專利名稱：抗cd20抗體片段與力達(dá)霉素的融合蛋白、制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤學(xué)和生物藥學(xué)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明提供了可以產(chǎn)生靶向腫瘤 殺傷作用的融合蛋白、其制備方法及其用途，進(jìn)而為腫瘤的靶向治療提供了優(yōu)良的候選藥 物。
背景技術(shù)：
非霍奇金淋巴瘤(NHL)是一種起源于淋巴組織的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率已 居惡性腫瘤第5位。常規(guī)的放療和化療雖然對(duì)NHL有效率較高，但選擇性差，在殺傷腫瘤細(xì) 胞的同時(shí)也可能損害體內(nèi)某些類型的正常細(xì)胞，常出現(xiàn)較明顯的毒副反應(yīng)，因此腫瘤靶向 治療已成為提高治療效果的一條重要途徑。在腫瘤靶向治療中，靶向治療的靶點(diǎn)選擇非常重要，已知大多數(shù)NHL起源于B淋巴 細(xì)胞，95%以上的B細(xì)胞NHL表達(dá)⑶20抗原，而⑶20又僅在前B淋巴細(xì)胞、未成熟B淋巴 細(xì)胞、成熟B淋巴細(xì)胞、激活B淋巴細(xì)胞中表達(dá)；在漿細(xì)胞、淋巴多能干細(xì)胞以及其它組織均 無(wú)表達(dá)，且⑶20抗原比較暴露，人體血清中也無(wú)游離的⑶20存在，因此⑶20可作為治療B 細(xì)胞淋巴瘤的有效靶點(diǎn)。在靶向治療中使用最多的是與腫瘤相關(guān)抗原相關(guān)的單克隆抗體。自從1997年美 國(guó)FDA批準(zhǔn)抗CD20人鼠嵌合抗體利妥昔抗體(Rituximab)上市，人們對(duì)抗體藥物產(chǎn)生了極 大的期望，另外，最近利用抗CD20抗體治療自身免疫性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性紅 斑狼瘡等成為新的研究熱點(diǎn)，這也提示抗CD20抗體的治療應(yīng)用范圍將進(jìn)一步得到擴(kuò)展。但 隨著使用單抗進(jìn)行治療的病例數(shù)的增加，藥物抗性的問(wèn)題也越來(lái)越明顯。隨之發(fā)展起來(lái)的 mI標(biāo)記的抗⑶20鼠源性抗體Bexxar和9°Y標(biāo)記的Zevalin抗體，作用機(jī)制與利妥昔抗體 不同，克服了藥物抗性，但免疫原性大，只能一次注射，且毒副反應(yīng)大，患者耐受性差。因此 研制以CD20為靶點(diǎn)的小型、高效的抗體靶向藥物成為當(dāng)務(wù)之急。發(fā)明簡(jiǎn)述針對(duì)這種現(xiàn)狀，申請(qǐng)人設(shè)想采用小型化抗CD20抗體片段(靶向載體)與強(qiáng)效抗腫 瘤藥物(彈頭)相結(jié)合的策略。在進(jìn)行小型化抗體片段選擇時(shí)，申請(qǐng)人選擇了抗CD20抗體Fab片段和抗CD20抗 體的scFv片段作為靶向載體。其中Fab片段是由重鏈可變區(qū)VH、恒定區(qū)中的CHl和輕鏈 可變區(qū)VL、恒定區(qū)CL組成，單鏈抗體(scFv)是由抗體分子中的重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變 區(qū)VL通過(guò)連接肽(通常為[GlySer4]3)連接而成，它們均具有分子量小、穿透力強(qiáng)、體內(nèi)半 衰期短以及易于基因改造和可通過(guò)細(xì)菌發(fā)酵大量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。而且由于Fab、scFv分子量 小，免疫原性小而不易產(chǎn)生HAMA反應(yīng)，且易穿透致密的腫瘤細(xì)胞間隙屏障，可進(jìn)入實(shí)體瘤 深部；同時(shí)它們均缺乏Fc片段，避免了 Fc介導(dǎo)的受體結(jié)合作用，使得其快速向靶部位集中； 此外還易于在體外進(jìn)行基因改造，通過(guò)基因重組技術(shù)，在編碼Fab、scFv基因后面連接上活 性蛋白基因，并在受體中表達(dá)，產(chǎn)生靶向融合蛋白。因此抗體Fab片段及scFv作為腫瘤靶向藥物的載體具有誘人的前景。在進(jìn)行“彈頭”選擇時(shí)，申請(qǐng)人選擇了高活性的“彈頭”藥物力達(dá)霉素(LDM)， 亦稱C-1027或C1027，是從中國(guó)湖北省潛江縣土壤中分離得到的一株由球孢鏈霉菌 (Streptomyces globisporus，菌種保藏編號(hào)CGMCC No. 0704)產(chǎn)生的烯二炔類抗生素，是 迄今報(bào)道過(guò)的對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷作用最強(qiáng)的大分子肽類抗腫瘤抗生素。LDM由兩部分分子組 成一為烯二炔結(jié)構(gòu)的發(fā)色團(tuán)(active enediyne, AE)，具有細(xì)胞毒作用，但不穩(wěn)定；另一為 110個(gè)氨基酸殘基組成的輔基蛋白(LDP)，對(duì)發(fā)色團(tuán)的穩(wěn)定起保護(hù)作用。發(fā)色團(tuán)和輔基蛋白 通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合，兩者結(jié)合具有特異性和牢固性，LDM的輔基蛋白和發(fā)色團(tuán)可以拆分和進(jìn) 行分子重建。LDM以其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)適合作為“彈頭”藥物。申請(qǐng)人:通過(guò)基因工程方法，從含有抗⑶20抗體的重組質(zhì)粒pCANTAB5E Fcd20Fab' 中擴(kuò)增得到CHl片段，從質(zhì)粒pET30Sngrldp (保藏號(hào)CGMCCNo. 2010)中擴(kuò)增得到LDP基因， 然后通過(guò)SOE-PCR得到Fab-LDP基因，然后將該片段重新組裝到切除了 CHl基因的質(zhì)粒 pCANTAB 5E Fcd20Fab，中，得到含有Anti_CD20 (Fab)-LDP的質(zhì)粒，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)到表達(dá)宿 主菌株中，通過(guò)改變培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)化培養(yǎng)條件，獲得了可溶性表達(dá)的 Fab-LDP融合蛋白，將該融合蛋白與AE分子重新組裝，得到強(qiáng)化融合蛋白Fab-LDM，在動(dòng)物 試驗(yàn)中，本發(fā)明的強(qiáng)化融合蛋白Fab-LDM保留了抗CD20抗體的靶向性和LDM的殺傷活性， 相較相同劑量的Fab、LDM，本發(fā)明的Fab-LDM表現(xiàn)出更高的腫瘤抑制效果。同時(shí)，申請(qǐng)人同樣以基因工程手段，從含有抗⑶20抗體的重組質(zhì)粒pCANTAB 5E Fcd20Fab'中擴(kuò)增得到VH、VL片段，通過(guò)SOE-PCR獲得scFv基因片段，將該基因與LDP基 因同時(shí)連接到質(zhì)粒PGEMT中，獲得pGEMT-scFv-LDP，然后從該質(zhì)粒中雙酶切獲得scFv-LDP 基因，然后將scFv-LDP連接到表達(dá)質(zhì)粒pCANTAB 5E中，得到融合了抗⑶20抗體的scFv 片段與LDP片段的質(zhì)粒，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)到表達(dá)宿主菌株中，通過(guò)改變誘導(dǎo)物濃度和培養(yǎng)時(shí) 間等優(yōu)化培養(yǎng)條件，獲得了主要以包涵體形式表達(dá)的scFv-LDP融合蛋白，經(jīng)過(guò)變性和復(fù)性 的融合蛋白與AE分子重新組裝，得到強(qiáng)化融合蛋白scFv-LDM，在動(dòng)物試驗(yàn)中，本發(fā)明的強(qiáng) 化融合蛋白scFv-LDM保留了抗CD20抗體的靶向性和LDM的殺傷活性，相較相同劑量的 scFv-LDP和LDM，本發(fā)明的scFv-LDM表現(xiàn)出顯著的腫瘤抑制效果。由此提供了新型的、由 抗CD20抗體片段和力達(dá)霉素融合而成的可用于腫瘤治療候選靶向腫瘤治療藥物。


圖Ia為重組表達(dá)質(zhì)粒pCANTAB 5E_Fab_LDP的限制性內(nèi)切酶分析結(jié)果，其中，1為 DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；2 為重組質(zhì)粒 pCANTAB 5E_Fab_LDP/apaI+sphI。圖Ib為重組表達(dá)質(zhì)粒pCANTAB 5E-scFv-LDP的限制性內(nèi)切酶分析結(jié)果，其中，1 為 DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL15000)；2 為重組質(zhì)粒 PCANTAB 5E-scFv_LDP ；3 為 pCANTAB 5E-scFv_LDP/MluI+XhoI ；4 為 pCANTAB 5E-scFv_LDP/MluI+EcoRI ；5 為 pCANTAB 5E-scFv_LDP/EcoR I+XhoI ；6 為 DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)。圖2a為融合蛋白Fab-LDP表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析結(jié)果，其中，
1為低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)；2為重組菌株pCANTAB 5E_Fab_LDP周質(zhì)腔蛋白非還原純化后；3為重組菌株pCANTAB 5E_Fab_LDP周質(zhì)腔蛋白非還原流出液；4為重組菌株pCANTAB 5E_Fab_LDP周質(zhì)腔蛋白非還原上樣前；5為重組菌株pCANTAB 5E_Fab_LDP周質(zhì)腔蛋白還原純化后；6為重組菌株pCANTAB 5E_Fab_LDP周質(zhì)腔蛋白還原流出液；7為重組菌株pCANTAB 5E_Fab_LDP周質(zhì)腔蛋白還原上樣前。圖2b為融合蛋白 Fab-LDP表達(dá)產(chǎn)物的Western印跡分析結(jié)果，其中，1為重組菌株pCANTAB 5E_Fab_LDP周質(zhì)腔蛋白非還原上樣前；2為L(zhǎng)DP陽(yáng)性對(duì)照；3為重組菌株pCANTAB 5E_Fab_LDP周質(zhì)腔蛋白非還原純化后；4為重組菌株pCANTAB 5E_Fab_LDP周質(zhì)腔蛋白非還原流出液。圖2c為融合蛋白 scFv-LDP在重組菌株中的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果，其中，1為低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)；2為重組菌株pCANTAB 5E表達(dá)的全菌蛋白；3為重組菌株pCANTAB 5E-scFv_LDP經(jīng)誘導(dǎo)后的全菌蛋白。圖2d為融合蛋白scFv-LDP表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE和Western印跡分析結(jié)果，其中，1為低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)2為重組菌株pCANTAB 5E_scFv-LDP經(jīng)誘導(dǎo)后的全菌蛋白3為重組菌株pCANTAB 5E-scFv-LDP經(jīng)誘導(dǎo)后的培養(yǎng)基上清組分4為重組菌株pCANTAB 5E-scFv-LDP經(jīng)誘導(dǎo)后的細(xì)胞周質(zhì)腔組分5為重組菌株pCANTAB 5E-scFv-LDP經(jīng)誘導(dǎo)后的可溶性細(xì)胞質(zhì)組分6為重組菌株pCANTAB 5E-scFv_LDP經(jīng)誘導(dǎo)后的不可溶包涵體組分圖2e為融合蛋白scFv-LDP經(jīng)金屬螯合層析純化的SDS-PAGE分析結(jié)果，其中，1為低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)；2為重組菌株pCANTAB 5E-scFv-LDP經(jīng)誘導(dǎo)后的全菌蛋白；3為不可溶包涵體的樣品預(yù)處理；4-7為不與親和層析柱結(jié)合的雜蛋白；8-10為經(jīng)洗脫緩沖液洗脫下來(lái)的融合蛋白scFv-LDP。圖3a為抗⑶20Fab和Fab-LDP與Raji細(xì)胞的結(jié)合活性的FACS分析結(jié)果，其中， ▼代表 Fab-LDP ； □代表抗 CD20Fab圖3b為融合蛋白scFv-LDP對(duì)Raji細(xì)胞的免疫反應(yīng)性分析結(jié)果。其中， 代表2X IO5個(gè)Raji細(xì)胞；■代表1 X IO5個(gè)Raji細(xì)胞；▲代表 0. 5X IO5 個(gè) Raji 細(xì)胞。圖3c為融合蛋白scFv-LDP對(duì)Daudi細(xì)胞的免疫反應(yīng)性分析結(jié)果。其中， 代表 2 X IO5個(gè)Daudi細(xì)胞；■代表IX IO5個(gè)Daudi細(xì)胞；▲代表 0. 5 X IO5 個(gè) Daudi 細(xì)胞。圖4a表示強(qiáng)化融合蛋白Fab-LDM與LDM對(duì)Raji細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，其中， 代表Fab-LDM ； □代表 LDM。
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圖4b表示強(qiáng)化融合蛋白Fab-LDM與LDM對(duì)Daudi細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，其中， 代表LDM ； □代表 Fab-LDM。圖4c表示強(qiáng)化融合蛋白Fab-LDM與LDM對(duì)K562細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，其中，▲代表LDM ； □代表 Fab-LDM。圖4d表示強(qiáng)化融合蛋白Fab-LDM與LDM對(duì)不同細(xì)胞的IC50的比較，其中，□代表LDM ；代表 Fab-LDM。圖4e表示強(qiáng)化融合蛋白scFv-LDM與LDM對(duì)Raji細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，其中，■代表LDM ； 代表 s cFv-LDM。圖4f表示強(qiáng)化融合蛋白scFv-LDM與LDM對(duì)Daudi細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，其中， 代表LDM ； 代表 scFv-LDM圖5a表示強(qiáng)化融合蛋白Fab-LDM對(duì)早期裸鼠移植性⑶20+B細(xì)胞淋巴瘤模型的治 療作用，其中， 代表 PBS; 代表抗 CD20Fab 4pmol/kg ；▲代表 Fab-LDM 2pmol/kg ； 代表 LDM 4pmol/kg ；▼代表 Fab-LDM 4pmol/kg ；〇代表 LDM 2pmol/kg。圖5b表示強(qiáng)化融合蛋白Fab-LDM對(duì)晚期裸鼠移植性⑶20+B細(xì)胞淋巴瘤模型的治 療作用。其中， 代表 PBS;〇代表抗 CD20Fab 4pmol/kg ； 代表 Fab-LDM 2pmol/kg ； 代表 LDM 4pmol/kg ；▲代表 Fab-LDM 4pmol/kg ；▼代表 LDM 2pmol/kg。圖5c表示強(qiáng)化融合蛋白scFv-LDM對(duì)裸鼠移植性⑶20+B細(xì)胞淋巴瘤模型的治療 作用。其中， 代表 PBS;X 代表 LDM 0. 05mg/kg ；※代表 scFv-LDM 0. 3mg/kg ；參代表 scFv-LDM 0. 2mg/kg ；▲代表 scFv-LDM 0. lmg/kg。發(fā)明詳述在本發(fā)明中所提及的術(shù)語(yǔ)均按下述定義來(lái)理解。在本文中提到的“LDM”等同于“LDP-AE”、“力達(dá)霉素”、“力達(dá)霉素輔基蛋白，其中 輔基蛋白上結(jié)合有發(fā)色團(tuán)AE”。發(fā)色團(tuán)和輔基蛋白通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合，兩者結(jié)合具有特異性 和牢固性，LDM的輔基蛋白和發(fā)色團(tuán)可以拆分和進(jìn)行分子重新組裝。在本文中提到的“AE”是指具有下式I所示的化學(xué)結(jié)構(gòu)的發(fā)色團(tuán)，
LDM發(fā)色團(tuán)的化學(xué)名(2R，7S，9R，10R) _7_ 氨基-7,8- (2*-氯 _6*_ 羥基-1*，4*-亞苯基)-10- (4，-去 氧-4，-二甲氨基_5，，5，-二甲基-吡喃核糖基)-4，8_氧雜-5-氧代-1，11，13-三烯-15， 18- 二炔-三環(huán)[7，7，3，O10,14]-2-十九碳醇-2”，3”- 二氫-7”-甲氧基-2”-亞甲基-3”-氧 代-1”，4”-苯并惡嗪-5”-羧酸酯。分子式=C43H42O13N3Cl力達(dá)霉素發(fā)色團(tuán)結(jié)構(gòu)式(I)其由野生型力達(dá)霉素生產(chǎn)菌產(chǎn)生，天然地結(jié)合于力達(dá)霉素的輔基蛋白上，而且可 以通過(guò)在低溫條件下用冷甲醇等有機(jī)溶劑處理力達(dá)霉素的方式得到游離狀態(tài)的發(fā)色團(tuán)AE， 該游離的發(fā)色團(tuán)AE可以與去除了 AE的力達(dá)霉素輔基蛋白LDP或者基因工程產(chǎn)生的LDP (其 上可以融合有其它蛋白片段或者不融合有其它蛋白片斷)在低溫條件下組裝成與天然力 達(dá)霉素形式相同的活性形式，這種重新組裝被稱為“強(qiáng)化”。在本文中提到的“Fab”等同于“Anti_CD20 (Fab)、“抗CD20Fab”、“抗CD20抗體的 Fab片段”、“SEQ ID NO 1 所示的第24-467位所示的抗CD20抗體Fab片段”。在本文中提到的“Fab-LDP”等同于“antiCD20 (Fab)-LDP”、“抗CD20抗體的Fab片 段與力達(dá)霉素輔基蛋白的融合蛋白”、“ SEQ IDNO 1所示的融合蛋白。在本文中提到的“scFv”等同于、“抗⑶20抗體的單鏈抗體片段”、 “antiCD20 (scFv) ”、“SEQ ID NO 2 的第 24-266 位所示的抗 CD20 抗體 scFv 片段”。在本文中提到的“scFv-LDP”等同于“anti-CD20(scFv)_LDP”、“抗CD20抗體的單 鏈抗體片段與力達(dá)霉素輔基蛋白的融合蛋白”、“SEQ ID NO :2所示的融合蛋白”。在本文中提到的“Fab-LDM”等同于“強(qiáng)化融合蛋白 Fab-LDM" “antiCD20 (Fab)-LDP-AE”、“抗 CD20 抗體的 Fab 與力達(dá)霉素的融合蛋白”、“SEQ ID NO 1所示的融合蛋白，其中力達(dá)霉素霉素輔基蛋白上結(jié)合有發(fā)色團(tuán)AE”。在本文中提到的“scFv-LDM”等同于“強(qiáng)化融合蛋白scFv_LDM”“antiCD20 (scFv)-LDP-AE”、“抗CD20抗體的單鏈抗體與力達(dá)霉素輔基蛋白的融合蛋白，其中輔基蛋白上結(jié)合 有發(fā)色團(tuán)AE”、“抗⑶20抗體的單鏈抗體與力達(dá)霉素的融合蛋白” “SEQ ID NO :2所示的融 合蛋白，其中力達(dá)霉素霉素輔基蛋白上結(jié)合有發(fā)色團(tuán)AE”。具體地，本發(fā)明了提供了下述內(nèi)容1.融合蛋白，其選自下述序列之一
(a)由SEQ ID NO :1或3所示的氨基酸序列構(gòu)成的氨基酸序列；(b)具有SEQ ID NO :1或3所示的氨基酸序列的生物學(xué)功能、且與SEQ ID NO 1 或者3所示的氨基酸序列具有95%以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成的氨基酸序列；和(c)具有SEQ ID NO :1或3所示的氨基酸序列的生物學(xué)功能，且經(jīng)過(guò)取代、缺失或 添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的SEQ ID NO :1或3所示的氨基酸序列構(gòu)成的氨基酸序列。2.項(xiàng)目1的融合蛋白，其還功能性地結(jié)合有式⑴所示結(jié)構(gòu)的發(fā)色團(tuán)AE 力達(dá)霉素發(fā)色團(tuán)結(jié)構(gòu)式(I)3.核酸分子，其編碼項(xiàng)目1的融合蛋白的基因，其選自下述序列之一(a) SEQ ID NO 2所示的編碼SEQ ID NO 1的核苷酸序列；(b)SEQ ID NO 4所示的編碼SEQ ID NO 3的核苷酸序列；(c)編碼項(xiàng)目1中(b)的氨基酸序列的核苷酸序列；(d)編碼項(xiàng)目1中(C)的氨基酸序列的核苷酸序列；和(e)因?yàn)槊艽a子簡(jiǎn)并性而分別與SEQ ID NO 2和4不同、但是編碼與SEQ ID NO 2或4所示序列相同的氨基酸序列的核苷酸序列。4.載體，其可操作地連接有項(xiàng)目3所述的核酸分子。5.項(xiàng)目4的載體，所述載體是質(zhì)粒。6.宿主菌，其包含項(xiàng)目4所述的載體。7.項(xiàng)目6的宿主菌，其是保藏號(hào)為CGMCC No. 3125，于2009年06月17日送交中 國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心保藏的名為IHPAYZ的大腸埃希氏菌。8.項(xiàng)目6的宿主菌，其是保藏號(hào)為CGMCC No. 3100，于2009年06月17日送交中 國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心保藏的名為IMBPAYZ的大腸埃希氏菌。9.制備項(xiàng)目2的融合蛋白的方法，包括以下步驟(a)將抗⑶20抗體的Fab基因與力達(dá)霉素輔基蛋白LDP基因可操作地連接到質(zhì) 粒pCANTAB 5E中，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pCANTAB5E_Fab_LDP，或者將抗CD20抗體的可變區(qū)單 鏈scFv基因與力達(dá)霉素輔基蛋白LDP基因可操作地連接到質(zhì)粒pCANTAB 5E中，得到重組 表達(dá)質(zhì)粒 pCANTAB 5E-scFv-LDP,(b)在大腸桿菌HB2151中的誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白Fab-LDP、scFv-LDP，(c)純化及其復(fù)性步驟(b)中獲得的融合蛋白，
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(d)使步驟(C)中獲得的融合蛋白與式(I)的發(fā)色團(tuán)組裝，(e)任選地，其還包括測(cè)定步驟(d)中組裝后的融合蛋白的生物學(xué)活性的步驟。10.藥物組合物，其中含有藥學(xué)有效量的項(xiàng)目1或者2所述的融合蛋白，任選地，還 含有藥學(xué)上允許的佐劑。11.項(xiàng)目1或者2的融合蛋白在制備用于腫瘤靶向治療的藥物中的用途。12.項(xiàng)目11的用途，所述藥物用于靶向殺傷淋巴瘤細(xì)胞。13.項(xiàng)目11的用途，其中的淋巴瘤是裸鼠淋巴瘤或者人B細(xì)胞淋巴瘤。下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
進(jìn)行闡述，所述的實(shí)施方式僅僅用來(lái)解 釋和說(shuō)明本發(fā)明，其并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。任何本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)公知的知識(shí)和 現(xiàn)有技術(shù)的教導(dǎo)能夠想到的等價(jià)的變體都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍中。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11.重組表汰質(zhì)粒 dCANTAB 5E-antiCD20Fab-LDP 的構(gòu)津PCR 擴(kuò)增 CHl:由于重組質(zhì)粒pCANTAB 5E Fcd20Fab，含有抗CD20單抗HI47的VH、VL及人源化 CL、CH1基因，且重組質(zhì)粒pCANTAB 5E Fcd20Fab，只有CHl區(qū)含有一個(gè)apal酶切位點(diǎn)，所以 申請(qǐng)人:用含有Fab，基因的重組質(zhì)粒pCANTAB 5E Fcd20Fab，(Inhibition of human B-cell lymphoma by ananti-CD20antibody and its chimeric(Fab')2fragment via inductionof apoptosis. YinxingLiu, ZhenpingZhu et. al. Cancer Letters205 (2004) 143-153)作為模 版，獲得CHI。PCR引物由上海英駿公司合成，分別引入相應(yīng)酶切位點(diǎn)。具體地，以pCANTAB 5E Fcd20Fab'做為模板，用Pl作為5，端引物，P2作為3，端 引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5分鐘，然后94°C變性1分鐘，56°C退火1分 鐘，72°C延伸1分鐘，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。最后一個(gè)循環(huán)后，72°C延伸10分鐘。得到以apal酶 切位點(diǎn)開頭的部分CHl的基因片段A(約324bp)。將片段A進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并 用博大泰克公司A型膠回收試劑盒回收純化。Anti_CD20Fab，上游引物 Pl 5，-GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCC-3‘ (SEQ ID No 5)apal酶切位點(diǎn)Anti_CD20Fab，下游引物 P2 5， -CGCGCTGCCACCGCCACCTGTGTGAGTTTTGTCACAAGA-3， (SEQ ID No 6)LDP上游引物P3:5，-ACAGGTGGCGGTGGCAGCGCGCCCGCCTTCTCCGTC3，(SEQ ID No 7)LDP下游引物P4:5，-GCGCGCATGCTCAGCCGAAGGTCAGAGCCAC-3‘ (SEQ ID No 8)sphl酶切位點(diǎn)PCR 擴(kuò)增 LDP:用含有LDP基因的重組質(zhì)粒pET30sngrldp(保藏號(hào)CGMCCNo. 2010)為模板，用P3 作為5’端引物，用P4作為3’端引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5分鐘，然后
1094°C變性1分鐘，60°C退火1分鐘，72°C延伸1分鐘，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。最后一個(gè)循環(huán)后，72°C 延伸10分鐘。得到LDP的基因片段B(約330bp)。將片段B進(jìn)行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳， 并用博大泰克公司A型膠回收試劑盒回收純化。SOE-PCR 擴(kuò)增 Fab-LDP 利用純化的片段A(CHl)和片段B(LDP)產(chǎn)物，進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件94°C變性1分 鐘，60°C退火1分鐘，72°C延伸2分鐘，共10個(gè)循環(huán)，然后72°C再延伸10分鐘，生成少量 CHl-Iinker-LDP模板。完成上步反應(yīng)后，補(bǔ)加Pl和P4引物，進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件94°C變性 1分鐘，60°C退火1分鐘，72°C延伸2分鐘，共30個(gè)循環(huán)，72°C再延伸10分鐘。得到Fab-LDP 基因片段C (片段A+B，約669bp)，將反應(yīng)產(chǎn)物C進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并用博大泰克公司A型膠回收試劑盒回收 純化。將回收得到的Fab-LDP片段和pCANTAB 5E Fcd20Fab，載體分別經(jīng)apal、sphl酶切 后，將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并用博大泰克公司A型膠回收試劑盒回收純化。 將得到的載體酶切產(chǎn)物與目的基因的酶切產(chǎn)物按1 6的比例用Takara公司的T4連接酶 16°C連接16個(gè)小時(shí)后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌HB2151，篩選出重組克隆質(zhì)粒，并進(jìn)行菌液PCR 及酶切鑒定后，測(cè)序，結(jié)果表明，融合基因重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切結(jié)果和測(cè)序結(jié)果與預(yù)期完全 一致，融合蛋白的基因編碼序列為669bp，序列正確，命名為pCANTAB 5E Fab-LDP,菌體PCR 產(chǎn)物的電泳圖參見(jiàn)圖la。其中Fab-LDP的蛋白質(zhì)序列如SEQ ID NO 1所示，其中，1_23位為信號(hào)肽；24-132 位為輕鏈可變區(qū)；133-237位為輕鏈恒定區(qū)；238-359位為重鏈可變區(qū)；360-467位為重鏈 CHl區(qū)；468-472位為G4S ；473-582位為力達(dá)霉素輔基蛋白。Fab-LDP的DNA序列如SEQ ID NO 3所示，其中1_69位為信號(hào)肽基因序列， 70-396位為輕鏈可變區(qū)基因序列；397-711位為輕鏈恒定區(qū)基因序列；712-1077位為重鏈 可變區(qū)基因序列；1078-1401位為重鏈CHl區(qū)基因序列；1402-1416位為G4S ； 1417-1746位 為力達(dá)霉素輔基蛋白基因序列；1747-1752位為SphI酶切位點(diǎn)；1753-1755位為終止密碼子。2.重組表達(dá)質(zhì)粒 DCANTAB-anti-CD20scFv_LDP 的構(gòu)建設(shè)計(jì)PCR引物，所述PCR引物由上海英俊公司合成，分別引入相應(yīng)酶切位點(diǎn)。重鏈可變區(qū)(VH)5'端引物 PHl (SEQ ID NO 9)5， -CAAACGCGTACGCTCAGGTGAAGCTG-3’MluI重鏈可變區(qū)(VH)3'端引物 PH2(SEQ ID NO 10)5' -ACCGCCGGATCCACCGCCACCCGAGCCACCGCCTCCTGAGGAGACGGTGACCGTGATC-3’Linker輕鏈可變區(qū)(VL)5'端引物 PLl (SEQ ID NO 11)5' -GGCTCGGGTGGCGGTGGATCCGGCGGTGGCGGTTCGGACATCGAGCTCACTCAGTCTC-3’Linker輕鏈可變區(qū)(VL)3'端引物 PL2(SEQ ID NO 12)5， -GAGCATGCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTGATCTCCACCTTGGTCCCAG-3’SphIhis6XhoI
PCR 擴(kuò)增 VH、VL:以含有Fab，基因的重組質(zhì)粒pCANTAB 5E Fcd20Fab'為模板，用PHl作為5，端引 物，PH2作為3’端引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5分鐘，然后94°C變性1分鐘， 58°C退火1分鐘，72 °C延伸1分鐘，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。最后一個(gè)循環(huán)后，72 °C延伸10分鐘，得 到VH基因片段D (約370bp)。將得到的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，并用BioDev 公司的玻璃奶試劑盒回收純化VH片段。以含有Fab，基因的重組質(zhì)粒pCANTAB 5E Fcd20Fab'為模板，用PLl作為5，端 引物，用PL2作為3’端引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5分鐘，然后94°C變性 1分鐘，58°C退火1分鐘，72°C延伸1分鐘，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。最后一個(gè)循環(huán)后，72°C延伸10 分鐘，得到VL基因片段E (約320bp)。將得到的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，并用 BioDev公司的玻璃奶試劑盒回收純化VL片段。SOE-PCR 擴(kuò)增 scFv 利用純化的VH和VL PCR產(chǎn)物，進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件94°C變性1分鐘，60°C退火1 分鐘，72°C延伸2分鐘，共7個(gè)循環(huán)，然后72°C再延伸10分鐘，生成少量VH-Iinker-VL模 板。上步反應(yīng)完后，補(bǔ)加PHl和PL2引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件94°C變性1分鐘，56°C 退火1分鐘，72°C延伸2分鐘，共25個(gè)循環(huán)。72°C再延伸10分鐘。擴(kuò)增得到scFv基因片 段F (約760bp)，將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳，并用BioDev公司的玻璃奶試劑盒回 收純化scFv片段。所得到的scFv基因片段是由編碼(GGGGS)3序列的spacer短肽將重鏈 可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)VL連接而成的一條多肽鏈。將scFv按Takara公司18T載體試劑盒(產(chǎn)品號(hào)D504A)提供的方法與18T載體 相連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α (上海生工，產(chǎn)品號(hào)SD8411)，篩選出重組克隆質(zhì)粒，測(cè)序正確后 命名為18T-scFV。將質(zhì)粒18T-scFV進(jìn)行MluI/SphI雙酶切，釋放出的scFv基因片段與進(jìn) 行同樣雙酶切的PCANTAB5E載體連接，得到scFv基因重組表達(dá)質(zhì)粒pCANTAB 5E-scFv,并進(jìn) 行酶切鑒定和序列鑒定。結(jié)果表明，重組表達(dá)質(zhì)粒pCANTAB 5E-SCFv的酶切結(jié)果和測(cè)序結(jié) 果與預(yù)期完全一致，單鏈抗體基因編碼序列為762bp，由254個(gè)氨基酸組成，序列正確。在scFv基因5’端引入了 MluI酶切位點(diǎn)，3，端引入了 SphI酶切位點(diǎn)，利于與 pCANTAB 5E載體連接，3’端XhoI酶切位點(diǎn)的設(shè)置，利于下一步LDP的連接；6個(gè)連續(xù)組氨 酸標(biāo)簽肽(His6-Tag)的密碼子，使得下一步表達(dá)蛋白的3’端融合有His6-Tag,便于純化和 鑒定。3.抗⑶20單鏈抗體scFv基因和力達(dá)霉素輔基蛋白LDP基因的克隆及重組表達(dá)質(zhì) 粒 pCANTAB 5E-scFv-LDP 的構(gòu)建引物 P5 :5，CAGCATATGAACGCGTACGCTCAGGTGAAG 3，(SEQ ID NO 13)NdeI MluI引物 P6 :5，CGCGAATTCTGAACCGCCTCCACCTTTGATCTCCACCTTGGT 3，(SEQ ID NO 14)EcoRI引物 P7 :5，CGGAATTCGCGCCCGCCTTCTCCGTCAGTCCC3，(SEQ ID NO 15)EcoRI引物 P8 :5，CCGCTCGAGTCAGCCGAAGGTCAGAGCCACGTG 3，(SEQ ID NO: 16)XhoI
以前述獲得的質(zhì)粒pCANTAB 5E-scFv為模板，P5為5’端引物，P6為3’端引物，進(jìn) 行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5分鐘后，94°C變性1分鐘，55°C退火1分鐘，72 °C 延伸1分鐘，30個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)結(jié)束后，72°C延伸10分鐘，得到長(zhǎng)約760bp的scFv基 因片段。將該反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并用BioDev公司的玻璃奶試劑盒回收純 化scFv片段。然后將回收得到的scFv片段按Takara公司18T載體試劑盒提供的方法與18T載 體相連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，經(jīng)轉(zhuǎn)化篩選后得到質(zhì)粒IST-scFv，陽(yáng)性克隆測(cè)序正確后命名 為18T-ScFv，擴(kuò)增后進(jìn)行Ndel/EcoRI雙酶切，釋放scFv基因片段。質(zhì)粒pET30sngrldp(保藏號(hào) CGMCCNo. 2010)為模板，P7 為 5，端引物，P8 為 3， 端引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件94°C變性2min后，94°C變性lmin，58°C退火Imin, 72°C 延伸lmin，25個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)結(jié)束后在72°C延伸lOmin，得到長(zhǎng)約330bp的LDP基 因擴(kuò)增產(chǎn)物。將LDP基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行EcoRI/XhoI雙酶切，得到LDP基因片段。將scFv 基因片段與LDP基因片段同時(shí)與pGEMTCTakara公司)進(jìn)行連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化篩選后得到質(zhì)粒 pGEMT-scFv-LDP。擴(kuò)增后進(jìn)行Mlul/Xhol雙酶切，釋放約IlOObp的scFv-LDP基因片段與進(jìn)行同樣 雙酶切的pCANTAB 5E-scFv載體連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB2151，篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，得 重組表達(dá)質(zhì)粒pCANTAB 5E-scFV-LDP并進(jìn)行酶切鑒定和序列測(cè)定。結(jié)果表明，融合基因重 組表達(dá)質(zhì)粒pCANTAB5E-scFV-LDP的酶切結(jié)果和測(cè)序結(jié)果與預(yù)期完全一致，融合蛋白的基 因編碼序列為1176bp，由392個(gè)氨基酸組成，序列正確(圖lb)。其中scFv-LDP的蛋白質(zhì)序列如SEQ ID NO :2所示，其中，1_23位為信號(hào)肽；24-145 位為輕鏈可變區(qū)；146-160位為(G4S)3 ;161-266位為重鏈鏈可變區(qū)；267-271位為G4S ； 272-273位為谷氨酸、苯丙氨酸；274-383位為力達(dá)霉素輔基蛋白；384-385位為亮氨酸、谷 氨酸；386-391位為6個(gè)組氨酸純化標(biāo)簽。ScFv-LDP的DNA序列如SEQ ID NO 4所示，其中1_69位為信號(hào)肽；70-435位為 輕鏈可變區(qū)基因序列；436-480位為(G4S)3 ；481-798位為重鏈鏈可變區(qū)基因序列；799-813 位為G4S;814-819位為EcoRI酶切位點(diǎn)；820-1149位為力達(dá)霉素輔基蛋白基因序列； 1150-1155位為XhoI酶切位點(diǎn)；1156-1173位為6個(gè)組氨酸純化標(biāo)簽；1174-1176位為終止
密碼子。所得到的scFv-LDP基因的5，端引入了 MluI酶切位點(diǎn)，3，端引入了 XhoI酶 切位點(diǎn)，利于與pCANTAB 5E載體連接，恰好可利用上步構(gòu)建的6個(gè)連續(xù)組氨酸標(biāo)簽肽 (His6-Tag)的密碼子，使得表達(dá)蛋白的3’端融合有His6-Tag,便于純化和鑒定。4. IFab-LDP 的表達(dá)將前述1中獲得的含有質(zhì)粒pCANTAB 5E-anti-CD20Fab_LDP的大腸桿菌HB2151 的單菌落接種于5ml含氨芐青霉素(Amp)100yg/ml的2XYT培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u瓶箱中 37°C，200rpm，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；移入500ml含Amp 100 μ g/ml的2XYT培養(yǎng)基(1L的2XYT 培養(yǎng)基含1.6%胰化蛋白胨、1.0%酵母抽提物、0.5%氯化鈉，PH 7.4)中，37°C，200rpm，振 蕩培養(yǎng)8h后，在低溫高速真空離心機(jī)上6000rpm、4°C離心10分鐘收集菌體，將菌體重新懸 浮于 1000ml 含 Amp 100 μ g/ml 及 ImM IPTG 的 2 X YT 培養(yǎng)基，30°C，200rpm，振蕩培養(yǎng) 4h ； 8，000rpm、4°C離心10分鐘收集菌體，冷凍于_20°C冰箱備用。
將凍存的菌體化凍，加入50ml細(xì)菌周質(zhì)腔蛋白提取液(三羥甲基氨基甲烷 25mmol/L,乙二胺四乙酸 lmmol/L，苯甲基磺酰氟(PMSF) 0. lmmol/L，蔗糖 20% (w/w，NaCl 200mmol/L, pH 7. 5)，振蕩混勻，置于4°C輕搖lh。12000rpm，4°C離心20分鐘，取上清。將 提取物用PBS透析12h后，在快速蛋白層析儀(FPLC)上進(jìn)行純化，用結(jié)合緩沖液(0. Olmol/ LNaH2PO4,0.01mol/L Na2HPO4,0. 005% NaN3, pH 7.0)平衡親和層析柱，上樣，再用結(jié)合緩沖 液沖洗基線，至基線穩(wěn)定后，用洗脫緩沖液(0. lmmol/L Glycine,pH 3.0)洗脫，洗脫液用中 和緩沖液(lmol/L Tris-HCl,0. 05% NaN3, pH 8.2)中禾口 pH 值。然后用 12% SDS-PAGE 分 析外源蛋白表達(dá)情況，結(jié)果表明，經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌株表達(dá)了大量外源蛋白，且Fab-LDP的表 達(dá)產(chǎn)物主要存在于細(xì)菌可溶性周質(zhì)腔中(圖2a)。4. 2 用 Western 印跡法確認(rèn) Fab-LDP將4. 1獲得到的蛋白進(jìn)行電泳，電泳后的凝膠在Bio-Rad電轉(zhuǎn)槽中進(jìn)行半干 電轉(zhuǎn)，條件為恒電流0.7mA/Gm2，時(shí)間為5小時(shí)。電轉(zhuǎn)結(jié)束后的聚偏二氟乙烯膜(PVDF) 與用封閉液10倍稀釋的一抗即抗LDP單抗(保藏編號(hào)CGMCC No. 1849)孵育，以辣根 過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體為二抗，進(jìn)行顯色分析，結(jié)果表明，重組 菌株表達(dá)的確為C-末端帶有LDP的重組融合蛋白Fab-LDP(圖2b)。將該含有質(zhì)粒 pCANTAB5E-anti-CD20Fab-LDP 的表達(dá)融合蛋白 Fab-LDP 的大腸埃希氏菌(Escherichia coli)命名為IHPAYZ，于2009年06月17日送交中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心保藏， 保藏編號(hào)CGMCC No. 3125。5. IscFv-LDP (即 anti_CD20 (scFv)-LDP)的表達(dá)以3中獲得到重組質(zhì)粒pCANTAB 5E_anti_CD20 (scFv)-LDP轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB2151， 得到重組轉(zhuǎn)化菌。挑取單克隆接種于50mL 2XYT培養(yǎng)基中(含100yg/mL氨芐青霉 素)，37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；離心收集菌體，將菌體重懸于IOOmL 2XYT培養(yǎng)基(含 100 μ g/mL氨芐青霉素及ImMIPTG) ,30振蕩培養(yǎng)4h ；離心收集菌體，將菌體于-20°C冷 凍。分別制備全細(xì)胞蛋白組分、培養(yǎng)液上清組分、細(xì)胞周質(zhì)腔組分、可溶性細(xì)胞質(zhì)和不可溶 性細(xì)胞質(zhì)(包涵體)組分，然后在變性條件下進(jìn)行15%聚丙烯酰胺凝膠電泳分析外源蛋白 表達(dá)情況。結(jié)果表明，經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌株表達(dá)了大量外源蛋白，表達(dá)量占全菌總蛋白的30 % 以上，達(dá)到30mg/L。且表達(dá)產(chǎn)物主要存在于細(xì)菌不可溶的包涵體中(圖2c)。5. 2 用 Western 印跡法確認(rèn) scFv-LDP將4. 3中的蛋白進(jìn)行電泳，電泳后的凝膠在Bio-Rad電轉(zhuǎn)槽中進(jìn)行半干電轉(zhuǎn)，條 件為恒電流0. 65mA/cm2,時(shí)間為1小時(shí)50分鐘。電轉(zhuǎn)結(jié)束后的聚偏二氟乙烯膜(PVDF) 與用封閉液2000倍稀釋的一抗即抗His6-Tag單抗(天根生化科技有限公司目錄號(hào) AB102-01)孵育，以辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體為二抗，進(jìn)行顯色分 析，結(jié)果表明，重組菌株表達(dá)的確為C-末端帶有His6-Tag的重組融合蛋白scFv-LDP(即 Anti-CD20 (scFv) -LDP)(圖 2d)。將該含有 pCANTAB5E_anti_CD20 (scFv) -LDP 質(zhì)粒的表達(dá) scFv-LDP的大腸埃希氏菌(Escherichia coli)命名為IMBPAYZ，于2009年06月17日送 交中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心保藏，保藏編號(hào)CGMCC No. 3100。5. 3scFv-LDP的純化和復(fù)性采用Novagen公司的His 'Bind純化試劑盒于變性條件下純化融合蛋白scFv_LDP 樣品，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。對(duì)包涵體蛋白樣品和親和層析柱進(jìn)行預(yù)處理后，樣品上柱，依次以10倍柱床體積的含6M尿素的結(jié)合緩沖液(5mM咪唑，0. 5M NaCl, 20mM Tris-HCl pH 7. 9)，6倍柱體積的含6M尿素的洗滌緩沖液(60mM咪唑，0. 5M NaCl, 2OmMTris-HCl pH 7.9)洗滌層析柱，最后以含6M尿素的洗脫緩沖液(100mMEDTA，0. 5M NaCl, 20mM Tris-HCl PH 7. 9)進(jìn)行洗脫，收集洗脫組分獲得純化的融合蛋白scFv-LDP(圖2e)。將上述純化后的樣品用含6M尿素的洗脫緩沖液稀釋至15 μ M，加入2-巰基乙醇至 終濃度為10mM，室溫放置30分鐘，然后將樣品裝入透析袋，用至少50倍樣品體積的復(fù)性液 I(50mM Tris-HCl pH 8. O, ImMEDTA, 200mM NaCl，6M 尿素)透析過(guò)夜。再用與復(fù)性液 I 同樣 組分但尿素濃度依次為3M、2M、1M、0. 5M、0M的50倍體積的緩沖液進(jìn)行分步透析，在尿素濃 度為IM的階段加入750 μ M的氧化型谷胱甘肽(GSSG)和400mM的L-精氨酸。將最后一次 透析所得樣品用50倍體積磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7. 4)透析，每12小時(shí)更換一次透析液， 共兩次。以上透析操作均于4°C進(jìn)行。將透析后的樣品以10000g，4°C離心30分鐘，收集上 清。將上清樣品進(jìn)行濃縮后得到活性融合蛋白scFv-LDP，置于-80°C備用。6. IFab-LDP的免疫學(xué)活性通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定Fab-LDP的免疫熒光結(jié)合活性。將1 X IO6個(gè)Raji細(xì)胞重懸 于含有不同濃度的 FITC 標(biāo)記的抗 CD20Fab 片段(Inhibition of human B-cell lymphoma by an anti_CD20antibody andits chimeric(Fab' ) 2 fragment via induction of apoptosis. YinxingLiu, ZhenpingZhu et. al. Cancer Letters 205(2004) 143-153)或 Fab-LDP的IOOyL PBS溶液中，4°C放置lh，2000g，離心10分鐘，棄上清液，PBS洗3次， FACS測(cè)定抗⑶20Fab片段或Fab-LDP結(jié)合Raji細(xì)胞的陽(yáng)性率。證明相同濃度的抗⑶20Fab 片斷及Fab-LDP與Raji細(xì)胞的結(jié)合活性基本相同，F(xiàn)ab-LDP融合蛋白保留了與靶抗原特異 性結(jié)合的能力(圖3a)。6. 2融合蛋白scFv-LDP的免疫學(xué)活性。以酶聯(lián)免疫吸附分析方法(ELISA)測(cè)定scFv-LDP的免疫學(xué)活性。首先進(jìn)行下述 的Raji和Daudi細(xì)胞固定在96孔培養(yǎng)板中加入0. 01 %的多聚賴氨酸，200 μ 1/孔，4°C濕 盒中包被過(guò)夜。棄去包被液，PBS洗1次。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Raji或daudi細(xì)胞，以生理鹽 水調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2X IO6個(gè)/ml，并以50 μ 1/孔加至培養(yǎng)板。800g離心5分鐘后，棄去上清 液，并在培養(yǎng)板中加入4°C預(yù)冷的0. 05%的戊二醛，50 μ 1/孔，于4°C固定細(xì)胞15分鐘。固 定好細(xì)胞的96孔板用PBS洗3次后，用含的牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液200 μ 1/ 孔、4°C封閉過(guò)夜。PBS洗3次，加入倍比稀釋的待測(cè)樣品，50 μ 1/孔，每個(gè)濃度設(shè)三個(gè)平行 孔，37°C溫育2h。PBST洗板3次，然后加入1 1500倍稀釋的anti-His tag單克隆抗體， 50 μ 1/孔，37°C反應(yīng)lh。PBST洗板3次，然后加入1 2000倍稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo) 記的羊抗小鼠IgG，50y 1/孔，37°C反應(yīng)lh。PBST洗板6次，然后加入OPD鄰苯二胺底物反 應(yīng)液100 μ 1/孔，室溫暗處反應(yīng)10分鐘。以2MH2S04 1 00 μ 1/孔終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定 490nm吸光值。結(jié)果表明，scFv-LDP對(duì)Raj i、Daudi淋巴瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)呈陽(yáng)性，抗體的 相對(duì)親和力約為4Χ1(Γ7Μ、8Χ1(Γ7Μ，但明顯低于Fab 8 X ICT8M的親和力(Inhibition of human B-cell lymphoma by an anti_CD20antibody and its chimeric (Fab' ) 2 fragment via induction ofapoptosis.YinxingLiu, ZhenpingZhu et.al.Cancer Letters205(2004) 143-153)，證明 scFv_LDP(即 anti-CD20scFv_LDP)保留了單抗對(duì) CD20
15抗原部分結(jié)合活性(圖3b、C)。7.力達(dá)霉素的制備及其活性型發(fā)色團(tuán)AE的相對(duì)含量測(cè)定7. 1力達(dá)霉素的制備 將力達(dá)霉素產(chǎn)生菌(CGMCC NO. 0135)冷干管中加0. 7ml無(wú)鹽水，使之形成菌懸液， 用白金耳接種于高氏1號(hào)斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，280C，7-10天，表面生長(zhǎng)白色氣生菌絲，取一小 塊接種于一級(jí)種子100ml/500ml三角瓶培養(yǎng)(發(fā)酵培養(yǎng)基成分為淀粉1 %，玉米漿0. 5%， 血胨 0. 5%，葡萄糖 0. 5%, MgSO4 0. 02%, KI 0. 06%，玉米面 1. 5%, CaCO3 0. 4%,自來(lái)水 配制，pH 7. 0，15磅消毒)，28°C，旋轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)48h，在轉(zhuǎn)種5%于1000ml/5000ml立瓶中 作為二級(jí)種子，以相同發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，28 V，往返搖床培養(yǎng)18h，上200L發(fā)酵罐，裝量為 100L,接種量2%，加0. 03%泡敵為消沫劑，罐壓0. 04，28°C，攪拌400轉(zhuǎn)/分，氣流1/1， PH 6. 5-7.0，發(fā)酵96h，得到所需發(fā)酵液。取發(fā)酵液10L，離心取上清，以HCl調(diào)至pH 4.0， 力口 (NH4)2S044. 5Kg于8 °C攪拌3h，析出的力達(dá)霉素離心分離(4°C，8000轉(zhuǎn)/分，15min)， 所得的沉淀物加200ml冷水溶解，透析，再離心除去不溶物，上清液經(jīng)羥基磷灰石柱吸附， 0. OOlM磷酸緩沖液(pH6.8)洗脫，活性部分冷凍干燥，得粗制品1500mg。粗制品溶于水，經(jīng) Sephadex G-75柱層析，活性部分冷凍干燥后，得到145mg抗腫瘤高活性的力達(dá)霉素白色粉 末精制品。7. 2活性型發(fā)色團(tuán)AE的相對(duì)含量測(cè)定與LDM蛋白部分相比，發(fā)色團(tuán)分子量較小，其理論含量?jī)H占力達(dá)霉素的7. 4%。由 于AE是LDM發(fā)揮作用的活性部分，輔基蛋白僅有保護(hù)AE的功能，因此一般通過(guò)測(cè)定AE在 發(fā)色團(tuán)總量中的相對(duì)含量，即可以確定LDM制品的活性高低。采用HPLC對(duì)LDM進(jìn)行分析可以測(cè)得AE占發(fā)色團(tuán)總量的百分比值，具體方法為將如上述制備的LDM制品溶于HPLC流動(dòng)相(乙腈水為23 77)，在FPLC快速 蛋白色譜儀上經(jīng)Waters徑向加壓C4半制備柱分離，洗脫液為乙腈水(23 77)，自動(dòng)收 集器收集，用HPLC C4分析柱檢測(cè)收集到的各組分。分析結(jié)果顯示，本發(fā)明人制備的LDM，其AE組分占LDM發(fā)色團(tuán)總量的90. 63%。通 過(guò)分析確定該LDM制品符合LDM的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，為AE高含量的LDM精制品，將該LDM制 品凍干，置于-80°C冰箱保存，以便用于強(qiáng)化融合蛋白Fab-LDM、scFv-LDM的制備。7. 3.強(qiáng)化融合蛋白Fab-LDM、scFv-LDM的制備。取高活性LDM凍干品10mg，加5ml冷甲醇振搖5分鐘，-20 V放置1小時(shí)，中間振 搖1次；在0°C，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，上清液含發(fā)色團(tuán)AE，沉降物為肽鏈，重復(fù)提 取2次。將含有發(fā)色團(tuán)AE的甲醇液蒸發(fā)濃縮，-70°C儲(chǔ)存。發(fā)色團(tuán)AE不穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)需低溫 (4°C)、避光進(jìn)行。然后取Fab-LDP及scFv-LDP融合蛋白分別溶于PBS中，加入5倍摩爾分子量的 發(fā)色團(tuán)-甲醇溶液(體積比為50 1)，混合振搖，室溫放置12小時(shí)。最后將混合液進(jìn)行 PD-10柱層析，經(jīng)A280nm和A343nm紫外監(jiān)測(cè)后收集強(qiáng)化融合蛋白Fab-LDM及scFv-LDM。8.1 Fab-LDM對(duì)體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的特異性的細(xì)胞毒作用以噻唑藍(lán)(MTT)法進(jìn)行測(cè)定細(xì)胞毒作用。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Raji或Daudi細(xì)胞、計(jì) 數(shù)，2X IO4個(gè)/孔鋪于96孔板，在37°C含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時(shí)后加入不同濃度 的藥物，每個(gè)藥物濃度設(shè)3個(gè)平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，2000rpm/分鐘離心10分鐘，棄上清。每孔加入20 μ 1 PBS溶解的MTT (5mg/ml)，37°C繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，2000rpm/分鐘離心10 分鐘，輕輕棄去上清，加入100 μ 1 二甲基亞砜(DMSO)，室溫下?lián)u床振搖5分鐘，酶標(biāo)儀上測(cè) 定546nm光吸收值。每次試驗(yàn)均設(shè)無(wú)藥對(duì)照孔和無(wú)細(xì)胞對(duì)照孔各3孔。按下述公式計(jì)算細(xì) 胞的存活率及半數(shù)抑制濃度(IC5tl)值細(xì)胞存活率=(A加藥組-A空白組)/(A對(duì)照組-A 空白組)X100%。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)強(qiáng)化融合蛋白Fab-LDM對(duì)Raji、Daudi細(xì)胞的IC5tl值分別為0. 9X IiT10M 和0. 8X ΙΟ,Μ，對(duì)無(wú)特異性⑶20抗原的Κ562細(xì)胞的IC5tl值為3. OX ΙΟ,Μ，而力達(dá)霉素對(duì) Raji,Daudi細(xì)胞的IC50值分別為3. 1 X 1(Γ10Μ和2. 9X 1(Γ10Μ，對(duì)無(wú)特異性CD20抗原的Κ562 細(xì)胞的IC5tl值為2. 8 X KTiqM,表明Anti-CD20 (Fab)-LDM較好的保留了力達(dá)霉素的細(xì)胞毒作 用，并對(duì)腫瘤細(xì)胞有選擇性殺傷作用(圖4a)。8. 2scFv-LDM對(duì)體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的特異性的細(xì)胞殺傷作用以噻唑藍(lán)(MTT)法進(jìn)行測(cè)定細(xì)胞殺傷作用。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Raji或Daudi細(xì)胞、 計(jì)數(shù)，IO4個(gè)/孔鋪于96孔板，在37°C含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后加入不同濃度 的藥物，每個(gè)藥物濃度設(shè)3個(gè)平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)，2000rpm/分鐘離心10分鐘，棄上 清。每孔加入50 μ 1無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)液溶解的MTT (2mg/ml)，37°C繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)， 2000rpm/分鐘離心10分鐘，輕輕吸去上清，加入150 μ 1 二甲基亞砜(DMSO)，室溫下?lián)u床振 搖15分鐘，酶標(biāo)儀上測(cè)定560nm光吸收值。每次試驗(yàn)均設(shè)無(wú)藥對(duì)照孔和無(wú)細(xì)胞對(duì)照孔各3 孔。按下述公式計(jì)算細(xì)胞的存活率及半數(shù)抑制濃度(IC5tl)值細(xì)胞存活率=(A加藥組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)X 100%。結(jié)果發(fā)現(xiàn)強(qiáng)化融合蛋白scFv-LDM對(duì)Raji細(xì)胞、Daudi細(xì)胞的IC5tl值分別為 1. 21X 10-"Μ、6· 24X KT11M,對(duì)無(wú)特異性 CD20 抗原的 MCF7 細(xì)胞的 IC50 值為 3. 39 X IO"9 (圖 5b)，均有強(qiáng)烈的殺傷作用，本試驗(yàn)結(jié)果表明Anti-CD20 (scFv) -LDM較好的保留了力達(dá)霉素 的細(xì)胞毒作用，并對(duì)腫瘤細(xì)胞有選擇性殺傷作用。9. IFab-LDM對(duì)早期裸鼠移植性⑶20+B細(xì)胞淋巴瘤模型的治療作用將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的體重為16-18克的5周齡BALB/c裸鼠隨機(jī)分組，經(jīng)Cs照射后， 24h內(nèi)接種于裸鼠腋窩皮下Raji細(xì)胞2X IO7個(gè)/只，飼養(yǎng)7天，尾靜脈注射給藥，9天后再 次注射給藥，觀察Fab-LDM對(duì)裸鼠皮下淋巴瘤的治療作用，繪制小鼠腫瘤的生長(zhǎng)曲線。對(duì) 照組靜脈注射生理鹽水0. 2ml/只。其余各組分別給予不同劑量的強(qiáng)化融合蛋白Fab-LDM、 LDM及4pmol/kg的抗⑶20Fab，均為尾靜脈注射，0. 2ml/只。試驗(yàn)期間，每三天測(cè)量一次腫 瘤的長(zhǎng)徑a和短徑b，并記錄動(dòng)物體重。以公式V = O. 5ab2計(jì)算瘤體積，并計(jì)算抑瘤率(圖 5a)。強(qiáng)化融合蛋白Fab-LDM的治療結(jié)果表明，2pm0l/kg、4pm0l/kg 二個(gè)劑量組的Fab-LDM 均能顯著抑制或延遲裸鼠移植性淋巴瘤的生長(zhǎng)，均表現(xiàn)出比相應(yīng)劑量游離力達(dá)霉素更強(qiáng)的 腫瘤生長(zhǎng)抑制作用，提高了力達(dá)霉素的治療效果。在實(shí)驗(yàn)第39天的結(jié)果顯示，4pmol/kg和 2pmol/kg兩個(gè)劑量組的Fab-LDM的抑瘤率分別為88%和73%，強(qiáng)于相應(yīng)劑量LDM組49% 和69%的抑瘤率。在實(shí)驗(yàn)治療期間，動(dòng)物體重有所增加，一般狀況良好，表明動(dòng)物可耐受所 給劑量。表1. Fab-LDM對(duì)早期裸鼠移植性⑶20+B細(xì)胞淋巴瘤的生長(zhǎng)抑制作用
權(quán)利要求
融合蛋白，其選自下述序列之一(a)由SEQ ID NO1或3所示的氨基酸序列構(gòu)成的氨基酸序列；(b)具有SEQ ID NO1或3所示的氨基酸序列的生物學(xué)功能、且與SEQ ID NO1或者3所示的氨基酸序列具有95％以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成的氨基酸序列；和(c)具有SEQ ID NO1或3所示的氨基酸序列的生物學(xué)功能，且經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的SEQ ID NO1或3所示的氨基酸序列構(gòu)成的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1的融合蛋白，其還功能性地結(jié)合有式(I)所示結(jié)構(gòu)的發(fā)色團(tuán)AE力達(dá)霉素發(fā)色團(tuán)結(jié)構(gòu)式⑴。
3.核酸分子，其編碼權(quán)利要求1的融合蛋白的基因，其選自下述序列之一(a)SEQ ID NO 2所示的編碼SEQ ID NO 1的核苷酸序列；(b)SEQID NO 4所示的編碼SEQ ID NO 3的核苷酸序列；(c)編碼權(quán)利要求1中(b)的氨基酸序列的核苷酸序列；(d)編碼權(quán)利要求1中(c)的氨基酸序列的核苷酸序列；和(e)因?yàn)槊艽a子簡(jiǎn)并性而分別與SEQID NO :2和4不同、但是編碼與SEQ ID NO :2或 4所示序列相同的氨基酸序列的核苷酸序列。
4.載體，其可操作地連接有權(quán)利要求3所述的核酸分子。
5.權(quán)利要求4的載體，所述載體是質(zhì)粒。
6.宿主菌，其包含權(quán)利要求4所述的載體。
7.權(quán)利要求6的宿主菌，其是保藏號(hào)為CGMCCNo. 3125，于2009年06月17日送交中 國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心保藏的名為IHPAYZ的大腸埃希氏菌。
8.權(quán)利要求6的宿主菌，其是保藏號(hào)為CGMCCNo. 3100，于2009年06月17日送交中 國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心保藏的名為IMBPAYZ的大腸埃希氏菌。
9.制備權(quán)利要求2的融合蛋白的方法，包括以下步驟(a)將抗CD20抗體的Fab基因與力達(dá)霉素輔基蛋白LDP基因可操作地連接到質(zhì)粒 pCANTAB 5E中，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pCANTAB5E_Fab_LDP，或者將抗CD20抗體的可變區(qū)單鏈 scFv基因與力達(dá)霉素輔基蛋白LDP基因可操作地連接到質(zhì)粒pCANTAB 5E中，得到重組表達(dá) 質(zhì)粒 pCANTAB 5E-scFv-LDP,(b)在大腸桿菌HB2151中的誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白Fab-LDP、scFv-LDP，(C)純化及其復(fù)性步驟(b)中獲得的融合蛋白，(d)使步驟(c)中獲得的融合蛋白與式(I)的發(fā)色團(tuán)組裝，(e)任選地，其還包括測(cè)定步驟(d)中組裝后的融合蛋白的生物學(xué)活性的步驟。
10.藥物組合物，其中含有藥學(xué)有效量的權(quán)利要求1或者2所述的融合蛋白，任選地，還 含有藥學(xué)上允許的佐劑。
11.權(quán)利要求1或者2的融合蛋白在制備用于腫瘤靶向治療的藥物中的用途。
12.權(quán)利要求11的用途，所述藥物用于靶向殺傷淋巴瘤細(xì)胞。
13.權(quán)利要求11的用途，其中的淋巴瘤是裸鼠淋巴瘤或者人B細(xì)胞淋巴瘤。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗癌藥物力達(dá)霉素的強(qiáng)化融合蛋白Anti-CD20(scFv)-LDM及Anti-CD20(Fab)-LDM、其編碼基因；還涉及所述強(qiáng)化融合蛋白的基因工程構(gòu)建方法和所述強(qiáng)化融合蛋白的用途。申請(qǐng)人通過(guò)提供上述強(qiáng)化融合蛋白，提供了具有良好靶向性的抗腫瘤藥物。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101967192SQ200910157388
公開日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2009年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月28日
發(fā)明者張勝華, 房虹, 朱禎平, 楊純正, 熊冬生, 甄永蘇, 程昕, 苗慶芳, 許元富, 邵榮光, 金蓮舫, 高瀛岱 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所;中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所