專利名稱：一種抗vegf的單克隆抗體及含有該抗體的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程抗體技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及與血管內(nèi)皮生長因子VEGF特異性 結(jié)合的基因工程抗體，本發(fā)明還提供含有該抗體的藥物組合物和試劑盒。
背景技術(shù)：
血管內(nèi)皮生長因子，vascularendothelial growth factor，簡稱 VEGF，是血管內(nèi) 皮細(xì)胞特異性的肝素結(jié)合生長因子(h印arin-binding growth factor)，可在體內(nèi)誘導(dǎo)血 管新生。人的VEGF蛋白于1989年由美國的科學(xué)家成功純化與鑒定，并克隆與測定了其基 因序列。血管內(nèi)皮生長因子具有促進(jìn)血管生成的作用。所有VEGF家族的成員都能通過結(jié) 合細(xì)胞表面的相應(yīng)受體(VEGFRs)來激活細(xì)胞反應(yīng)，通過磷酸作用從而二聚化并活化。血管 內(nèi)皮生長因子受體含有7個免疫球蛋白樣的胞外結(jié)構(gòu)域，一個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個含酪氨酸 激酶域的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。血管內(nèi)皮生長因子A能與血管內(nèi)皮生長因子受體1(受體Flt-I)和 血管內(nèi)皮生長因子受體-2(KDR/Flk-1)結(jié)合。血管內(nèi)皮生長因子受體_2幾乎介導(dǎo)了 VEGF 所有已知的細(xì)胞反應(yīng)。血管內(nèi)皮生長因子，它的生物活性和它的受體已經(jīng)被Mat sumo tο 等人和Marti等人詳細(xì)闡述和研究(參見Angiogenesis in ischemic disease. Thromb Haemost. 1999Suppl 1 44-52 ；VEGF receptor signal transduction Sci STKE. 2001 RE21)。VEGF是高度保守的同源二聚體糖蛋白，由兩條分子量各為24kDa的單鏈以二硫鍵 組成二聚體。由于mRNA不同的剪切方式，分別產(chǎn)生出VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF185、 VEGF206等至少5種蛋白形式，其中VEGF121、VEGF145、VEGF165是分泌型可溶性蛋白，能直 接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，增加血管通透性。VEGF相關(guān)疾病通常的特征為過度的血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、血管通透性增加、組 織水腫和炎癥如由損傷、中風(fēng)或腫瘤引起的腦水腫；炎癥疾病引起的水腫，如銀屑病或關(guān)節(jié) 炎，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；哮喘；燒傷相關(guān)的普遍性水腫；腫瘤、炎癥或外傷引起的腹水和 胸腔積液；慢性氣管炎；毛細(xì)血管漏綜合癥；敗血??；蛋白質(zhì)滲漏相關(guān)的腎臟疾病；眼部疾 病，如老年性黃斑變性和糖尿病性視網(wǎng)膜病變；腫瘤，包括乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、腦膠質(zhì) 瘤和腎癌等?？贵w與其靶點(diǎn)的結(jié)合是特異性的，能夠起到介導(dǎo)免疫效應(yīng)機(jī)制的作用，并且在血 清中具有較長的半衰期。這些特性使抗體具有很強(qiáng)的治療應(yīng)用。目前，F(xiàn)DA和歐洲已批準(zhǔn)了重組人源化鼠抗VEGF單克隆抗體AVASTIN用于治療結(jié) 直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤、腎癌和老年性黃斑變性(AMD)，2008年的銷售額 達(dá)到48億美元。但是AVASTIN抗體對VEGF親和力不高，另外由于獨(dú)家生產(chǎn)，病人需要花費(fèi) 高額的費(fèi)用，目前一個病人用藥一年的費(fèi)用約在5萬至10萬美元。所以，研發(fā)新的抗VEGF 單克隆抗體，從而減少病人負(fù)擔(dān)，降低治療費(fèi)用是一個亟待解決的問題。定義
在進(jìn)一步闡述本發(fā)明之前，我們有必要認(rèn)識到，本發(fā)明并不局限于描述的特定的 實施方案，也就是說，在具體形式上可能存在著變化。還有一點(diǎn)需要提醒的是，由于本發(fā)明 的范圍受附加的權(quán)利要求書的限制，因此，本文使用的術(shù)語只是為了描述特定實施方案的 目的，而不是為了限制本發(fā)明的目的。術(shù)語“抗體”和“免疫球蛋白”在本文中可以互換使用。這些術(shù)語均為本領(lǐng)域技術(shù) 人員所熟知的術(shù)語，具體是指由能特異結(jié)合抗原的一種或多種多肽構(gòu)成的蛋白質(zhì)?？贵w的 一種形式構(gòu)成了抗體的基本結(jié)構(gòu)單元。這種形式是四聚物，它由兩對完全相同的抗體鏈構(gòu) 成，每一對都有一個輕鏈和一個重鏈。在每對抗體鏈中，輕鏈和重鏈的可變區(qū)聯(lián)合在一起共 同負(fù)責(zé)結(jié)合抗原，而恒定區(qū)則負(fù)責(zé)抗體的效應(yīng)器功能。目前已知的免疫球蛋白多肽包括K和λ輕鏈，以及α，γ (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), δ，ε和μ重鏈或它們的其它類型等價物。全長的免疫球蛋白“輕鏈”(大約25kDa 或大約214個氨基酸)包含一個由NH2-末端上大約110個氨基酸形成的可變區(qū)，以及一個 COOH-末端上的κ或λ恒定區(qū)。全長的免疫球蛋白“重鏈”(大約50kDa或大約446個氨 基酸)，同樣包含一個可變區(qū)(大約116個氨基酸)，以及重鏈恒定區(qū)之一，例如Y (大約 330個氨基酸)。術(shù)語“抗體”和“免疫球蛋白，，包括任何同型體的抗體或免疫球蛋白，或保持與抗 原特異結(jié)合的抗體片段，包括但不限于Fab，F(xiàn)v, scFv和Fd片段、嵌合抗體、人源化抗體、單 鏈抗體以及包含抗體的抗原結(jié)合部分和非抗體蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)?？贵w可以被標(biāo)記和檢 測，例如，可以通過放射性同位素、能產(chǎn)生可檢測物的酶、熒光蛋白質(zhì)、生物素等等進(jìn)行標(biāo)記 并被檢測?？贵w還可以結(jié)合于固相載體，包括但不限于聚苯乙烯平板或珠粒等等。該術(shù)語 還包括Fab’、Fv、F(ab’)2和/或其它能與抗原特異性結(jié)合的抗體片段和單克隆抗體。抗體還可以以多種形式存在，例如包括Fv、Fab和(Fab' )2，以及雙功能雜合抗 體(例如文獻(xiàn)，Lanzavecchia等，Eur. J. Immunol.，1987 ；17，105)以及以單鏈形式(例如， Huston 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.，1988 ；85，5879 和 Bird 等，Science, 1988 ；242， 423，在此引用作為參考)存在。免疫球蛋白的重鏈或輕鏈可變區(qū)由三個超變區(qū)(也稱為“互 補(bǔ)決定區(qū)”或CDR)組成，這些超變區(qū)被框架區(qū)(FR)間隔?？蚣軈^(qū)和互補(bǔ)決定區(qū)的范圍已被 精石角定義(參見"Sequences of Proteins of Immunological Interest, " E. Kabat 等， U. S. Department of Health and Human Services, 1991)。此處所討論的所有抗體氨基酸 序列的排序都參照Kabat系統(tǒng)。同一物種不同的輕鏈和重鏈框架區(qū)序列相對保守?？贵w的 框架區(qū)用于定位和校準(zhǔn)CDR。CDR主要負(fù)責(zé)結(jié)合抗原的表位。嵌合抗體是其重鏈和輕鏈基因經(jīng)過構(gòu)建的抗體，特別是利用基因工程改造的屬于 不同物種的抗體可變區(qū)和恒定區(qū)基因。例如，可以將鼠單克隆抗體基因的可變區(qū)片段連接 到人抗體恒定區(qū)片段如Yl和Y3。例如治療用嵌合抗體是一種嵌合蛋白質(zhì)，它由來源于兔 抗體可變區(qū)片段或抗原結(jié)合區(qū)片段和人抗體恒定區(qū)或效應(yīng)區(qū)結(jié)合(如由A.T.C.C.保藏登 記號CRL 9688的細(xì)胞制備的抗Tac嵌合抗體)，當(dāng)然，嵌合抗體的基因來源也可以使用其它 哺乳動物物種。術(shù)語“人源化抗體，，與“人源化免疫球蛋白”含義相同，通常人源化抗體與同一種 抗體的非人源化形式相比，會降低在人宿主中產(chǎn)生的免疫反應(yīng)?？梢岳斫獗景l(fā)明設(shè)計和生產(chǎn)的人源化抗體可能會替代某些保守性氨基酸，這些氨
4基酸對抗原結(jié)合或抗體其他功能基本上沒有影響。換而言之，gly和ala ；val.ile和Ieu ； asp和glu ；asn和gin ；ser和thr ；Iys和arg ；phe和tyr，以上各組合內(nèi)部的氨基酸可相 互取代。未存在于同一組中的氨基酸屬于“基本上不同的”氨基酸。在某些實施方案中，抗體與其靶點(diǎn)之間的親和力用Kd(解離常數(shù))來表征，它低于 1(Γ6Μ、1(Γ7Μ、1(Γ8Μ、1(Γ9Μ、1(Γ10Μ、IiT11M 或者約 ICT12M 或更低?？贵w重鏈或輕鏈的“可變區(qū)”是該鏈的N端成熟區(qū)域。所有區(qū)域、CDR和殘基 編號均以序列比對、按已有的結(jié)構(gòu)知識為基礎(chǔ)進(jìn)行定義?？蚣軈^(qū)和CDR殘基的鑒定和編 號按 Chothia 禾口^也人所述(Chothia, Structural determinants in the sequences of immunoglobulin variable domain. J Mol Biol. 1998 ;278，457)。VH是抗體重鏈的可變區(qū)。VL是抗體輕鏈的可變區(qū)，它可能具有κ和λ同種型。 K-I抗體具有K -1同種型而Κ-2抗體具有K -2同種型，V λ是可變的λ輕鏈。術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可以互換使用，它們都是指任何長度的聚合形 式的氨基酸，可以包括編碼和非編碼的氨基酸、通過化學(xué)或生物化學(xué)修飾或衍生的氨基酸 以及具有修飾肽骨架的多肽。該術(shù)語包括融合蛋白，包括但不限于具有異源氨基酸序列的 融合蛋白；具有異源和同源前導(dǎo)序列，帶有或不帶有N-末端甲硫氨酸殘基的融合蛋白；帶 有免疫標(biāo)簽的蛋白；帶有可檢測融合伴侶的融合蛋白，例如包括熒光蛋白質(zhì)、半乳糖苷 酶、熒光素等等作為融合伴侶的融合蛋白等等。多肽可以具有任何大小，術(shù)語“肽”是指長 度為8-50個殘基(如8-20個殘基)的多肽。術(shù)語“受試者”、“宿主”、“患者”以及“個體”在本文中可以交替使用，具體是指接 受診斷或治療的任何哺乳動物，尤其是指人類。其它對象可能包括猴、牛、狗、貓、豚鼠、兔、 大鼠、小鼠和馬等?！跋鄳?yīng)的氨基酸”，是指當(dāng)兩個或多個氨基酸序列比對時，位于相同位置(也就是 它們彼此對應(yīng))的氨基酸殘基?？贵w序列比對和編號的方法在Chothia，見上，Kabat，見 上和其他中得到詳盡闡述。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知(參見如Kabat 1991Sequences of Proteins of Immunological Interest，DHHS，Washington，DC)，有時可以在抗體的一個或 兩個氨基酸中制造一個、兩個或三個缺口和/或插入1、2、3或4個殘基或者至多約15個殘 基(特別是在L3和H3⑶R中)，從而完成一次比對?！翱扇〈恢谩?，指的是抗體的一個特殊位置，其可以被不同的氨基酸取代而不會 使抗體的結(jié)合活性顯著降低。鑒定可取代位置的方法和它們可以被如何取代在下面將進(jìn)行 更加詳細(xì)的描述?？扇〈恢靡部梢苑Q為“變異耐受位置”?！坝H本”抗體是指作為氨基酸取代的靶抗體。在某些實施方案中，“供體”抗體會將 氨基酸“贈捐”給親本抗體以生成改變的抗體?！跋嚓P(guān)抗體”是指具有相似序列并且由具有 共同B細(xì)胞祖先的細(xì)胞產(chǎn)生的抗體。這種B細(xì)胞祖先含有具有重排輕鏈VJC區(qū)和重排重鏈 VDJC區(qū)基因組，并且產(chǎn)生還未經(jīng)歷親和力成熟的抗體。存在于脾臟組織中的“純真”或“原 始”B細(xì)胞是B細(xì)胞的共同祖先。相關(guān)抗體與相同的抗原表位結(jié)合通常在序列上極為相似， 特別是它們的L3和H3CDR。相關(guān)抗體的H3和L3CDR都具有相同的長度和近乎一致的序列 (有0-4個氨基酸殘基不同)。相關(guān)抗體通過共同抗體祖先，即原初B細(xì)胞祖先產(chǎn)生的抗體 相關(guān)聯(lián)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種對VEGF親和力更高的單克隆抗體。本發(fā)明所述VEGF單 克隆抗體，其重鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO. USEQ IDN0. 2和SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列， 和/或其輕鏈可變區(qū)含有SEQID NO. 4、SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示的氨基酸序列。本發(fā)明所述“抗體”應(yīng)該解釋為涵蓋具有所需特異性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任意特異性 結(jié)合因子。因而，這個術(shù)語涵蓋了與之同源的抗體片段、衍生物、人源化抗體以及抗體的功 能等同物和同源物，也包括含有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽，無論是天然的還是合成產(chǎn)生 的?？贵w的實例是免疫球蛋白亞型(如IgG，IgE, IgM, IgD和IgA)及其亞型亞類；也可以 是包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的片段如？油、8沖^ 1(^13 4(1;和雙鏈抗體(diabodies)。融合至 另一多肽的、包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合體分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗體的克 隆與表達(dá)在EP. A-0120694和EP. A. 0125023中描述。本發(fā)明所述單克隆抗體可以是，例如，單價的或是單鏈抗體、雙鏈抗體、嵌合抗體、 人源化抗體、以及上述抗體的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗體片段和含有抗原結(jié) 合結(jié)構(gòu)域的任何多肽。抗體可以通過許多方式修飾，可用DNA重組技術(shù)來產(chǎn)生保留原來抗體特異性的其 它抗體或嵌合分子。這種技術(shù)可以包括將編碼抗體的免疫球蛋白可變區(qū)或互補(bǔ)性決定區(qū) (CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定區(qū)或恒定區(qū)加框架區(qū)。參見，EP. A. 184187，GB 2188638A或.EP. A. 239400。還可以對雜交瘤細(xì)胞或產(chǎn)生抗體的其它細(xì)胞進(jìn)行遺傳突變或 其它改變，這可以改變或者不改變所產(chǎn)生抗體的結(jié)合特異性。本發(fā)明所述單克隆抗體除了重鏈和輕鏈中的高度可變區(qū)⑶R1、⑶R2和⑶R3和連 接序列外，其它為框架區(qū)。框架區(qū)可在結(jié)合所需的三維結(jié)構(gòu)不受影響的條件下被其他序列 置換，抗體特異性的分子基礎(chǔ)主要來自于它的高度可變區(qū)⑶R1、⑶R2和⑶R3，這些區(qū)域是 與抗原結(jié)合的關(guān)鍵部位。為維持優(yōu)選的結(jié)合特性，CDR的序列應(yīng)盡可能保留，然而，可能需 要一些氨基酸改變使結(jié)合特性最優(yōu)化，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以用標(biāo)準(zhǔn)做法來達(dá)到此目的。在某些優(yōu)選例中，一個單克隆抗體包含如下內(nèi)容的可變區(qū)一個包含了如SEQ ID N0. 7 的重鏈可變區(qū)，其含有 CDRl (SNNDVMCW ；SEQ ID NO. 1)，CDR2 (GCIMTTDVVTEYANWAKS ； SEQ ID N0. 2)和 CDR3(RDSVGSPLMSFDLW ;SEQ ID NO. 3)；和一個包含了如 SEQ IDN0. 8 的 輕鏈可變區(qū)，其 CDRl (QASQSIYNNNELS ；SEQ ID N0. 4)，CDR2 (RASTLAS ；SEQ ID N0. 5)，和 CDR3 (GGYKSYSNDGNG ； SEQID N0. 6)?？勺儏^(qū)⑶R的變體與上述⑶R區(qū)除了有至多6個氨基酸取代的不同外基本上是一 致的(例如，1、2、3、4或5個氨基酸取代)，在該單克隆抗體的CDR區(qū)具有與VEGF結(jié)合活性。在其它實施方案中，抗體可包含a) —個重鏈可變區(qū)，其氨基酸序列與SEQ ID N0. 7相比有至多6個氨基酸序列取代的不同，例如1、2、3、4、5、或6個取代；和b) —個輕鏈 可變區(qū)，其氨基酸序列與SEQ ID N0. 8相比有至多6個氨基酸序列取代的不同，例如1、2、3、 4、5、或6個氨基酸取代。目標(biāo)抗體可能包含這些取代中的任何一個或其組合。擁有這些取代位置中任一個的抗體和擁有所有取代位置的抗體同樣具有結(jié)合 VEGF的活性。氨基酸取代可同時存在于框架區(qū)和CDR區(qū)，或單獨(dú)出現(xiàn)在框架區(qū)或CDR區(qū)。 因此，在某些優(yōu)選例中，重鏈可變區(qū)的框架區(qū)的氨基酸序列與SEQ ID N0. 7相比可能有最多 6個氨基酸序列取代的不同，例如1、2、3、4、5、或6個取代，和輕鏈可變區(qū)的框架區(qū)的氨基酸序列與SEQ ID NO. 8相比可能有最多6個氨基酸序列取代的不同，例如1、2、3、4、5、或6個 取代。在一些抗體中，氨基酸取代可能分布在多個⑶R區(qū)。因此，重鏈可變區(qū)的多個⑶R 區(qū)的氨基酸序列與SEQ ID NO. 7相比可能有至多6個氨基酸序列取代的不同，例如1、2、3、 4、5、或6個取代，和輕鏈可變區(qū)的多個⑶R區(qū)的氨基酸序列與SEQ ID NO. 8相比可能有至 多6個氨基酸序列取代的不同，例如1、2、3、4、5、或6個取代。在特殊的優(yōu)選例中，抗體可能包含a) —個重鏈可變區(qū)，其氨基酸序列與SEQ ID NO. 7 一致和b) —個輕鏈可變區(qū)，其氨基酸序列與SEQID NO. 8 一致。在特殊的優(yōu)選例中，抗體可能包含a) —個重鏈可變區(qū)，其氨基酸序列與SEQ ID N0. 7至少有95%的一致性和b)—個輕鏈可變區(qū)，其氨基酸序列與SEQ ID N0. 8至少有95% 的一致性。因此，目標(biāo)抗體可能包含a) —個重鏈可變區(qū)，其氨基酸序列與SEQ ID N0. 7至 少有約95 %、96 %、97 %、98 %、99 %或100 %的一致性和b) —個輕鏈可變區(qū)，其氨基酸序列 與 SEQ ID N0. 8 至少有約 95%、96%、97%、98%、99%或 100% 的一致性。在特殊的優(yōu)選例中，抗體可能包含a) —個重鏈，其氨基酸序列與SEQ ID N0. 9 一 致和b) —個輕鏈，其氨基酸序列與SEQ ID NO. 10—致。在特殊的優(yōu)選例中，抗體可能包含a) —個重鏈，其氨基酸序列與SEQ ID N0. 9至 少有95%的一致性和b) —個輕鏈，其氨基酸序列與SEQID NO. 10至少有95%的一致性。 因此，目標(biāo)抗體可能包含a) —個重鏈，其氨基酸序列與SEQ ID N0. 9至少有約95%、96%、 97%、98%、99%或100%的一致性和b) —個輕鏈，其氨基酸序列與SEQ ID NO. 10至少有約 95 %、96 %、97 %、98 %、99 %或100 %的一致性。除了上面所描述的氨基酸取代，目標(biāo)抗體可 能在重鏈或輕鏈的兩端有附加的氨基酸。例如，目標(biāo)抗體在重鏈和/或輕鏈的C或N末端 分別可能包含至少1、2、3、4、5或6或更多的附加氨基酸。在某些實施例中，目標(biāo)抗體可能 比這里所描述的示范性氨基酸短，其主要區(qū)別為在重鏈和輕鏈的兩端分別比示范性氨基酸 少1、2、3、4、5或6個氨基酸。目標(biāo)抗體可能是人源化的。一般而言，人源化抗體是通過在親本抗體的框架區(qū)進(jìn) 行氨基酸取代而產(chǎn)生修飾的抗體，并且人源化的抗體與親本抗體相比具有較小的免疫源 性?？贵w可通過本領(lǐng)域熟知的很多技術(shù)進(jìn)行人源化，包括，例如，⑶R移植(EP. A-239，400 ； PCT 公開文本 WO 91/09967 ；U. S. Pat. No. 5，225，539 ；5，530, 101 ；和 5，585，089)，和鏈替換 (U. S. Pat. No. 5，565，332)。在某些優(yōu)選例中，框架替換是通過模擬⑶R和框架殘基的相互 作用來確認(rèn)框架殘基對于抗原結(jié)合的重要性和通過序列比對確認(rèn)特殊位點(diǎn)的非尋?？蚣?殘基。(見，例如，U. S. Pat. No. 5，585，089 ;Riechmann et al. , Nature, 1988 ；332, 323) 抗體的人源化方法的具體細(xì)節(jié)可參照美國專利申請10/984，473，即在2004年11月8日提 交，標(biāo)題為“Methods for antibody engineering”，該申請已經(jīng)全部引入本文作為參考。一 般而言，這種人源化的方法包括通過比對能夠結(jié)合相同抗原的抗體的序列來確定合適的位 點(diǎn)，并且用相似氨基酸位于相同位點(diǎn)的不同氨基酸來取代該位點(diǎn)的氨基酸。在這些方法中， 將親本抗體的氨基酸序列與其它相關(guān)的抗體進(jìn)行比較(例如，序列比對)，從而識別變異耐 受位置。親本抗體可變區(qū)的氨基酸序列通常與人類抗體數(shù)據(jù)庫中的氨基酸序列進(jìn)行比較， 并且選出這種與親本抗體具有相似的氨基酸序列的人源化抗體。將親本抗體和人源化抗體 的序列進(jìn)行比較(例如，序列比對)，親本抗體中一個或多個變異耐受位置上的氨基酸被人源抗體中相應(yīng)位置上的氨基酸所取代。上面所討論的變異耐受位置的取代方法已很容易地與任何已知的人源化方法結(jié) 合，并且也很容易地應(yīng)用于生產(chǎn)包含CDR區(qū)的人源化抗體，該抗體的CDR區(qū)是在忠實于親本 抗體的CDR區(qū)的基礎(chǔ)上進(jìn)行修改的。因此，本發(fā)明還提供了包含從親本抗體改變版本的多 個⑶R區(qū)的人源化VEGF中和抗體。本發(fā)明所論述的人源化兔源抗VEGF單克隆抗體比現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)物AVASTIN與VEGF 的解離常數(shù)Kd要低(本發(fā)明的單克隆抗體Kd為0. 485nM, AVASTIN為47. 9nM)，本發(fā)明的 單克隆抗體與VEGF的親和力更高，表明本發(fā)明對VEGF有更強(qiáng)的抑制作用。在小鼠模型試 驗上顯示本發(fā)明所述抗體抑瘤率明顯高于AVASTIN(見實施例5)，所以，理論上本發(fā)明的潛 在臨床療效要高于AVASTIN。在一個實施例中，本發(fā)明所述單克隆抗體由保藏編號為CGMCCNo. 3233的細(xì)胞株 產(chǎn)生，其重鏈氨基酸序列如SEQ ID NO. 9所示，輕鏈如SEQ ID NO. 10所示的，其與VEGF解 離常數(shù)為0. 485nM，是AVASTIN的1/100，說明EPI0030與VEGF的結(jié)合能力強(qiáng)于AVASTIN。本發(fā)明還提供一種細(xì)胞株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心，保藏編號為CGMCC No. 3233。其產(chǎn)生一種單克隆抗體，所述抗體重鏈氨基酸序列如SEQ ID N0.9所示，輕鏈如SEQ IDN0. 10所示，在本發(fā)明的實施例中，命名為EPI0030抗體，細(xì)胞 試驗及動物體內(nèi)試驗證明，可在體外抑制VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，并且可在動物 體內(nèi)抑制腫瘤生長，可用于治療VEGF相關(guān)性疾病。本發(fā)明還提供所述的單克隆抗體在制備用于治療VEGF相關(guān)性疾病藥物中的用 途。所述VEGF相關(guān)性疾病包括腫瘤、老年性黃斑變性、神經(jīng)退行性疾病、肥胖、糖尿病。該目 標(biāo)抗體可以用于與VEGF相關(guān)的科學(xué)研究，如發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、代謝、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、 功能基因組學(xué)等多個領(lǐng)域的科學(xué)研究、或腫瘤、老年性黃斑變性(AMD)、神經(jīng)退行性疾病、肥 胖、糖尿病等醫(yī)學(xué)和藥學(xué)的應(yīng)用研究。本發(fā)明還提供一種藥物組合物，其特征在于，含有有效量的上述的單克隆抗體及 藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明還提供一種試劑、試劑盒或芯片，包含上述的單克隆抗體。本發(fā)明還提供了使用目標(biāo)抗體來抑制VEGF活性的方法，以及使用目標(biāo)抗體用于 治療VEGF相關(guān)性疾病或使用含有該抗體的試劑盒進(jìn)行VEGF相關(guān)診斷與檢測。一旦制得本發(fā)明的抗體分子，就可以通過本領(lǐng)域已知的純化免疫球蛋白分子的任 何方法對其進(jìn)行純化，例如，通過色譜法(例如，離子交換色譜，親和色譜，特別是通過蛋白 A對特異性抗原的親和色譜和其它柱色譜)、離心、利用溶解度差異，或通過任何其它純化 蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。在許多實施方案中，抗體從細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基中，通過收集培養(yǎng)基并進(jìn) 行純化得到抗體?？贵w可以通過許多方式修飾，可用DNA重組技術(shù)來產(chǎn)生保留原來抗體特異性的 其它抗體或嵌合分子。這種技術(shù)可以包括將編碼抗體的免疫球蛋白可變區(qū)或互補(bǔ)決定區(qū) (⑶Rs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定區(qū)或恒定區(qū)加框架區(qū)。參見，EP.A-184187，GB 2188638A或EP. A-239400。還可以對雜交瘤細(xì)胞或產(chǎn)生抗體的其它細(xì)胞進(jìn)行遺傳突變或其 它改變，這可以改變或者不改變所產(chǎn)生抗體的結(jié)合特異性。用于本發(fā)明的單克隆抗體也可用雜交瘤方法制得，因為編碼本發(fā)明人源化抗體的
8DNA序列可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)手段，如根據(jù)本發(fā)明公開的氨基酸序列人工合成 或用PCR法擴(kuò)增得到，因而也可用重組DNA方法，可用本領(lǐng)域熟知的各種方法將該序列連入 合適的表達(dá)載體中。最后，在適合本發(fā)明抗體表達(dá)的條件下，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化所得的宿主細(xì)胞，然 后本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)用熟知的常規(guī)分離純化手段純化得到本發(fā)明的單克隆抗體。如上所述，本發(fā)明還提供了用于實施本發(fā)明抗體的試劑、試劑盒或芯片。試劑、試 劑盒或芯片至少包括如下一種或多種根據(jù)以上方法制成的抗體，編碼該抗體的核苷酸，或 包含該抗體的真核細(xì)胞、原核細(xì)胞和病毒?？梢詫贵w進(jìn)行人源化。試劑、試劑盒或芯片的其它任選組分包括限制性內(nèi)切酶、引物和質(zhì)粒、緩沖液等， 用于進(jìn)行檢測抗體活性的實驗。該試劑、試劑盒或芯片的核酸還可以具有限制性酶切位點(diǎn)、 多克隆位點(diǎn)、引物位點(diǎn)等等，以利于它們與非兔抗體核酸的連接。該試劑、試劑盒或芯片的 各組分可以單獨(dú)存在于分開的容器中，也可以根據(jù)需要，把某些相容的組分預(yù)先組裝到單 一的容器中。制備目標(biāo)抗體時可加入藥學(xué)上可接受的載體。術(shù)語"藥學(xué)上可接受載體"是指一 種或多種有機(jī)或無機(jī)成分，它可以是天然的或合成的，與抗體組合后可促進(jìn)其應(yīng)用?？山邮?的載體包括無菌的生理鹽水或是其它藥學(xué)上可獲得的且為本領(lǐng)域所熟知的水或非水的等 滲溶液和滅菌混懸劑。“有效劑量”是指能夠改善或延緩病態(tài)的、退變的或損壞的狀況的進(jìn) 程的劑量。有效劑量定義在個人基礎(chǔ)之上，并且將以此為基礎(chǔ)，具體來說即考慮治療癥狀和 尋找結(jié)果。有效劑量可通過本領(lǐng)域的一種普通技術(shù)來決定，并且使用的這些因素將不會超 過常規(guī)實驗。


圖1示HZD-V 1、HZD-V2、HZD-V5、HZD-V6克隆表達(dá)的重組抗體競爭性抑制VEGF與 KDR結(jié)合；圖2示SDS-PAGE測定HZD-V6克隆表達(dá)EPI0030抗體的純度；泳道1為還原電泳；泳道2為分子量標(biāo)準(zhǔn)-從上至下依次為170kD、130kD、100kD、70kD、55kD、40kD、 35kD、25kD、15kD 和 IOkD ；泳道3為非還原電泳；圖3為HZD-V6克隆表達(dá)EPI0030抗體的純度的SEC-HPLC分析圖；圖4示VEGF直接鋪板結(jié)合法測定抗體與人VEGF的結(jié)合活力；圖 5 示 EPI0030、AVASTIN 抑制 VEGF 與 KDR 結(jié)合的 IC5tl 測定；EPI0030 的 IC50 = 166. 3ng/ml, AVASTIN 的 IC50 = 253. 7ng/ml。圖6示5mg/kg的EPI0030和AVASTIN對HCT-116腫瘤生長的影響；圖7示5mg/kg的EPI0030和AVASTIN對NCI-H460腫瘤生長的影響；圖8示1. 5mg/kg的EPI0030對NCI-H460腫瘤生長的影響。生物材料保藏說明保藏編號為CGMCC No. 3233的細(xì)胞株于2009年8月20日保藏在中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)大屯路，分類命名為中國倉鼠卵巢 細(xì)胞。
9
具體實施例方式實施例1 制備表達(dá)抗人VEGF165兔單抗的雜交瘤細(xì)胞及其基因克隆通過雜交瘤細(xì)胞技術(shù)制備兔單克隆抗體。有關(guān)實驗方案參見USPatent: 7，429，487，特別是 Example 1-4。首先通過重組技術(shù)制備IgG Fc-hVEGF-A (Human VEGF 165)融合蛋白，其中IgG Fc 序列為兔源。將IgG Fc-hVEGF-A的DNA序列克隆入pTT5質(zhì)粒，瞬時轉(zhuǎn)染該質(zhì)粒進(jìn)入HEK 293-6Ε細(xì)胞株，無血清培養(yǎng)細(xì)胞，收集培養(yǎng)上清液，用Protein A柱純化瞬時表達(dá)的IgG Fc-hVEGF-A融合蛋白。用純化的IgG Fc-hVEGF-A(作為抗原組分)與完全弗氏佐劑混合進(jìn)行皮下多點(diǎn)注 射，對新西蘭白兔(New Zealand rabbits)進(jìn)行首次免疫，此后每三周1次用純化蛋白和不 完全弗氏佐劑混合后皮下注射對兔進(jìn)行加強(qiáng)免疫，在取脾臟前4天用抗原加PBS對兔靜脈 注射進(jìn)行最終免疫。根據(jù)美國專利US7429487的方法，將兔脾細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞來源相同的永生化 HRGTP-的B淋巴細(xì)胞240E-W2細(xì)胞按2 1比例融合，在96孔板中以HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)，然 后進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞篩選，所得細(xì)胞克隆進(jìn)入新的IgG Fc-hVEGF-A結(jié)合篩選。鑒定篩選過程分為2個陽性克隆篩選步驟①將IgG Fc-hVEGF-A抗原固定化于 96孔酶聯(lián)免疫吸附板上，加入克隆表達(dá)上清孵育Ih后，用PBS洗滌3次，使用酶標(biāo)記的抗 體鑒定具有IgG Fc-hVEGF-A結(jié)合活性細(xì)胞克隆上清，從而獲得可與IgG Fc-hVEGF-A直接 結(jié)合的陽性克隆。②隨后將步驟①中的陽性克隆轉(zhuǎn)移入24孔板培養(yǎng)，以獲得更多的表達(dá) 產(chǎn)物。將IgG FC-VEGFR2 (KDR/Flk-Ι)胞外區(qū)固定化于96孔酶聯(lián)免疫吸附板上，加入IgG Fc-hVEGF-A和克隆表達(dá)產(chǎn)物共同孵育lh，再用PBS洗滌3次，使用酶標(biāo)記的抗體檢測IgG Fc-hVEGF-A的含量，以鑒定克隆對VEGF-VEGFR2結(jié)合活性的抑制作用，從而鑒別出能夠阻 斷VEGF-VEGFR2結(jié)合的陽性克隆。將所篩選的陽性克隆的雜交瘤細(xì)胞裂解，提取mRNA后逆轉(zhuǎn)錄得cDNA。以此cDNA 為模板，采用PCR方法分別擴(kuò)增出兔IgG抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)核酸序列，對重鏈可變 區(qū)、輕鏈可變區(qū)進(jìn)行分析，其編碼的重鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO. 1的親本序列(Ser Asn Asn Asp Val Met Cys Trp) ,SEQ ID NO. 2 的親本序列(Gly Cys lie Met Thr ThrAsp Val ValThr Glu Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Ser)和 SEQ ID NO. 3 的親本序列(Arg Asp Ser Val Gly Ser Pro Leu Met Ser Phe Asp Leu Trp)、輕鏈可變區(qū)含有 SEQ ID N0. 4 的親本 序列(Gin Ala Ser Gln Ser Val Tyr Gly Asn Asn Glu Leu Ser)、SEQ ID N0. 5 的親本 序列(Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser)和 SEQID N0. 6 的親本序列(Gly Gly Tyr Lys Ser Tyr Ser Asn Asp Gly Asn Gly)。輕鏈核酸序列被克隆入pTT5質(zhì)粒。重鏈可變區(qū)核酸序 列被克隆入已有重鏈恒定區(qū)的ΡΤΤ5質(zhì)粒。共轉(zhuǎn)染輕、重鏈質(zhì)粒至HEK 293-6Ε細(xì)胞株，培養(yǎng) 5天后，用Protein A純化上清，最終獲得重組表達(dá)的兔抗人VEGF165單克隆抗體。采用上 述陽性克隆篩選方法，對表達(dá)的重組抗體進(jìn)行親和力確認(rèn)。實施例2 本發(fā)明所述人源化兔抗VEGF單抗的制備人源化技術(shù)參見美國專利US 7，462，697，特別是優(yōu)化實施方式的詳細(xì)描述部分 (DETAILED DESCRIPTION OF PREFERREDEMBODIMENTS)。
采用美國專利US7，462，697所描述的技術(shù)，用人序列VKI-2-1-(U)-A20JK4和 VH3-1-3-3-21JH4作為參比序列。表達(dá)的兔抗VEGF單抗序列經(jīng)人源化后，各得到4個 版本的VK和VH。輕鏈可變區(qū)包括VK-HZDl (如SEQ ID NO. 12)、VK-HZD2 (如SEQ ID NO. 14)、VK-HZD5 (如 SEQ ID NO. 16)和 VK-HZD6 (如 SEQ ID NO. 8)；重鏈可變區(qū)包括 與 VH-HZDl (如 SEQ ID NO. 11)所示、VH-HZD2 (如 SEQ ID N0. 13)、VH-HZD5 (如 SEQ ID N0. 15)和 VH-HZD6 (如 SEQ ID N0. 7)。與 VK-HZDl 比較，VK-HZD2 在 CDRl 區(qū)具有 2 個不同 的殘基。在VK-HZDl和VK-HZD2N端添加2個額外的氨基酸殘基后即分別成為VK-HZD5和 VK-HZD6。VH-HZDl 與 VH-HZD2 的 71 位殘基不同，VH-HZDl 的 71 位是 K，VH-HZD2 的 71 位是 R0 VK (H) -HZDl和VK (H) -HZD2序列中含有兔源信號肽，而VK (H) -HZD5和VK (H) -HZD6的序 列中含有人源信號肽。將4個版本的VK和VH的DNA序列通過人工合成后分別克隆進(jìn)已有人CK序列和 人CH序列的pTT5質(zhì)粒中，通過人信號肽表達(dá)抗體。將上述兩個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK 293-6Ε細(xì) 胞，瞬時表達(dá)人源化抗VEGF抗體，使用實施例1中的篩選方法，選定親和力適宜的HZD-V6 克隆作為最終使用的克隆，其表達(dá)的人源化抗VEGF抗體稱為ΕΡΙ0030，其氨基酸序列如SEQ ID Ν0. 9所示的重鏈和SEQ ID NO. 10所示的輕鏈。為提高產(chǎn)量，獲得工業(yè)用生產(chǎn)細(xì)胞株，將氨基酸序列如SEQ IDN0. 9所示的重鏈和 SEQ ID NO. 10所示的輕鏈表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入中國倉鼠卵巢細(xì)胞株(CHO)，于2009年8月20 日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)大屯路， 保藏編號為CGMCC No. 3233。實施例3 本發(fā)明所述單克隆抗體EPI0030與VEGF結(jié)合的檢測VEGF抗體通過結(jié)合VEGF從而阻斷其與受體KDR的結(jié)合，來抑制VEGF信號通路。 1 3系列稀釋重組表達(dá)的不同抗體(HZD-V1、HZD-V2、HZD-V5、HZD-V6)和AVASTIN后 (90 μ g/ml-45ng/ml)與IgG Fc_hVEGF(l μ g/ml)混合，加入混合好的抗體-VEGF復(fù)合物至 鋪IgG FC-VEGFR2板的孔中，加入鼠抗人VEGF抗體后用羊抗鼠IgG抗體-AP顯色進(jìn)行檢測。 結(jié)果顯示所表達(dá)的重組抗體與AVASTIN相似的競爭性抑制VEGF與KDR結(jié)合的活性。測定 結(jié)果顯示HZD-V 1、HZD-V2、HZD-V5、HZD-V6克隆表達(dá)的抗體均可以阻斷VEGF與KDR的結(jié)合 (見圖1)。參照上述實驗方法，測定EPI0030和AVASTIN的IC5tl值即半數(shù)抑制濃度，結(jié)果如圖 5所示，顯示EPI0030和AVASTIN有相似的競爭抑制活力。采用BIAcore-3000測定EPI0030與VEGF的解離常數(shù)KcL人VEGF被固定在CM5 芯片上，2倍系列稀釋的EPI0030和AVASTIN被注射進(jìn)流速為30ul/min的HBS-EP緩沖液 中。Kd為k。ff/k。n，表1中顯示EPI0030和AVASTIN與人VEGF的解離常數(shù)，EPI0030與VEGF 解離常數(shù)為0. 485nM，是AVASTIN的1/100，說明EPI0030與VEGF的結(jié)合能力強(qiáng)于AVASTIN。表1. EPI0030和AVASTIN與人VEGF的解離常數(shù)Kd (nM)實驗1實驗2平均STDEPI00300.3310.6380.4850.217AVASTIN61.933.847.919.9實施例4 本發(fā)明所述單克隆抗體EPI0030的鑒定和體外活性的測定HEK 293-6E細(xì)胞HZD-V6克隆瞬時表達(dá)的EPI0030抗體經(jīng)過純化后，進(jìn)行了有關(guān)質(zhì) 量的檢定，具體鑒定項目如下A 純度采用SDS-PAGE (還原和非還原)及SEC-HPLC來分析純度，結(jié)果見圖2、圖3，顯示 EPI0030抗體的純度大于98%，多聚體含量小于5%，主峰(保留時間10. 572分鐘)面積占 總面積(包括從左至右的峰1、2、3)大于95%，峰1、2為多聚體。B 體外結(jié)合活性IgG Fc-hVEGF 鋪板，BSA 封閉，1 3 系列稀釋 EPI0030 抗體和 AVASTIN 8 個 梯度(1 μ g/ml-0. 46ng/ml)，加入至已鋪好IgG Fc-hVEGF的孔中，加驢抗人IgG抗體-AP檢 測。結(jié)果顯示EPI0030抗體和AVASTIN有相似的結(jié)合活力。采用ELISA方法，包括IgG Fc-hVEGF直接鋪板法(見實施例1)和KDR競爭結(jié)合 法(見實施例3)，結(jié)果顯示EPI0030抗體與VEGF的結(jié)合以及抑制VEGF與KDR的結(jié)合呈劑 量相關(guān)性，結(jié)果見圖4和圖5。實施例5 本發(fā)明所述單克隆抗體EPI0030的體內(nèi)活性檢測在實驗前兩周從液氮罐中取出一支凍存的人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞和人非小細(xì)胞 肺癌NCI-H460細(xì)胞(約1 X IO7細(xì)胞)迅速放至37°C水浴中融化，隨后分別用預(yù)熱至37°C 添加了 10%胎牛血清(購自GIBC0)的McCoy’ s 5A培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞接種至 75CM2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞生長至80%融合率時按1 5進(jìn)行傳代，在體外連續(xù)傳代三 次以上。當(dāng)細(xì)胞總量達(dá)到接種所需，將細(xì)胞用胰酶消化、離心，然后用PBS洗滌細(xì)胞去除血 清，最后分別用無血清、無抗生素McCoy ’ s 5A培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基調(diào)整處理好的人結(jié)腸癌 HCT-116和人非小細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞密度至5 X 107ml，細(xì)胞懸液放置于冰上，接種于 6-8周齡裸鼠腹側(cè)部，每只小鼠接種0. 1ml，即5X106細(xì)胞/只。以游標(biāo)卡尺每2天測量裸小 鼠的腫瘤直徑，待每只小鼠的腫瘤均長至100mm3-300mm3，按瘤體積SD < 1/3入組后隨機(jī)分 為5組，每組6只。人結(jié)腸癌HCT-116模型組分別為模型對照組(1組)、5mg/kg AVASTIN(1 組)和 5mg/kg EPI-0030(1 組)組，將 AVASTIN 和 EPI-0030 用生理鹽水稀釋至 0. 5mg/ml。 人非小細(xì)胞肺癌NCI-H460模型組分別為模型對照組(1組)、5mg/kg AVASTIN(1組)和 1. 5mg/kg、5mg/kg EPI-0030 (2 組)組將 AVASTIN 和 EPI-0030 用生理鹽水稀釋至 0. 5mg/ ml和0. 15mg/ml。給藥組分別每周1，3，5d分別給予一次性腹腔注射0. 2ml的AVASTIN和 EPI-0030，模型對照組以同樣的時間和方式給予生理鹽水0. 2ml，連續(xù)給藥3周(21天，共9 次)。測量裸鼠的腫瘤瘤結(jié)節(jié)最大直徑a和最小徑b，按公式V = 0. 5XaXb2計算腫瘤 體積，以相對腫瘤增殖率T/c%作為療效評價指標(biāo)。
結(jié)果顯示，人結(jié)腸癌HCT-116模型中，5mg/kg劑量組中，EPI-0030與AVASTIN的抑 瘤率分別為65. 7%和15. 7% (見圖6)。人非小細(xì)胞肺癌NCI-H460模型中，EPI-0030與 AVASTIN的抑瘤率分別為95. 5%和66. 7% (見圖7) ；1. 5mg/kg劑量組中EPI-0030的抑瘤 率為57.6% (見圖8)。結(jié)果說明EPI-0030有顯著的抑制腫瘤活性的作用。參考AVASTIN臨床適應(yīng)癥，選擇人結(jié)腸癌HCT-116和人非小細(xì)胞肺癌NCI-H460 裸鼠異種移植瘤模型驗證EPI-0030對人結(jié)腸癌和人非小細(xì)胞肺癌的抑制作用，證明 EPI-0030具有顯著抑制人結(jié)腸癌和人非小細(xì)胞肺癌異種移植瘤的作用。EPI-0030在模型 中抑瘤活性強(qiáng)于AVASTIN。SEQUENCE LISTING<110>江蘇先聲藥物研究有限公司宜康公司<120> 一種抗VEGF的單克隆抗體及含有該抗體的藥物組合物<130>MP091624<160>16<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>8<212>PRT<213>重鏈可變區(qū)CDRl<400>1Ser Asn Asn Asp Val Met Cys Trp15<210>2<211>18<212>PRT<213>重鏈可變區(qū)CDR2<400>2Gly Cys lie Met Thr Thr Asp Val Val Thr Glu Tyr Ala Asn Trp Ala151015Lys Ser<210>3<211>14<212>PRT<213>重鏈可變區(qū)CDR3<400>3Arg Asp Ser Val Gly Ser Pro Leu Met Ser Phe Asp Leu Trp1510<210>4<211>130129]<212>PRT0130]<213>輕鏈可變區(qū)CDRl0131]<400>40132]Gln Ala Ser Gln SerlieTyr Asn Asn Asn Glu LeuSer0133]15100134]<210>50135]<211>70136]<212>PRT0137]<213>輕鏈可變區(qū)CDR20138]<400>50139]Arg Ala Ser Thr LeuAlaSer0140]1 50141]<210>60142]<211>120143]<212>PRT0144]<213>輕鏈可變區(qū)CDR30145]<400>60146]Gly Gly Tyr Lys SerTyrSerAsn Asp Gly Asn Gly0147]15100148]<210>70149]<211>1410150]<212>PRT0151]<213>重鏈可變區(qū)0152]<400>70153]Met Glu Leu Gly LeuArgTrpValPhe Leu ValAlalie LeuGluGly0154]1 510150155]Val Gln Cys Glu ValGlnLeuValGlu Ser GlyGlyGly LeuValLys0156]2025300157]Pro Gly Gly Ser LeuArgLeuSerCys Ala AlaSerGly PheSerPhe0158]3540450159]Ser Asn Asn Asp ValMetCysTrpVal Arg GlnAlaPro GlyLysGly0160]5055600161]Leu Glu Trp lie GlyCyslieMetThr Thr AspValVal ThrGluTyr0162]657075800163]Ala Asn Trp Ala LysSerArgPheThr Val SerArgAsp SerAlaLys0164]8590950165]Asn Ser Val Tyr LeuGlnMetAsnSer Leu ArgAlaGlu AspThrAla0166]1001051100167]Val Tyr Phe Cys AlaArgAspSerVal Gly SerProLeu MetSerPhe
115120125
Asp Leu Trp Gly ProGlyThrLeuValThrValSerSer
130135140
<210>8
<211>134
<212>PRT
<213>輕鏈可變區(qū)
<400>8
Met Asp MetArgValProAlaGlnLeuLeuGlyLeuLeuLeuLeuTrp
151015
Leu Pro AspThrArgCysAsplieGlnMetThrGlnSerProSerSer
202530
Leu Ser AlaSerValGlyAspArgValThrlieAsnCysGlnAlaSer
354045
Gln Ser lieTyrAsnAsnAsnGluLeuSerTrpTyrGlnGlnLysPro
505560
Gly Lys ProProLysLeuLeulieTyrArgAlaSerThrLeuAlaSer
65707580
Gly Val ProSerArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThr
859095
Leu Thr lieSerSerLeuGlnProGluAspValAlaThrTyrTyrCys
100105110
Gly Gly TyrLysSerTyrSerAsnAspGlyAsnGlyPheGlyGlyGly
115120125
Thr Lys ValGlulieLys
130
<210>9
<211>471
<212>PRT
<213>重鏈
<400>9
Met Glu LeuGlyLeuArgTrpValPheLeuValAlalieLeuGluGly
151015
Val Gln CysGluValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValLys
202530
Pro Gly GlySerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheSerPhe
354045
Ser Asn AsnAspValMetCysTrpValArgGlnAlaProGlyLysGly
505560
LeuGluTrplieGlyCyslieMetThrThrAspValValThrGluTyr
65707580
AlaAsnTrpAlaLysSerArgPheThrValSerArgAspSerAlaLys
859095
AsnSerValTyrLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAla
100105110
ValTyrPheCysAlaArgAspSerValGlySerProLeuMetSerPhe
115120125
AspLeuTrpGlyProGlyThrLeuValThrValSerSerAlaSerThr
130135140
LysGlyProSerValPheProLeuAlaProSerSerLysSerThrSer
145150155160
GlyGlyThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLysAspTyrPheProGlu
165170175
ProValThrValSerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSerGlyValHis
180185190
ThrPheProAlaValLeuGlnSerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSer
195200205
ValValThrValProSerSerSerLeuGlyThrGlnThrTyrlieCys
210215220
AsnValAsnHisLysProSerAsnThrLysValAspLysLysValGlu
225230235240
ProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCysProAlaPro
245250255
GluLeuLeuGlyGlyProSerValPheLeuPheProProLysProLys
260265270
AspThrLeuMetlieSerArgThrProGluValThrCysValValVal
275280285
AspValSerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAsp
290295300
GlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyr
305310315320
AsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAsp
325330335
TrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeu
340345350
ProAlaProlieGluLysThrlieSerLysAlaLysGlyGlnProArg
355360365
GluProGlnValTyrThrLeuProProSerArgAspGluLeuThrLys
370375380
AsnGlnValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAsp
385390395400
IleAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLys
405410415
ThrThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSer
420425430
LysLeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSer
435440445
CysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSer
450455460
LeuSerLeuSerProGlyLys
465470
<210>10
<211>241
<212>PRT
<213>輕鏈
<400>10
MetAspMetArgValProAlaGlnLeuLeuGlyLeuLeuLeuLeuTrp
151015
LeuProAspThrArgCysAsplieGlnMetThrGlnSerProSerSer
202530
LeuSerAlaSerValGlyAspArgValThrlieAsnCysGlnAlaSer
354045
GlnSerlieTyrAsnAsnAsnGluLeuSerTrpTyrGlnGlnLysPro
505560
GlyLysProProLysLeuLeulieTyrArgAlaSerThrLeuAlaSer
65707580
GlyValProSerArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThr
859095
LeuThrlieSerSerLeuGlnProGluAspValAlaThrTyrTyrCys
100105110
GlyGlyTyrLysSerTyrSerAsnAspGlyAsnGlyPheGlyGlyGly
115120125
ThrLysValGlulieLysArgThrValAlaAlaProSerValPhelie
130135140
PheProProSerAspGluGlnLeuLysSerGlyThrAlaSerValVal
145150155160
CysLeuLeuAsnAsnPheTyrProArgGluAlaLysValGlnTrpLys
165170175
ValAspAsnAlaLeuGlnSerGlyAsnSerGlnGluSerValThrGlu
180185190
GlnAspSerLysAspSerThrTyrSerLeuSerSerThrLeuThrLeu
195200205
SerLysAlaAspTyrGluLysHisLysValTyrAlaCysGluValThr
210215220
HisGlnGlyLeuSerSerProValThrLysSerPheAsnArgGlyGlu
225230235240
Cys
<210>11
<211>140
<212>PRT
<213>HZD1 重鏈可變區(qū)
<400>11
MetGluThrGlyLeuArgTrpLeuLeuLeuValAlaValLeuLysSer
151015
ValGlnCysGlnGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValLysPro
202530
GlyGlySerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheSerPheSer
354045
AsnAsnAspValMetCysTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeu
505560
GluTrpIleGlyCyslieMetThrThrAspValValThrGluTyrAla
65707580
AsnTrpAlaLysSerArgPheThrValSerLysAspSerAlaLysAsn
859095
SerValTyrLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaVal
100105110
TyrPheCysAlaArgAspSerValGlySerProLeuMetSerPheAsp
115120125
LeuTrpGlyProGlyThrLeuValThrValSerSer
130135140
<210>12
<211>134
<212>PRT
<213>HZD1輕鏈可變區(qū)
<400>12
MetAspThrArgAlaProThrGlnLeuLeuGlyLeuLeuLeuLeuTrp
151015
LeuProGlyAlaArgCysAlaLeuGlnMetThrGlnSerProSerSer
202530
LeuSerAlaSerValGlyAspArgValThrlieAsnCysGlnAlaSer
354045
GlnSerValTyrGlyAsnAsnGluLeuSerTrpTyrGlnGlnLysPro
505560
GlyLysProProLysLeuLeulieTyrArgAlaSerThrLeuAlaSer
65707580
GlyValProSerArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThr
859095
LeuThrlieSerSerLeuGlnProGluAspValAlaThrTyrTyrCys
100105110
GlyGlyTyrLysSerTyrSerAsnAspGlyAsnGlyPheGlyGlyGly
115120125
ThrLysValGlulieLys
130
<210>13
<211>140
<212>PRT
<213>HZD2 重鏈可變區(qū)
<400>13
MetGluThrGlyLeuArgTrpLeuLeuLeuValAlaValLeuLysSer
151015
ValGlnCysGlnGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValLysPro
202530
GlyGlySerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheSerPheSer
354045
AsnAsnAspValMetCysTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeu
505560
GluTrplieGlyCyslieMetThrThrAspValValThrGluTyrAla
65707580
AsnTrpAlaLysSerArgPheThrValSerArgAspSerAlaLysAsn
859095
SerValTyrLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaVal
100105110
TyrPheCysAlaArgAspSerValGlySerProLeuMetSerPheAsp
115120125
Leu Trp Gly Pro GlyThrLeuValThrValSerSer
130135140
<210>14
<211>134
<212>PRT
<213>HZD2輕鏈可變區(qū)
<400>14
Met Asp ThrArgAlaProThrGlnLeuLeuGlyLeuLeuLeuLeuTrp
151015
Leu Pro GlyAlaArgCysAlaLeuGlnMetThrGlnSerProSerSer
202530
Leu Ser AlaSerValGlyAspArgValThrlieAsnCysGlnAlaSer
354045
Gln Ser lieTyrAsnAsnAsnGluLeuSerTrpTyrGlnGlnLysPro
505560
Gly Lys ProProLysLeuLeulieTyrArgAlaSerThrLeuAlaSer
65707580
Gly Val ProSerArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThr
859095
Leu Thr lieSerSerLeuGlnProGluAspValAlaThrTyrTyrCys
100105110
Gly Gly TyrLysSerTyrSerAsnAspGlyAsnGlyPheGlyGlyGly
115120125
Thr Lys ValGlulieLys
130
<210>15
<211>141
<212>PRT
<213>HZD5 重鏈可變區(qū)
<400>15
Met Glu LeuGlyLeuArgTrpValPheLeuValAlalieLeuGluGly
151015
Val Gln CysGluValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValLys
202530
Pro Gly GlySerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheSerPhe
354045
Ser Asn AsnAspValMetCysTrpValArgGlnAlaProGlyLysGly
505560
LeuGluTrplieGlyCyslieMetThrThrAspValValThrGluTyr
65707580
AlaAsnTrpAlaLysSerArgPheThrValSerLysAspSerAlaLys
859095
AsnSerValTyrLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAla
100105110
ValTyrPheCysAlaArgAspSerValGlySerProLeuMetSerPhe
115120125
AspLeuTrpGlyProGlyThrLeuValThrValSerSer
130135140
<210>16
<211>134
<212>PRT
<213>HZD5輕鏈可變區(qū)
<400>16
MetAspMetArgValProAlaGlnLeuLeuGlyLeuLeuLeuLeuTrp
151015
LeuProAspThrArgCysAsplieGlnMetThrGlnSerProSerSer
202530
LeuSerAlaSerValGlyAspArgValThrlieAsnCysGlnAlaSer
354045
GlnSerValTyrGlyAsnAsnGluLeuSerTrpTyrGlnGlnLysPro
505560
GlyLysProProLysLeuLeulieTyrArgAlaSerThrLeuAlaSer
65707580
GlyValProSerArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThr
859095
LeuThrlieSerSerLeuGlnProGluAspValAlaThrTyrTyrCys
100105110
GlyGlyTyrLysSerTyrSerAsnAspGlyAsnGlyPheGlyGlyGly
115120125
ThrLysValGlulieLys
130
2權(quán)利要求
1.一種單克隆抗體，其特征在于，其重鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列，和/或其輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體包括單鏈抗體、雙 鏈抗體、嵌合抗體、人源化抗體、以及上述抗體的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗體 片段和含有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體，其特征在于，其重鏈可變區(qū)氨基酸序列如 SEQ ID NO. 7所示；或其重鏈可變區(qū)由SEQ ID NO. 7所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失、或 添加一個或幾個氨基酸衍生的與SEQ ID NO. 7的氨基酸序列至少有95%的一致性，且所述 單克隆抗體具有特異性結(jié)合VEGF的活性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體，其特征在于，其輕鏈可變區(qū)如SEQID NO. 8 所示的氨基酸序列；或其輕鏈可變區(qū)由SEQ IDN0. 8所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失、或 添加一個或幾個氨基酸衍生的與SEQ ID NO. 8的氨基酸序列至少有95%的一致性，且所述 單克隆抗體具有特異性結(jié)合VEGF的活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體，其特征在于，其重鏈如SEQID NO. 9所示的 氨基酸序列；或其重鏈由SEQ ID NO. 9所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失、或添加一個或幾 個氨基酸衍生的與SEQ IDN0. 9的氨基酸序列至少有95%的一致性，且所述單克隆抗體具 有特異性結(jié)合VEGF的活性。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體，其特征在于，其輕鏈氨基酸序列如SEQID NO. 10所示；或其輕鏈由SEQ ID NO. 10所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失、或添加一個或幾 個氨基酸衍生的與SEQ IDN0. 10的氨基酸序列至少有95%的一致性，且所述單克隆抗體具 有特異性結(jié)合VEGF的活性。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的單克隆抗體，其特征在于由保藏編號為CGMCC No. 3233的細(xì)胞株產(chǎn)生。
8.一種細(xì)胞株，其特征在于，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 保藏編號為CGMCC No. 3233。
9.權(quán)利要求1至7任一項所述的單克隆抗體在制備用于治療VEGF相關(guān)性疾病藥物中 的用途。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，所述VEGF相關(guān)性疾病包括腫瘤、老年性 黃斑變性、神經(jīng)退行性疾病、肥胖、糖尿病。
11.一種藥物組合物，其特征在于，含有有效量的權(quán)利要求1-7任一項所述的單克隆抗 體及藥學(xué)上可接受的載體。
12.—種試劑、試劑盒或芯片，包含權(quán)利要求1至7任一項所述的單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，提供一種單克隆抗體，其重鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，或其輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。本發(fā)明還提供一種人源化單克隆抗體，由保藏編號為CGMCC No.3233的細(xì)胞株產(chǎn)生。本發(fā)明所述抗體可與VEGF有很強(qiáng)的結(jié)合親和力，可抑制VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，抑制腫瘤生長，可用于治療VEGF相關(guān)性疾病。本發(fā)明所述抗體活性強(qiáng)、特異性好、易于制備，具有廣闊的臨床應(yīng)用和實驗應(yīng)用前景。
文檔編號A61P35/00GK102002104SQ200910171550
公開日2011年4月6日 申請日期2009年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月28日
發(fā)明者余國良, 張永克, 朱偉民, 李森偉, 柯耀煌, 樊馨, 馬梵辛 申請人:宜康公司, 江蘇先聲藥物研究有限公司