝產(chǎn)物的一個(gè)重要源泉。類芽孢桿菌屬細(xì)胞呈桿狀，在膨大胞囊內(nèi)有橢圓形芽孢，革蘭氏染色陽(yáng)性、陰性或可變。在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上無(wú)可溶性色素。兼性厭氧或嚴(yán)格好氧。除了幼蟲(chóng)類芽孢桿菌的兩個(gè)亞種，幾乎所有種的接觸酶為陽(yáng)性，氧化酶反應(yīng)可變。V-P反應(yīng)(乙酰甲基甲醇產(chǎn)生)可變，V-P液的pH46。不產(chǎn)硫化氫，有的種產(chǎn)生吲卩朵，硝酸鹽還原反應(yīng)、酪朊、淀粉和脲素的水解、酪氨酸分解均可變。能夠利用多種糖類物質(zhì)產(chǎn)酸。PH5.6和5(TC的生長(zhǎng)可變。最適生長(zhǎng)pH為7.0。除馬闊里類芽孢桿菌(P.macquariensis)的最適生長(zhǎng)溫度20-23。C外，余最適生長(zhǎng)溫度2830°C，10%NaCl可抑制生長(zhǎng)，有的種在含0.001%溶菌酶中不能生長(zhǎng)。類芽孢桿菌屬主要的細(xì)胞脂肪酸為anteiso-C15:0，主要的甲基萘醌為MK_7，DNA(G+C)mol%為4554mol%;其另一顯著特點(diǎn)是所有菌株的16SrDNA序列中均含有兩段特定的序列，這為我們?cè)O(shè)計(jì)針對(duì)類芽孢桿菌的特異性引物奠定了分子基礎(chǔ)。類芽孢桿菌廣泛地分布于各種生境中，經(jīng)過(guò)近十幾年的研究，類芽孢桿菌屬的菌種數(shù)已經(jīng)由最初的11個(gè)種發(fā)展到現(xiàn)在的100多種。許多重要的微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物都是通過(guò)非核糖體肽合成酶(nonribosomalp印tidesynthetase,NRPSs)以及聚酮合酶(polyketidesynthetase，PKSs)兩種催化途徑合成的。NRPSs最小的中心模塊由負(fù)責(zé)選擇和活化氨基酸單體的腺苷?；?adenylation，A)結(jié)構(gòu)域、負(fù)責(zé)催化肽鍵形成的縮合(condensaion，C)結(jié)構(gòu)域、以及負(fù)責(zé)將單體或正在合成的鏈轉(zhuǎn)移到不同催化位點(diǎn)的含4-磷酸泛酰巰基乙胺的硫醇(thiolation，T)或肽酰載體蛋白(p印tidylcarrierprotein,PCP)結(jié)構(gòu)域組成；類似的，PKS模塊核心結(jié)構(gòu)域由負(fù)責(zé)延伸單元選擇的?；D(zhuǎn)移(acyltransferase，AT)結(jié)構(gòu)域、帶負(fù)責(zé)延伸單元裝載的4_磷酸泛酰巰基乙胺擺動(dòng)臂的酰基轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(acylcarrierprotein,ACP)結(jié)構(gòu)域、以及負(fù)責(zé)脫羧縮合的酮酰合成酶(ketoacylsynthase,KS)結(jié)構(gòu)域組成。在生物合成過(guò)程中，正在合成的鏈?zhǔn)冀K共價(jià)結(jié)合在酶上，直到整條鏈合成完畢才由硫酯酶(thioesterase，TE)結(jié)構(gòu)域催化產(chǎn)物從酶上釋放出來(lái)。在微生物基因組中存在編碼這些酶的基因，是微生物能產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物的內(nèi)源性標(biāo)志。對(duì)新分離微生物進(jìn)行NRPSs/PKSs基因簇序列片段的擴(kuò)增、測(cè)序和比對(duì)分析，從中挑出含有新的NRPSs/PKSs基因、具有產(chǎn)新抗生素潛能的菌株進(jìn)行進(jìn)一步研究，據(jù)此可提高發(fā)現(xiàn)新的具活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的幾率。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種具有藥用價(jià)值的新化合物及其制備方法和應(yīng)用，以及能產(chǎn)生該化合物的新菌株。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是本發(fā)明人根據(jù)類芽孢桿菌基因組核苷酸序列的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，設(shè)計(jì)出針對(duì)類芽孢桿菌的特異性引物，利用該引物從分離菌株中快速遴選出目標(biāo)類芽孢桿菌；后利用16SrDNA的菌種鑒別功能結(jié)合微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇序列片段的分析，快速篩選出一種具有產(chǎn)活性物質(zhì)的新菌種。在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中對(duì)該菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，離心收集菌體。用甲醇抽提菌體，濃縮，離心取沉淀；用甲醇溶解沉淀，進(jìn)行SPE柱層析，收集活性部分濃縮、過(guò)濾后進(jìn)行高效液相色譜層析；收集活性部分，濃縮去除有機(jī)溶劑，凍干，即可得到高純度活性化合物。本發(fā)明所提供的一種多烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物，結(jié)構(gòu)如式(I)所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>該化合物相關(guān)參數(shù)如下外觀淺黃色無(wú)定形粉末；比旋光度13.5185(5.17mg/ml，甲醇溶液);分子量542;分子式C33H5。06;UV最大吸收波長(zhǎng)277nm(甲醇溶液，見(jiàn)圖4);IR圖譜見(jiàn)圖5;MS圖譜見(jiàn)圖6;NMR圖譜,H-NMR見(jiàn)圖7_1，13C-NMR見(jiàn)圖7-2;根據(jù)上述特性，可斷定該化合物為一種新的多烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物，將它命名為多粘大環(huán)內(nèi)酯素。這也是國(guó)內(nèi)外首次從類芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)的大環(huán)內(nèi)酯類活性物質(zhì)。本發(fā)明還涉及一株能產(chǎn)生所述化合物的菌株——類芽孢桿菌(Paenibacillus)F6-B70，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，430072，保藏日期2009年7月14日，保藏編號(hào)CCTCCNo:M209149。該菌株篩選具體方法如下從多地多生境采集圖樣92份，采用平板稀釋法分離其中的微生物。所用的培養(yǎng)基包括營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、察氏瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖_酵母膏培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基和高氏一號(hào)培養(yǎng)基。將分離到的菌株接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，3(TC振蕩培養(yǎng)13天，用10，OOOXg的轉(zhuǎn)速離心，取上清；以MRSAATCC43300、大腸桿菌ATCC35218以及白色念珠菌ATCC10231為供試菌，采用紙片法檢測(cè)上清液的抗菌活性。選出對(duì)上述供試菌有活性的分離菌株，分析其16SrDNA及NRPSs/PKSs基因簇，最后選出含有新的NRPSs/PKSs基因簇同時(shí)16SrDNA基因與已知菌株同源性低于98X的菌株進(jìn)行進(jìn)一步研究。根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到能產(chǎn)生多粘大環(huán)內(nèi)酯的菌株F6-B70，進(jìn)一步鑒定實(shí)驗(yàn)表明該菌株屬于類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)，但和該屬中的其它菌種存在明顯差異，因此菌株F6-B70是類芽孢桿菌屬中的一新菌種，該菌株現(xiàn)已保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物菌種保藏管理中心，保存號(hào)為CCTCCNo:M209149。本發(fā)明提供的新菌株CCTCCNo:M209149，具有以下微生物特性本發(fā)明提供的菌株屬于革蘭氏陰性菌，好氧，桿狀，長(zhǎng)2.44.4i！m，寬0.51.1Pm，具有周生鞭毛，能產(chǎn)端生芽胞(圖1)。本發(fā)明提供的菌株在TSA平板上培養(yǎng)24h后菌落呈圓形，邊緣整齊，表面濕潤(rùn)，光滑，不透明，淡黃色，生長(zhǎng)67天后表面突起形成褶皺(圖2)。其中所述的TSA培養(yǎng)基為胰酪胨15g，大豆胨5g，氯化鈉5g，瓊脂13g，蒸餾水1000mL，pH7.17.5。本發(fā)明提供的菌株能夠在204(TC之間生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為3(TC;該菌株在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，當(dāng)PH為8時(shí)生長(zhǎng)旺盛；pH為7和9時(shí)有微弱生長(zhǎng)；而當(dāng)pH小于7或大于9時(shí)，培養(yǎng)10天之后仍沒(méi)有觀察到生長(zhǎng)現(xiàn)象；該菌株在1%NaCl培養(yǎng)基中培養(yǎng)第4天開(kāi)始出現(xiàn)渾濁，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，渾濁度增加。2%NaCl培養(yǎng)基中培養(yǎng)第5天開(kāi)始出現(xiàn)渾濁，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，渾濁度增加。而3%，4%，5%NaCl培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天仍不見(jiàn)明顯生長(zhǎng)。本發(fā)明提供的新菌株具有氧化酶、接觸酶活性，且硝酸還原反應(yīng)為陽(yáng)性。能水解干酪素、明膠。不產(chǎn)生吲哚或H2S，不能利用檸檬酸鹽。能夠利用D-核糖、N-乙酰-葡萄糖胺、七葉苷、0-麥芽糖J-蜜二糖J-蔗糖、淀粉、木糖醇、0-土倫糖產(chǎn)酸。表1是該菌株與相近菌種之間一些生理生化特性的比較，這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明本發(fā)明提供的菌株和已知菌種有較大差別。表1:菌株F6-B70的基本生理生化特征以及與相近模式菌株的特征比較<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>菌株1:F6_B70;2:Paenibacillus.ehimensis;3:Paenibacillus.elgii;4:Paenibacillus.koreensis;5:Paenibaci1lus.soli;6:Paenibaci1lus.n即hth3lenovo:ransND:未測(cè)試。本發(fā)明提供的菌株具有SEQIDN0:4所示的16SrRNA基因片段，該片段全長(zhǎng)1544個(gè)bp，將該序列與GenBank中的已知序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該菌株的16SrRNA基因與類芽孢桿菌屬中的Paenibacillusehimensis同源性最高(97.1%)。選擇與F6-B70菌株的16SrDNA基因序列相似性最相近株菌，用MEGA4軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(進(jìn)化距離法，循環(huán)1000次)(圖3)。從圖3中可以看到菌株F6-B70單獨(dú)形成一簇，和其它相近菌株處于不同分支。綜上所述，可以斷定菌株F6-B70是類芽孢桿菌屬中的一個(gè)新種。此外，本發(fā)明提供的菌株還具有多個(gè)新的次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇，其部分核苷酸序列如SEQIDNO:513所示。將這些序列和GenBank中已知序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)最高同源性均低于80%，表明該菌株具有產(chǎn)多個(gè)新的次級(jí)代謝產(chǎn)物潛力。表2為菌株F6-B70所具有的部分基因簇序列片段和已知化合物基因簇序列的比較結(jié)果。表2凍株F6-B70所具有的部分基因簇序列片段和已知化合物基因簇序列的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*NRPSandPKSI分別指來(lái)源于NRPSs和PKSs基因簇的PCR擴(kuò)增片段。§屬名縮寫(xiě)分別為B.，Bacillus,P.，Paenibacillus，M，Myxococcus。表2表明本發(fā)明提供的菌株除了能產(chǎn)生多粘大環(huán)內(nèi)酯外，還能產(chǎn)生其它新的活性物質(zhì)，包括肽類化合物。根據(jù)SEQIDNO:513所示的次級(jí)代謝產(chǎn)物基因片段，利用分子生物學(xué)、基因工程、遺傳學(xué)操作手段可以對(duì)已知次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行改造，甚至可以完全生產(chǎn)出全新的微生物活性代謝產(chǎn)物。本發(fā)明還涉及一種制備所述多烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物的方法，所述方法包括將類芽孢桿菌F6-B70接種至適用于類芽孢桿菌的液體培養(yǎng)基中，204(TC發(fā)酵培養(yǎng)1848h，發(fā)酵液經(jīng)分離純化得到所述多烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物。所述培養(yǎng)基可以是本領(lǐng)域常規(guī)或已知培養(yǎng)基。也可以向培養(yǎng)基中添加有機(jī)和無(wú)機(jī)物以促進(jìn)本發(fā)明提供的菌株生長(zhǎng)和提高本發(fā)明式(I)新化合物的產(chǎn)率。為了獲得式(I)新化合物的純品，可以使用本領(lǐng)域常規(guī)或已知的用于微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物分離純化的任何方法，包括，用有機(jī)溶劑萃取/抽提，各種色譜層析，結(jié)晶，沉淀等方法。優(yōu)選的，所述分離純化方法如下發(fā)酵液離心，收集菌體，用甲醇抽提菌體，濃縮，得到的濃縮液離心，取沉淀用甲醇溶解，進(jìn)行柱層析分離，收集活性部分，濃縮去除有機(jī)溶劑，凍干，得所述多烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物。所述適用于類芽孢桿菌的液體培養(yǎng)基終濃度組成如下蛋白胨515g/L，牛肉膏18g/L，氯化鈉210g/L，溶劑為水，pH7.4。本發(fā)明還涉及所述的多烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物在制備抑制葡萄球菌的抗菌制劑中的應(yīng)用。具體的，所述多烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物用于制備抑制金黃葡萄球菌或表皮葡萄球菌的抗菌制劑。式(I)新化合物(多粘大環(huán)內(nèi)酯素)對(duì)多種耐藥葡萄球菌，包括從臨床上分離得到的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的生長(zhǎng)具有強(qiáng)烈抑制作用，但對(duì)糞腸球菌、枯草芽孢桿菌等其它革蘭氏陽(yáng)性菌以及革蘭氏陰性菌和真菌均無(wú)抗性。本發(fā)明提供的多粘大環(huán)內(nèi)酯素抗菌圖譜具體見(jiàn)表3。由表3可知盡管化合物1的抗菌譜很窄，但是其抑制葡萄球菌的作用卻很強(qiáng)(10ug多粘大環(huán)內(nèi)酯素的抑菌作用優(yōu)于30ug萬(wàn)古霉素的抑菌作用)、且對(duì)耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌以及耐氨芐西林的表皮葡萄球菌均有效。表3:多粘大環(huán)內(nèi)酯素及臨床常用抗生素體外抗菌活性<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>a10iig/ml，b30iig/ml，ND:未測(cè)試本發(fā)明還涉及所述的多烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。具體的，所述所述多烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物用于制備治療肺癌、或肝癌、或白血病的抗腫瘤藥物。本發(fā)明提供的多粘大環(huán)內(nèi)酯素對(duì)人肺癌細(xì)胞A-549、人肝癌細(xì)胞BEL-7402及鼠淋巴細(xì)胞白血病P388也有一定的生長(zhǎng)抑制作用，其MICg。約為10—4mol/L。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供了一種具有藥用價(jià)值的新化合物(I)及其制備方法和應(yīng)用，以及能產(chǎn)生該化合物的新菌株，該化合物為一種多烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物，對(duì)耐藥葡萄球菌具有顯著的抑制作用，同時(shí)具有一定的抗腫瘤活性，為新藥篩選提供了基礎(chǔ)。(四)圖1為類芽孢桿菌F6-B70菌株透射電子顯微鏡圖片；圖2為類芽孢桿菌F6-B70菌株在30°C、TSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)1天(A)和7天(B)形成的菌落特征；圖3為以類芽孢桿菌F6-B70及相近菌株16SrDNA為基礎(chǔ)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；圖4為本發(fā)明制備的式(I)化合物在甲醇溶液中的UV圖譜；圖5為本發(fā)明制備的式(I)化合物的IR圖譜；圖6為本發(fā)明制備的式(I)化合物的ESI-MS圖譜；圖7為本發(fā)明制備的式(I)化合物的NMR圖譜，A為^-NMR圖譜，B為13C_NMR圖譜。(五)具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例1:類芽孢桿菌F6-B70的分離1、采集海拔4001500米的土壤樣品，采用稀釋涂布法分離菌株，具體步驟為稱取5g土樣加到裝有45ml無(wú)菌水的250ml三角瓶中，充分混勻。用吸管取lml加到裝有9ml無(wú)菌水的試管中，混勻，記為10—1;取10—1溶液lml加到裝有9ml無(wú)菌水的試管中，混勻，記為10—2;依次反復(fù)稀釋直至10—8。每個(gè)稀釋梯度取0.lml均勻涂到營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上。2、將平板置于3(TC培養(yǎng)3天；3、挑取單菌落，于相同培養(yǎng)基稀釋涂平板3(TC培養(yǎng)，重復(fù)三次分離純化后，鏡檢，確定為純種后，挑取純種菌苔入15%甘油于-S(TC保存。所述的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基按如下組成配制蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，瓊脂17g，蒸餾水1000mL，pH7.2。實(shí)施例2:類芽孢桿菌F6-B70基因組的提取參照《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》，具體如下將實(shí)施例1獲得的類芽孢桿菌F6-B70細(xì)菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，取1.5ml離心2min。沉淀加入567ul的TE緩沖液、30ul腦SDS禾口3ul20mg/ml的蛋白酶K，混勻，37。C溫育lh。加入100ul5mol/LNaCl，80ulCTAB/NaCl溶液(10%CTAB，O.7MNaCL;配制方法4.lgNaCL溶于80ml水中，緩慢加入10gCTAB，加熱溶解)，混勻，于65t:溫育lh。加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25:24:1，v/v/v)，混勻，離心5min，上清轉(zhuǎn)移到一只新管中，重復(fù)此步驟一次。加入0.6體積異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來(lái)，用封口的巴斯德管將沉淀轉(zhuǎn)移至lml的70%乙醇中洗滌。離心5min，棄上清，干燥，重溶于100ulTE緩沖液。實(shí)施例3:類芽孢桿菌F6-B70菌株16SrDNA的PCR擴(kuò)增及測(cè)序16SrDNA片段PCR擴(kuò)增的引物采用E8F:5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3以及E1541R:5-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3，它們能夠擴(kuò)增長(zhǎng)約1500bp的片段；模板為按實(shí)施例2獲得的類芽孢桿菌F6-B70基因組。通過(guò)對(duì)PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，最后確定了擴(kuò)增16SrDNA的最優(yōu)PCR條件及程序PCR反應(yīng)體系20ii1，具體組成如下dNTP(10mM)2ii1E8F(20iiM)0.5ii1E1541R(20iiM)0.5ii1rT叫(takara)1.25U模板10ngddH2012ill10Xbuffer(TaKaRa-TaqPCR用)2ii1反應(yīng)程序?yàn)?5。C5min;95。Clmin，58°Clmin，72°C2min，循環(huán)30次；72。C12min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物先用電泳純，然后產(chǎn)物連到T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，挑取陽(yáng)性克隆，將菌液送到上海英駿公司進(jìn)行測(cè)序。本實(shí)驗(yàn)中所用的載體為pMD19，購(gòu)自TAKARA公司。實(shí)施例4:類芽孢桿菌F6-B70中的I型PKS基因簇序列片段的克隆、測(cè)序PKSI基因的擴(kuò)增參照Izumikawa等人的方法進(jìn)行。引物為KSMA-F(5'-TSGCSATGGACCCSCAGCAG-3')和KSMB-R(5'-CCSGTSCCGTGSGCCTCSAC-3')，利用這對(duì)引物可擴(kuò)增約7Q0bp的PKSI基因片段(S=C或G)。模板為按實(shí)施例2獲得的類芽孢桿菌F6-B70基因組。PCR反應(yīng)體系為50ul，組成如下10Xbuffer(TaKaRa-TaqPCR用)5ii1dNTP(10mM)1ii1KSMA-F(20iiM)1.25ii1KSMB-R(20iiM)1.25ii1taq酶(TaKaRa)2.5u牛莫禾反10ngddH2038ii1反應(yīng)條件95。C預(yù)變性5min;95。C變性lmin，60。C退火lmin，7rC延伸2min，30個(gè)循環(huán)；最后7rC延伸5min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.8%的瓊脂糖凝膠電泳觀察。(用較高的瓊脂糖濃度來(lái)區(qū)分靠得很近的條帶)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物先用電泳純，然后產(chǎn)物連到T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，挑取陽(yáng)性克隆，將菌液送到上海英駿公司進(jìn)行測(cè)序。實(shí)施例5:類芽孢桿菌F6-B70中的NRPS基因簇序列片段的克隆、測(cè)序NRPS基因的擴(kuò)增參照Monika等人的方法進(jìn)行。引物為PSF(5'-GGWCDACHGGHMANCCHAARGG-3')禾PPSR(5'-GGCAKCCATYTYGCCARGTCNCCKGT-3')，利用該對(duì)引物可以擴(kuò)增約700bp的NRPS條帶(S二C或G，N二A或T或C或G)。模板為按實(shí)施例2獲得的類芽孢桿菌F6-B70基因組，PCR反應(yīng)體系50ul10Xbuffer(TaKaRa-TaqPCR用)5ii1dNTP(10mM)4ii1KSMA-F(20iiM)1.25ii1KSMB-R(20iiM)1.25ii1taq酶(TaKaRa)5U模板10ngddH2032.5ii1反應(yīng)條件95。C預(yù)變性5min;95。C變性lmin，54。C退火lmin，72。C延伸1.5min，30個(gè)循環(huán)；最后于72t:延伸12min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.8%的瓊脂糖凝膠電泳觀察。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物先用電泳純，然后產(chǎn)物連到T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，挑取陽(yáng)性克隆，將菌液送到上海英駿公司進(jìn)行測(cè)序。實(shí)施例6:類芽孢桿菌F6-B70的鑒定從實(shí)施例1中分離得到的類芽孢桿菌F6-B70具有如下特性(1)圖1為F6-B70在透射電鏡下拍攝的照片。該菌株為一桿狀細(xì)菌，具有周生鞭毛，革蘭氏染色為陰性。(2)F6-B70在TSA培養(yǎng)基平板上的菌落形態(tài)如圖2所示，24h后菌落呈圓形，邊緣整齊，表面濕潤(rùn)，光滑，不透明，淡黃色；生長(zhǎng)了6、7天后表面突起形成褶皺。(3)F6-B70的基本生理生化特征與相近模式菌株的特征比較見(jiàn)表1。從表中看出，F(xiàn)6-B70的基本理化性質(zhì)與類芽孢桿菌屬的四個(gè)最鄰近種存在較大差異，這表明該菌株是一個(gè)新的菌種。(4)F6-B70的16SrDNA序列見(jiàn)SEQIDNO:4，選擇與F6-B70菌株的16SrDNA基因序列相似性最相近株菌，用MEGA4軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)。從圖3中可以看到菌株F6-B70單獨(dú)形成一簇，和其它相近菌株處于不同分支上，因此，可以進(jìn)一步斷定菌株F6-B70是一個(gè)類芽孢桿菌屬中的一個(gè)新菌種。所述的TSA培養(yǎng)基按如下組成配制胰酪胨15g，大豆胨5g，氯化鈉5g，瓊脂13g，蒸餾水1000mL，pH7.17.5。實(shí)施例7:類芽孢桿菌F6-B70的罐上發(fā)酵將實(shí)施例1中分離得到的類芽孢桿菌F6-B70按下述條件發(fā)酵可產(chǎn)生式(I)新化合物多粘大環(huán)內(nèi)酯素。(1)將菌株F6-B70接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上活化，3(TC培養(yǎng)23天；(2)將斜面種子接入盛于250mL三角瓶的50mL種子培養(yǎng)基中，于30°C，200rpm振蕩培養(yǎng)24h，即為一級(jí)種子液；(3)將一級(jí)種子液接入三瓶盛于500mL三角瓶的200mL種子培養(yǎng)基中，于3(TC，200rpm振蕩培養(yǎng)24h，即為二級(jí)種子液；(4)總體積20L的攪拌式三聯(lián)體發(fā)酵罐內(nèi)，每個(gè)罐加入4L發(fā)酵培養(yǎng)基，添加0.1%消泡劑，115t:下高壓蒸汽滅菌60min，冷卻至30°C，將三瓶二級(jí)種子液分別接入三個(gè)含無(wú)菌發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐內(nèi)(接種量5%)，轉(zhuǎn)速300rpm，溶氧保持在30%以上，發(fā)酵24h，獲得發(fā)酵物。營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基按如下組成配制蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，瓊脂17g，蒸餾水1000mL，pH7.2。種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基均為營(yíng)養(yǎng)肉湯，按如下組成配制蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，蒸餾水1000mL，pH7.4。實(shí)施例8:式(I)新化合物的分離純化將實(shí)施例7中獲得的發(fā)酵物按下述步驟分離純化可獲得本發(fā)明提供的式(I)新化合物純品。(1)將4L發(fā)酵液移入800mL體積的離心瓶中，6000rpm離心15min，得菌體沉淀約210g(濕重)；(2)在菌體沉淀中加500mL甲醇，在磁力攪拌器上攪拌抽提約12h;6000rpm離心40min，上清移出-2(TC存放，沉淀再加250mL甲醇，在磁力攪拌器上攪拌抽提約6h;6000rpm離心40min，上清移出_201:存放，沉淀再加250mL甲醇，在磁力攪拌器上攪拌抽提約4h;6000rpm離心40min，上清移出-2(TC存放，沉淀?xiàng)壢ィ?3)所得上清集中于一瓶，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸餾濃縮，離心(7000rpm，40min)，得沉淀；(4)將沉淀用50ml甲醇溶解、離心(7000rpm，40min)，棄去不溶物，再將甲醇蒸干，記為粗品；(5)將粗品用適量甲醇/水(50:50，體積比)溶解，過(guò)SPE反相柱，收集80X甲醇洗脫液；將洗脫液濃縮；(6)將上述80%甲醇洗脫液濃縮、過(guò)濾處理后，用制備型HPLC進(jìn)行分離，收集活性部分，濃縮蒸干，得純品。最終從48L發(fā)酵菌體中得到136g純度達(dá)95%以上的式(I)化合物。實(shí)施例9:抑菌活性測(cè)定(1)制備含菌平板用無(wú)菌lmL移液管吸取O.10.2mL指示菌菌液，加入營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，用無(wú)菌刮刀涂布均勻；(2)制備待檢紙片用燒灼滅菌的鑷子捏取無(wú)菌濾紙片(事先用打孔器打成圓形，直徑6mm)于無(wú)菌空平皿中，將待測(cè)活樣品用移液槍吸取lOyL于紙片上，待干；(3)待紙片晾干后，用無(wú)菌鑷子將待檢紙片貼在相應(yīng)的含菌平板上，將平板在培養(yǎng)箱中于3(TC倒置培養(yǎng)；(4)24h后，觀察抑菌圈大小，并測(cè)量記錄抑菌圈直徑。所述指示菌包括金黃色葡萄球菌ATCC29213，金黃色葡萄球菌ATCC25923，MRSAATCC43300，MRSAB6172(臨床分離菌株)，表皮葡萄球菌CMCC26069，枯草芽孢桿菌CGMCC1.1470，大腸桿菌ATCC35218，變形桿菌CMCC49027，糞腸球菌ATCC29212，白色念珠菌ATCC10231。結(jié)果(表3)表明多粘大環(huán)內(nèi)酯素的抗菌譜較窄，僅能抑制革蘭氏陽(yáng)性菌中的葡萄球菌，但是，其抑制葡萄球菌的作用卻很強(qiáng)(10i！g多粘大環(huán)內(nèi)酯的抑菌作用優(yōu)于30i！g萬(wàn)古霉素的抑菌作用)、且對(duì)耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌以及耐氨芐西林的表皮葡萄球菌均有效。實(shí)施例10:體外抗腫瘤活性將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞(人肺癌細(xì)胞A-549、人肝癌細(xì)胞BEL-7402及鼠淋巴細(xì)胞白血病P388)，用0.25%胰酶消化后，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，吹打細(xì)胞使形成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，以1X105cell/ml重新接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100y1/孔。同時(shí)加入對(duì)倍連續(xù)稀釋的實(shí)施例8得到的式(I)新化合物多粘大環(huán)內(nèi)酯素。37t:培養(yǎng)72小時(shí)后，棄上清加入MTT，繼續(xù)孵化6小時(shí)，加入匿SO，振蕩10分鐘，用酶標(biāo)儀測(cè)570nm處的0D值。結(jié)果顯示多粘大環(huán)內(nèi)酯素對(duì)人肺癌細(xì)胞A-549、人肝癌細(xì)胞BEL-7402及鼠淋巴細(xì)胞白血病P388均具有一定的生長(zhǎng)抑制作用，其MIC9。約為10—4mol/L。SEQUENCELISTING〈110>浙江大學(xué)浙江海正藥業(yè)股份有限公司〈120〉一種多稀大環(huán)內(nèi)酯類化合物及其制備與應(yīng)用〈130〉〈160>13〈170>PatentInversion3.4〈210>1〈211>15〈212>DNA〈213>Unknown〈220〉〈223>人工序列〈400>10147]tgacggtacctg卿0148]〈210>20149]〈211>220150]〈212>DNA0151]〈213〉Unknown0152]〈220〉0153]〈223〉人工序列0154]〈400>20155]tcgatacccttggtgccgaagt0156]〈210>30157]〈211>200158]〈212>DNA0159]〈213〉Unknown0160]〈220〉0161]〈223〉人工序列0162]〈400>30163]￡l￡lgg￡lggtg￡ltccagccgca0164]〈210>40165]〈211>15540166]〈212>DNA0167]〈213>Paenibacillussp.0168]〈400>40169]agagtttgatcctggctcaggacg朋cgct0170]gggtttteccttcgggte朋gctegcggcg0171]tgteagactgggateacteccggaaacggt0172]tg郷卿tcgggcaacctg0173]ctegttggtggggteacggctcaccaaggc0174]cggccacactggg3Ctg卿cacggcccag0175]tccgcaatggacgcaagtctgacggagc朋0176]gteaagctctgttgccaggg朋g朋tgtcg0177]cctgag朋gaaagccccggcteactecgtg0178]gcgttgtccgg朋ttettgggcgteaagcg0179]aagcccggggctcaaccccggttcgcactg0180]朋gcgg朋ttccacgtgtegcggtg咖tg0181]aggcggctttctggcctgteactgacgctg0182]tegateccctggtegtccacgccgte朋cg0183]ccttggtgccg朋gte朋caC朋t朋gC3C0184]朋ctca朋gg朋ttg3Cggggacccgcaca0185]朋cgcg朋gaacctteccaggtcttgacat152220ggcggcgtgccteatecatgc朋gtcgagc60gacgggtgagteacacgteggcaacctgcc120agcteagaccggateagtggtcttctcgca180tggcttecagatgggcctgcggcgcatteg240gacgatgcgtagccgacctg卿gggtgElt300actcctecgggaggcagcagteggg朋tct360CgCCgCgtg3gtgEltg朋ggttttcggatc420cggagagteactgctctgcg朋tgacggte■ccagcagccgcggteatecgtegggggc朋540cgcgcaggcggccgttteagtctggtgttt600g腿ctgggcggCttgElgtgC3gg卿gg3660cgtegatetgtggaggaacaccagtggcga7203ggCgCg朋3gCgtgggg3gC3朋C3gg3t780atgagtgcteggtgtteggggtttcgatec840tccgcctggggagtecgctcgc朋gagtga■agcagtggagtetgtggtttaattcgaagc960cccgatg朋3gc3ctegagategtgcccct1020cttcggagcattgC3g3C3ggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtg卿tgttg1080ggtteagtcccgc朋cgagcgcaacccttgaacttagttgccagcatteagttgggcact1140ctaagttgactgccggtgac3朋ccggagg朋ggtggggatgacgtc朋3tcatcatgcc1200ccttetgacctgggctacac3cgtectecaatggccggtec朋cggg朋gca朋gtcgcg1260agatggagcc朋tcct朋g3aagccggtctcagttcggattgcaggctgcaactcgcctg1320catg朋gtcgg朋ttgctegtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatecgttcccggg1380tcttgtecacaccgcccgtc3C3ccacg3gagtttec朋cacccg朋gtcggtggggt朋1440ccttggtgcaaacttgtttgcaccgtggagccagccgccgaaggtggggtagatgattgg1500ggtgaagtcgt朋c朋ggtegccgtetcgg朋ggtgcggctggatcacctcctt1554〈210>5〈211>735〈212>DNA〈213>Paenibacillussp.〈400>5actectggcaagcccaagggggttetgatcg3gC3tC3Cggcgtgctteaccgactgcag60tggatgcagcagcgcteccaagtcggcgaacgcgatgtgatcctgcaaaagacgccgttt120acgttcgacgtgtccgtetgggagttgttcggctgggcaacggtgggtgccagtgtgtgc180ctgcttetccC3ggCgggg3g朋朋gcccggagcgcattctgg卿Cg3tagggcgttet240ggcgtcacccggacccatttcgtgcctecgatgctgcctgcgttcctggattetgccgag300cagcagccgg3gC3Cg3gCttgccgagc朋3C3gCg3gCCtggtgctggtatccgcgagc360gggg朋gCElttgccgcagcagcatgtgtctcgcttctecc3朋Cgtttgggcggcte朋c420gg3gcggggctggtgaacctgtecggaccg3Cgg朋gCg3cggtcgaggtgtcgtecttc■gattgcgagccggaccgggcgtetgcggcgattccgatcggcaagccggttcgcaateca540cggctgtetetcctg朋ggaElggCElCggElgcagttgcagccggtcggggtggC3ggCg3g600ctgtgcatcgccggggtgcaggtggC3卿ggttectteaaccgtccggaatteacagcg660gag朋gtttecggctgatccatttgtggcagggg3gCgg3tgteccggaccggcgacttg720gCg卿tggEltgcca735〈210>6〈211>681〈212>DNA〈213>Paenibacillussp.〈400>63Cg3CCgg3Cagccte朋ggcgtcatgctgg3gC3tC3Cggactgacg朋cctgaaagct60tectttgaccacgcgctgcgtctcggcgtegaggaccgcgtgctgctgttcgctegcctg120tcgtttgacgcggcctgctgggagatctttcagacgttgttctgcggtgcgaccttgtec180gtgccgacgaaggatecgattctgaactetcagttgtttga朋cgtetetggcgaagcac240ca朋ttecggttgcgaccctgccaccaacgtetgcggtgtatctggagccgg3gc3tetg300ccaagcctgcgcattctgttcacagcgggttccgcctcatcgccggaactggtgC卿3g360tgg朋gg3C3aggtggcgtettecaacgcgtecggtccgacgg朋朋ctcggtegcgacg420tcgagctggccggtctcggaagatccggaggcaggragcctgatttcaatcgggcggccg■atgccgaaccaccg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Cg3tgtggagc皿cg180ccgcctctgtgattccggcgcgcatctcgtatttcctegatcttcaaggcccggcggtcg240cggtcgacacggcttgttcgagttcgctcgtctccatccacttggcttgc咖gggttgc300ggtcgggggagacggacatggcgctggccggcggcgttttcatccagagcacgcctcgtt360tctecttgacggc卿gcgtgcgagcatgctctcggcgacggggcgctgtcacacgttcg4203tg3CC3ggCg皿cggattcgtgccgggag皿ggcgtgggggtcgtcgtcctcaaacgac■tg^agacgcgctcgccgactctetggcgtgattcg郷ctcagcgctca5403CC3gg3CggC3Cg3Cg皿Cgg皿tcaccgctcccagcgccaattcgcaagagcgtctgg600agcgcg皿gtctetgagacg3CCCgg3gC3gattcaactggtcgaggctc660acgg66權(quán)利要求一種多烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物，結(jié)構(gòu)如式(I)所示F2009101530606C00011.tif2.—株產(chǎn)權(quán)利要求1所述化合物的菌株——類芽孢桿菌(Paenibacillus)F6-B70，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，430072，保藏日期2009年07月14日，保藏編號(hào)CCTCCNo:M209149。3.—種制備如權(quán)利要求1所述多烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物的方法，所述方法包括將類芽孢桿菌F6-B70接種至適用于類芽孢桿菌的液體培養(yǎng)基中，204(TC發(fā)酵培養(yǎng)1848h，發(fā)酵液經(jīng)分離純化得到所述多烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物。4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述分離純化方法如下發(fā)酵液離心，收集菌體，用甲醇抽提菌體，濃縮，得到的濃縮液離心，取沉淀用甲醇溶解，進(jìn)行柱層析分離，收集活性部分，濃縮去除有機(jī)溶劑，凍干，得所述多烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物。5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述適用于類芽孢桿菌的液體培養(yǎng)基終濃度組成如下蛋白胨515g/L，牛肉膏18g/L，氯化鈉210g/L，溶劑為水，pH7.4。6.如權(quán)利要求1所述的多烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物在制備抑制葡萄球菌的抗菌制劑中的應(yīng)用。7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述多烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物用于制備抑制金黃葡萄球菌或表皮葡萄球菌的抗菌制劑。8.如權(quán)利要求1所述的多烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述所述多烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物用于制備治療肺癌、或肝癌、或白血病的抗腫瘤藥物。全文摘要本發(fā)明提供了具有藥用價(jià)值的新化合物及其制備方法，以及能產(chǎn)生該化合物的新菌株。式(I)化合物的篩選和制備方法簡(jiǎn)述如下采用特異性引物快速?gòu)耐寥罉悠分泻Y出類芽孢桿菌，利用16SrRNA基因初步鑒定分離菌株；選出潛在的新種資源進(jìn)行NRPSs/PKSs基因簇部分序列的擴(kuò)增、測(cè)序和比對(duì)，分析其代謝產(chǎn)物的多樣性；經(jīng)過(guò)大量篩選獲得含有新的NRPSs/PKSs基因簇、具有產(chǎn)新抗?jié)摿Φ木闒6-B70，然后采用發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，并從菌體細(xì)胞和發(fā)酵液中抽提活性物質(zhì)，利用多種提純技術(shù)進(jìn)行分離純化，即可得到本發(fā)明涉及的式(I)新化合物。該化合物為一種多烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物，對(duì)耐藥葡萄球菌具有顯著的抑制作用，同時(shí)具有一定的抗腫瘤活性。文檔編號(hào)A61K31/365GK101709058SQ200910153060公開(kāi)日2010年5月19日申請(qǐng)日期2009年9月30日優(yōu)先權(quán)日2009年9月30日發(fā)明者吳雪昌,周建英,方海環(huán),李歐,杜加秋,林建秋,白驊,錢(qián)朝東申請(qǐng)人:浙江大學(xué);浙江海正藥業(yè)股份有限公司