專利名稱：一種多層培養(yǎng)瓶培養(yǎng)原代細胞制備出血熱疫苗的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于原代細胞的培養(yǎng)和病毒繁殖，主要是一種多層培養(yǎng)瓶培養(yǎng)原代細胞制
備出血熱疫苗的方法。
背景技術：
細胞培養(yǎng)(Cell culture)是模擬機體內(nèi)生理條件，將細胞從機體中取出，在人工 條件下使其生存、生長、繁殖和傳代，進行細胞生命過程、細胞癌變、細胞工程等問題的研究 和生產(chǎn)疫苗。由人體或動物體內(nèi)直接取出組織或細胞進行培養(yǎng)叫原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)細胞 離體時間短，性狀與體內(nèi)相似。 一般說來，幼稚狀態(tài)的組織和細胞，如動物的胚胎、幼仔的 臟器等更容易進行原代培養(yǎng)。傳統(tǒng)疫苗制備大多采用細胞培養(yǎng)的方法。即采用不同容量的 玻璃轉瓶(單層或多層，大規(guī)模培養(yǎng)原代或傳代細胞，待細胞長滿瓶壁后接種病毒、培養(yǎng)、 收獲病毒培養(yǎng)液、純化后配制疫苗。轉瓶培養(yǎng)的缺點是細胞培養(yǎng)面積小、占用溫房空間大、 勞動強度高且易于污染。 多層培養(yǎng)瓶是近年來發(fā)展起來的一種新型細胞培養(yǎng)容器，它的優(yōu)點是培養(yǎng)表面經(jīng) 過特殊處理，非常適宜細胞生長，而且細胞培養(yǎng)面積大、占用空間小、不需要轉瓶機、采用管 道密閉操作、不易污染、單位培養(yǎng)面積所需細胞量少且病毒表達滴度高、收率比轉瓶高2-3 倍。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述技術的不足，而提供一種多層培養(yǎng)瓶培養(yǎng)原代細胞制 備出血熱疫苗的方法。 為解決上述技術問題，本發(fā)明是提出以下技術方案實現(xiàn)的這種多層培養(yǎng)瓶培養(yǎng) 原代細胞制備出血熱疫苗的方法，步驟如下 (1)、選用10-20日齡的清潔級沙鼠，用乙醚熏死，清洗并消毒鼠尸；無菌取腎，剪 碎，經(jīng)胰蛋白酶消化，用含3-5%的小牛血清MEM培養(yǎng)液分散細胞，制備細胞懸液，分裝多層 細胞培養(yǎng)瓶，每瓶8000ml，置37± rC培養(yǎng)2_3天后更換含1 %的小牛血清MEM培養(yǎng)液；
(2)、待4-5天細胞長滿致密單層后，按0. 2M0I接種病毒，每100cn^的細胞接種lml 滴度為6. 01gCCID50/ml的出血熱病毒工作種子；置34. 5士rC培養(yǎng)22-26小時，棄去瓶中 培養(yǎng)液，每瓶用PH7. 2的PBS洗去小牛血清，然后加入不含小牛血清的維持液繼續(xù)培養(yǎng)；
(3)、5-6天后，進行第一次病毒收獲，收獲前從培養(yǎng)瓶內(nèi)刮取少量細胞，用特異性 單克隆熒光抗體檢查細胞的病毒感染率及病毒型別，感染率應在95%以上；每次收獲后加 入新鮮維持液繼續(xù)培養(yǎng)，每個40層細胞工廠8000ml，每隔72±4小時收獲一次，收獲4-5 次； (4)、單次病毒收獲液以15000r/min連續(xù)流離心，流速為2500ml/min，收集上清， 上清液按l : 4000的比例加入P-丙內(nèi)酯置2-8t:3天滅活，滅活到期后，每個病毒滅活容 器立即取樣分別進行病毒滅活驗證試驗；待滅活驗證試驗合格后合并為單價病毒收獲液，經(jīng)100KD孔徑的濾膜超濾濃縮30倍后進行柱層析，用0. 02MpH7. 2的PBS洗，收集第一峰；
(5)、合并純化后的病毒液，經(jīng)0. 22um的膜除菌過濾，然后加入人血白蛋白作 為保護劑，半成品中人血白蛋白最終濃度為0. 3 % ，硫柳汞含量50ug/ml，病毒蛋白含量 31. 1-74. 22ug/ml，抗原含量稀釋至1 : 128，加入0. 5mg/ml的氫氧化鋁佐劑。
本發(fā)明的優(yōu)點在于解剖動物獲取原代細胞，將轉瓶所需細胞量的1/2或1/3細胞 接種于多層細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入適量培養(yǎng)液放入溫房培養(yǎng)，待長滿單層后接種病毒培養(yǎng)、收 獲病毒培養(yǎng)液、純化后配制疫苗。使用多層細胞瓶的優(yōu)點是接種原代細胞量少、培養(yǎng)出的 細胞量多、占用空間小、不需要轉瓶機、收率高。


圖1為本發(fā)明的沙鼠腎細胞在多層細胞瓶和轉瓶兩種不同容器中的生長趨勢示 意圖； 圖2為本發(fā)明的HFRS病毒在多層細胞瓶和轉瓶兩種不同容器中表達的抗原含量 示意圖。
具體實施例方式
下面結合附圖和實施例對發(fā)明作進一步說明 多層培養(yǎng)瓶培養(yǎng)原代細胞制備出血熱疫苗的方法如下 選用10-20日齡的清潔級沙鼠，用乙醚熏死，清洗并消毒鼠尸；無菌取腎，剪碎，經(jīng) 胰蛋白酶消化，用含3-5%的小牛血清MEM培養(yǎng)液分散細胞，制備細胞懸液，分裝多層細胞 培養(yǎng)瓶，每瓶8000ml，置37± 1°C培養(yǎng)2_3天后更換含1 %的小牛血清MEM培養(yǎng)液。
待4-5天細胞長滿致密單層后，按0. 2M0I接種病毒(每100cm2的細胞接種lml滴 度為6. 01gCCID50/ml的出血熱病毒工作種子)，置34. 5士rC培養(yǎng)22-26小時，棄去瓶中培 養(yǎng)液，每瓶用PH7. 2的PBS洗去小牛血清，然后加入不含小牛血清的維持液繼續(xù)培養(yǎng)。
5-6天后，進行第一次病毒收獲，收獲前從培養(yǎng)瓶內(nèi)刮取少量細胞，用特異性單克 隆熒光抗體檢查細胞的病毒感染率及病毒型別，感染率應在95%以上。每次收獲后加入新 鮮維持液繼續(xù)培養(yǎng)，每個40層細胞工廠8000ml，每隔72±4小時收獲一次，收獲4-5次。
單次病毒收獲液以15000r/min連續(xù)流離心，流速為2500ml/min，收集上清。上清 液按l : 4000的比例加入P-丙內(nèi)酯置2-8t: 3天滅活。滅活到期后，每個病毒滅活容器 立即取樣分別進行病毒滅活驗證試驗。待滅活驗證試驗合格后合并為單價病毒收獲液，經(jīng) 100KD孔徑的濾膜超濾濃縮30倍后進行柱層析，用0. 02MpH7. 2的PBS洗，收集第一峰。
合并純化后的病毒液，經(jīng)0.22um的膜除菌過濾，然后加入人血白蛋白作為保 護劑。半成品中人血白蛋白最終濃度為0.3X，硫柳汞含量50ug/ml，病毒蛋白含量 31. 1-74. 22ug/ml，抗原含量稀釋至1 : 128，加入0. 5mg/ml的氫氧化鋁佐劑。
經(jīng)多批試生產(chǎn)，用傳統(tǒng)方法進行檢驗，多層培養(yǎng)瓶生產(chǎn)的出血熱疫苗各項檢驗指 標都符合國家檢測標準，細胞在不同時間的生長密度和收獲液抗原含量比較見附錄圖A和 圖B。 此容器同樣適用于原代地鼠腎細胞生產(chǎn)乙型腦炎純化疫苗等用原代細胞制備的 各種疫苗。
以上對本發(fā)明的描述不具有限制性，如果本領域的普通技術人員受其啟示，在不 脫離本發(fā)明權利要求的保護的情況，作出本發(fā)明的其它結構變形和實施方式，均屬于本發(fā) 明的保護范圍。
權利要求
一種多層培養(yǎng)瓶培養(yǎng)原代細胞制備出血熱疫苗的方法，其特征在于步驟如下(1)、選用10-20日齡的清潔級沙鼠，用乙醚熏死，清洗并消毒鼠尸；無菌取腎，剪碎，經(jīng)胰蛋白酶消化，用含3-5％的小牛血清MEM培養(yǎng)液分散細胞，制備細胞懸液，分裝多層細胞培養(yǎng)瓶，每瓶8000ml，置37±1℃培養(yǎng)2-3天后更換含1％的小牛血清MEM培養(yǎng)液；(2)、待4-5天細胞長滿致密單層后，按0.2MOI接種病毒，每100cm2的細胞接種1ml滴度為6.0lgCCID50/ml的出血熱病毒工作種子；置34.5±1℃培養(yǎng)22-26小時，棄去瓶中培養(yǎng)液，每瓶用pH7.2的PBS洗去小牛血清，然后加入不含小牛血清的維持液繼續(xù)培養(yǎng)；(3)、5-6天后，進行第一次病毒收獲，收獲前從培養(yǎng)瓶內(nèi)刮取少量細胞，用特異性單克隆熒光抗體檢查細胞的病毒感染率及病毒型別，感染率應在95％以上；每次收獲后加入新鮮維持液繼續(xù)培養(yǎng)，每個40層細胞工廠8000ml，每隔72±4小時收獲一次，收獲4-5次；(4)、單次病毒收獲液以15000r/min連續(xù)流離心，流速為2500ml/min，收集上清，上清液按1∶4000的比例加入β-丙內(nèi)酯置2-8℃3天滅活，滅活到期后，每個病毒滅活容器立即取樣分別進行病毒滅活驗證試驗；待滅活驗證試驗合格后合并為單價病毒收獲液，經(jīng)100KD孔徑的濾膜超濾濃縮30倍后進行柱層析，用0.02MpH7.2的PBS洗，收集第一峰；(5)、合并純化后的病毒液，經(jīng)0.22um的膜除菌過濾，然后加入人血白蛋白作為保護劑，半成品中人血白蛋白最終濃度為0.3％，硫柳汞含量50ug/ml，病毒蛋白含量31.1-74.22ug/ml，抗原含量稀釋至1∶128，加入0.5mg/ml的氫氧化鋁佐劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種多層培養(yǎng)瓶培養(yǎng)原代細胞制備出血熱疫苗的方法，步驟如下解剖動物獲取原代細胞，將轉瓶所需細胞量的1/2或1/3細胞接種于多層細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入適量培養(yǎng)液放入溫房培養(yǎng)，待長滿單層后接種病毒培養(yǎng)、收獲病毒培養(yǎng)液、純化后配制疫苗。使用多層細胞瓶的優(yōu)點是接種原代細胞量少、培養(yǎng)出的細胞量多、占用空間小、不需要轉瓶機、收率高。
文檔編號A61K39/12GK101732709SQ20091015452
公開日2010年6月16日 申請日期2009年11月10日 優(yōu)先權日2009年11月10日
發(fā)明者姚偉, 蘇波, 鐘建琴 申請人:浙江天元生物藥業(yè)股份有限公司