專利名稱：佐劑系統(tǒng)及疫苗的制作方法
佐劑系統(tǒng)及疫苗本申請是申請日為1999年10月8日，申請?zhí)枮?9814341. 3的發(fā)明名稱為“佐劑 系統(tǒng)及疫苗”的發(fā)明專利申請的分案申請。本發(fā)明涉及改進(jìn)的疫苗、佐劑系統(tǒng)以及制備這樣的疫苗和佐劑系統(tǒng)的方法。具體 地說，本發(fā)明的疫苗和佐劑系統(tǒng)包括金屬鹽以及其它免疫刺激劑如單磷酰脂質(zhì)A或其衍生 物、Quil A或其衍生物、或免疫刺激性寡核苷酸如CpG。在本領(lǐng)域內(nèi)，眾所周知鋁鹽提供了具有佐劑活性的安全賦形劑。據(jù)認(rèn)為這些佐劑 的作用機(jī)制包括形成抗原儲存庫(antigen depot)以致抗原可以在給予后滯留在注射位點 長達(dá)3周，以及形成更易被抗原呈遞細(xì)胞攝入的抗原/金屬鹽復(fù)合物。除鋁外，已經(jīng)使用其 它金屬鹽來吸附抗原，包括鋅鹽、鈣鹽、鈰鹽、鉻鹽、鐵鹽以及鈹鹽。鋁的氫氧化物和磷酸鹽 是最常用的。包含鋁鹽、抗原以及其它免疫刺激劑的疫苗制劑是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。比起由鋁鹽 和抗原單獨刺激的免疫反應(yīng)，這樣的制劑引起更強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。這些疫苗制備物的配制 以前涉及特殊的生產(chǎn)過程，因為據(jù)認(rèn)為要發(fā)生最佳的免疫反應(yīng)，必須使抗原吸附于免疫刺 激劑所吸附的同一鋁鹽顆粒上。這樣，當(dāng)抗原呈遞細(xì)胞攝入抗原時，共吸附的免疫刺激劑直 接對同一抗原呈遞細(xì)胞施加其刺激作用。在EP 0 576 478 Bi、EP 0 689 454 Bl 和 EP 0 633 784 Bl 中描述了基于 鋁的疫苗制劑，其中抗原和免疫刺激劑3-脫氧酰化單磷酰脂質(zhì)A (3-de-0-acylated monophosphoryl lipid A) (3D-MPL)吸附于同一顆粒。在這些情況下，首先使抗原吸附到鋁 鹽上，隨后使免疫刺激劑3D-MPL吸附于同一鋁鹽顆粒。這樣的過程首先涉及在水浴中通過 超聲處理而懸浮3D-MPL，直到顆粒達(dá)到80到500nm之間的大小。一般在室溫下，在攪拌的 同時使抗原吸附在鋁鹽上一小時。然后將所述3D-MPL懸浮物加入已吸附的抗原，并將所述 制劑在室溫下溫育1小時，隨后在4°C保存?zhèn)溆?。從免疫的觀點上看，所述在先技術(shù)的配制方法提供了有效的疫苗，但是，它們也包 含一些商業(yè)缺陷。為使得疫苗適于給予人類，所述方法必須保持一致并服從生產(chǎn)質(zhì)量管理 規(guī)范(GMP)控制以及質(zhì)量控制(QC)。在一些情況下，所述在先技術(shù)的方法提供了其中一種 抗原或多種抗原全部吸附到同一金屬鹽顆粒上的疫苗。然后3D-MPL要吸附于同一金屬顆 粒的要求也使得該方法復(fù)雜化。在包含多種抗原的聯(lián)合疫苗的情況下，可能是特別成問題 的(多種抗原的吸附依賴于每種抗原在特定PH下對特定金屬鹽的親和力)。根據(jù)存在何種 抗原，所述在先技術(shù)的方法可能在重復(fù)生產(chǎn)能力和疫苗QC上存在問題。此外，如果在一種 特定抗原的QC中發(fā)生任何事故或可能導(dǎo)致疫苗污染的事件，這有可能導(dǎo)致所有各個成分 的浪費，而不僅僅是出現(xiàn)問題的特定抗原的浪費。另外，在一些情況下，聯(lián)合疫苗可能要求 順序加入抗原，這樣一個過程是極其耗時并且昂貴的。因此，所述在先技術(shù)的方法復(fù)雜、不 易控制并且昂貴。驚人的是，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)不必將抗原和免疫刺激劑吸附于同一顆粒。與本領(lǐng) 域內(nèi)已經(jīng)接受的觀點不同，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)抗原吸附于從免疫刺激劑結(jié)合的那些金屬鹽顆粒分 離的特定金屬鹽顆粒上時，可以產(chǎn)生令人滿意的疫苗。
所述改進(jìn)過程包括吸附免疫刺激劑到金屬鹽顆粒上，接著使抗原吸附于另一金屬 鹽顆粒，隨后混合所述分離的金屬顆粒以形成疫苗。本發(fā)明還為佐劑組合物提供了吸附于 金屬鹽顆粒的免疫刺激劑，其特征在于所述金屬鹽顆?；静缓渌乖?。此外，本發(fā)明還 提供了疫苗，所述疫苗的特征在于免疫刺激劑吸附于基本不含其它抗原的金屬鹽顆粒，并 且吸附抗原的金屬鹽顆?；静缓渌庖叽碳Ｒ虼?，本發(fā)明提供了包含已經(jīng)吸附到金屬鹽顆粒上的免疫刺激劑的佐劑制劑，其 特征在于所述組合物基本不含其它抗原。此外，該佐劑制劑是在本發(fā)明的生產(chǎn)疫苗的方法 中要求的中間體。因此，提供了生產(chǎn)疫苗的方法，所述方法包括將本發(fā)明的所述佐劑組合物 與抗原混合。所述抗原最好已經(jīng)預(yù)吸附到金屬鹽上。所述金屬鹽可以與吸附所述免疫刺激 劑的金屬鹽相同或相似。本發(fā)明還提供了疫苗組合物，所述組合物包含吸附于第一種金屬鹽顆粒的免疫刺 激劑以及吸附于金屬鹽的抗原，其特征在于所述第一種金屬鹽顆粒和所述第二種金屬鹽顆 粒是不同的。或者，構(gòu)成本發(fā)明的部分的疫苗包括兩組主要的復(fù)合物，第一組復(fù)合物包括(a) 吸附于金屬鹽顆粒的免疫刺激劑，特征在于所述金屬鹽顆?；静缓乖欢诙M復(fù)合 物包括(b)吸附于金屬鹽顆粒的抗原。所述疫苗組合物也可包括兩組主要的復(fù)合物，第一 組復(fù)合物包括(a)吸附于金屬鹽顆粒的免疫刺激劑，特征在于所述金屬鹽顆?；静缓?原；第二組復(fù)合物包括(b)吸附于金屬鹽顆粒的抗原，特征在于所述金屬鹽顆?；静缓?免疫刺激劑。在這兩組主要復(fù)合物中存在的金屬鹽可以是相同或不同的。此外，在其中可能存 在多種不同抗原的聯(lián)合疫苗的情況下，所述第二組復(fù)合物(上面所述)可以包含吸附于不 同金屬顆粒上的多種抗原。關(guān)于本發(fā)明中基本不含其它抗原的定義，是指能夠吸附于所述金屬鹽顆粒的總物 質(zhì)中不多于20% (質(zhì)量)是另一種抗原，優(yōu)選不多于10% (質(zhì)量)是另一種抗原，最優(yōu)選 不多于5% (質(zhì)量)是另一種抗原?；蛘撸P(guān)于本發(fā)明中基本不含免疫刺激劑是指能夠吸 附于所述金屬鹽顆粒的總物質(zhì)中不多于20% (質(zhì)量)是免疫刺激劑，優(yōu)選不多于10% (質(zhì) 量)是免疫刺激劑，最優(yōu)選不多于5% (質(zhì)量)是免疫刺激劑?？梢允褂脤τ诒绢I(lǐng)域內(nèi)技術(shù) 人員明顯的常規(guī)檢驗來確定抗原或免疫刺激劑是否吸附到不同的分離顆粒上，包括但不限 于在電場內(nèi)通過制劑的自由流動而分離疫苗成為不同組份，或者如特別適用于非顆粒性抗 原的沉降速率分析等技術(shù)，隨后分析各組份中的免疫刺激劑或抗原。本發(fā)明還提供了試劑盒，所述試劑盒包括一個盛有吸附于金屬鹽的免疫刺激劑的 容器；以及第二個盛有抗原的容器，所述抗原最好吸附于金屬鹽。當(dāng)需要商業(yè)化規(guī)模數(shù)量的聯(lián)合疫苗時，本發(fā)明的方法是特別有用的。聯(lián)合疫苗是 含有一種以上病原體的一種以上抗原的單劑疫苗。這樣的疫苗可以減少引起對抗多種病原 體和疾病的保護(hù)所需的接種數(shù)量。例如，如果一種疫苗包含A1(0H)3、3D_MPL以及抗原V、W、X、Y、Z，以前的方法涉及 將所述抗原和3D-MPL配制到Al (OH)3的同一顆粒上。這樣的在先技術(shù)方法要求將V、W、X、 Y、Z吸附于Al (OH) 3，隨后將游離的3D-MPL加入到每一種預(yù)吸附的抗原復(fù)合物。與此不同，在本發(fā)明的配制方法中，抗原V、W、X、Y、Z各自在分離的容器中吸附到分離的Al (OH)3顆粒上。3D-MPL也在另一容器吸附到Al(OH)315然后通過將每一獨離容器 的材料簡單混合，組成疫苗。在這種情況下，結(jié)合3D-MPL的Al (OH)3顆?？梢耘c結(jié)合抗原 的Al (OH)3顆粒分離?；蛘?，本發(fā)明提供了制備包含免疫刺激劑、抗原以及金屬鹽的疫苗的方法，包括1.吸附抗原于第一種金屬顆粒，2.吸附免疫刺激劑于第二種金屬顆粒，然后
3.混合上面步驟1和步驟2的產(chǎn)品。本發(fā)明提供了克服在先技術(shù)中存在的問題的生產(chǎn)疫苗的方法。各個抗原-金屬鹽 復(fù)合物都可以接受GMP控制，并且如果特定抗原-金屬鹽制備物發(fā)生任何不湊巧的污染，那 么不會危及其它抗原以及免疫刺激性佐劑的完整性。驚人的是，與本領(lǐng)域內(nèi)已經(jīng)接受的觀 點不同，通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的疫苗與使用在先技術(shù)制備的疫苗一樣有效。在本發(fā)明的意義內(nèi)，免疫刺激劑的定義可以描述為具有佐劑活性的天然化 合物或合成化合物，所述佐劑活性來源于所述化合物本身對免疫系統(tǒng)細(xì)胞的直接 或間接刺激效應(yīng)，而不是通過其它非刺激性效應(yīng)如儲存庫效應(yīng)(cbpot effect)或靶 向免疫系統(tǒng)。這樣的免疫刺激劑的例子描述于“Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach，，(Powell, M. F.禾口 Newman, M. J.編 輯；1995, Pharmaceutical Biotechnology (Plenum Press, New York and London, ISBN 0-306-44867-X)中由 Powell, M.F.和NeWman，M.編寫的名為“疫苗佐劑與賦形劑綱要”的一章。在本發(fā)明范圍內(nèi)的這些 免疫刺激劑包括得自細(xì)菌的化合物，如單磷酰脂質(zhì)A或其衍生物；得自植物的皂苷類或其 衍生物，例如Quil A ；或免疫刺激性寡核苷酸如CpG、嵌段共聚物、霍亂毒素、免疫刺激性細(xì) 胞因子如GM-CSF和IL-Upolyribo A和polyribo U以及胞壁酰三肽(MTP)。單磷酰脂質(zhì)A是具有佐劑活性的衍生自細(xì)菌的化合物，并且是在本發(fā)明的應(yīng)用中 優(yōu)選的免疫刺激劑。已經(jīng)改變該毒性化合物以形成毒性更低的衍生物，一種這樣的衍生物 是3-脫氧酰化單磷酰脂質(zhì)A (稱為3D-MPL或d3-MPL，表示還原性末端葡糖胺的3位是脫氧 酰化)。為制備3D-MPL，見GB 2 220 211 A。在化學(xué)上它是具有3、4、5或6個?；湹?-脫 酰化單磷酰脂質(zhì)A的混合物。在本發(fā)明的組合物中最好使用小顆粒MPL。小顆粒MPL具有 這樣的顆粒大小以致其可以通過0.22 μ m濾膜無菌濾過。在國際專利申請第WO 94/21292 號中描述了這樣的制備物。其它改進(jìn)在公開了包含三?；退孽；逶氐?D-MPL的 穩(wěn)定制備物的GB 9807933. 8中描述。GB 2 220 211 A提到降低了以前使用的腸桿菌脂多糖(LPS)的內(nèi)毒性，同時保留 了免疫原性特性。然而GB 2 220 211僅在關(guān)于細(xì)菌(革蘭氏陰性)系統(tǒng)時引用了這些發(fā) 現(xiàn)。在本發(fā)明的應(yīng)用中另一種優(yōu)選的免疫刺激劑是Quil A及其衍生物。Quil A是一 種從南美洲的樹Quilaja Saponaria Molina分離得到的皂苷制備物，Dalsgaard等在1974 年(“阜苷佐劑，，，Archiv. fur diegesamte Virusforschung,第 44 卷，Springer Verlag, Berlin，第243-254頁)首次描述其具有佐劑活性。已經(jīng)通過HPLC分離了保留其佐劑 活性并且不具有與Quil A相關(guān)的毒性的Quil A的純化片段(EP 0 362278)，例如QS7和 QS21 (也稱為QA7和QA21)。已經(jīng)描述了特別優(yōu)選的QS21的特定制劑，這些制劑還包含固 醇(W096/33739)。
CpG是具有已知佐劑特性的免疫刺激性寡肽(W0 96/02555)。在本發(fā)明的范圍內(nèi) 優(yōu)選的 CpG 序列是(TCC ATG AGC TTC CTG ACGTT，Krieg 1826)、(TCT CCC AGC GTG CGC CAT, Krieg 1758)以及 TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT。本發(fā)明涉及所述佐劑的特定配制方法以及特性，并且因此可以與許多種抗原一起 使用。本發(fā)明的疫苗可以用于初次劑量和加強(qiáng)劑量(priming and boosting dose)，以及用 于引起針對多種病原體的免疫反應(yīng)和引起針對由多種病原體介導(dǎo)的感染的保護(hù)。同時本發(fā) 明提供了引發(fā)針對抗原的免疫反應(yīng)的方法，包括使用包含金屬鹽、免疫刺激劑和抗原的疫 苗，其中所述免疫刺激劑吸附于從吸附所述抗原的那些金屬鹽顆粒分離的金屬鹽顆粒上。 下面列出了 一些病原體和抗原。由甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒和戊型肝炎病 毒導(dǎo)致的病毒性肝炎是非常普遍的病毒性疾病。尤其是通過乙型肝炎病毒和丙型肝炎 病毒，還引起了許多例肝癌。因此發(fā)展有效的疫苗是非常重要的，盡管有值得注意的 成功，但這仍是一項正在進(jìn)行的工作。在Lancet，1990年5月12日第1142頁及其下 (Prof A. L. W. F. Eddleston)中可以找到關(guān)于現(xiàn)代肝炎疫苗的綜述，包括許多重要的參考 資料。還可參見 “Viral H印atitis and Liver Disease” (Vyas, B. N.，Dienstag, J. L.， 禾口 Hoofnagle，J. H.,編輯，Grune 禾口 Stratton. Inc. (1984))禾口 “Viral Hepatitis and Liver Disease，，(Proceedings of the 1990International Symposium, F. B. Hollinger, S. M. Lemon 和 H. Margolis 編輯，Williams and Wilkins 出版)。本文使用的表述“乙型肝炎抗原”用來指由乙型肝炎病毒衍生的可用于在人體內(nèi) 引起針對所述病毒的免疫的任何抗原性物質(zhì)。乙型肝炎病毒(HBV)感染是一個廣泛的問題，但用于群體免疫(mass immunisation)的疫苗目前是可以得到的，例如通過遺傳工程技術(shù)獲得的產(chǎn)品 "Engerix-B" (SmithKline Beecham pic)。制備乙型肝炎表面抗原(HBsAg)已經(jīng)有許多文獻(xiàn)論述。見，例如，Harford等在 Develop. Biol. Standard 54，第 125 頁(1983)、Gregg 等在 Biotechnology, 5，第 479 頁 (1987) ,EP-A-O 226 846, EP-A-O 299 108 以及其中的參考文獻(xiàn)。本文使用的表達(dá)方式“乙型肝炎表面抗原”或“HBsAg”包括顯示HBV表面抗原 的抗原性的任何HBsAg抗原或其片段?？梢灾莱鼿BsAg S抗原的226氨基酸序列(見 Tiollais等，Nature, 317,489 (1985)和其中的參考文獻(xiàn))外，如果需要，如本文所述的 HBsAg可以包括全部或部分前S序列，如上面的參考資料以及EP-A-O 278 940所述。尤其 是所述HBsAg可以包括包含這樣的氨基酸序列的多肽所述氨基酸序列包含殘基12-52，其 后是殘基133-145，其后是與ad血清型乙型肝炎病毒上的可讀框有關(guān)的HBsAg的L-蛋白 的殘基175-400 (該多肽稱為L*;見EP 0 414 374)。在本發(fā)明范圍內(nèi)的HBsAg也可以包括 在EP 0 198 474 (Endotronics)中描述的前Sl-前S2-S多肽或其類似物，如在EP O 304 578 (Mc Cormick and Jones)中描述的那些類似物。如本文所述的HBsAg也可以指突變體， 例如在WO 91/14703或歐洲專利申請公開號O 511 855 Al中描述的“逃逸突變體(escape mutant) ”，特別是其中在145位上的氨基酸取代是從甘氨酸到精氨酸的HBsAg。一般HBsAg將是顆粒形式的。所述顆粒可以包括例如單獨的S蛋白或者可以是復(fù) 合顆粒，例如0Λ S)，其中L*如上所定義，S表示HBsAg的S蛋白。在酵母中表達(dá)時，所述顆粒在形式上是有利的。對甲型肝炎具有保護(hù)的成份最好是名為“Havrix” (SmithKlineBeecham Biologicals)的產(chǎn)品，“Havrix”是由HAV HM-175株得到的滅活減毒疫苗[見“Inactivated Candidiate Vaccines for Hepatitis A，，，F(xiàn). Ε· Andre, A. Hepburn 禾口 Ε· D Hondt (1980), Prog. Med. Virol.第 37 卷,第 72-95 頁以及由 SmithKline Beecham Biologicals 出版的 產(chǎn)品專題文章“Havrix” (1991)。因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，提供了包含HBsAg以及甲型肝炎抗原的 聯(lián)合疫苗。另外，本發(fā)明提供了生產(chǎn)甲型肝炎和乙型肝炎聯(lián)合疫苗的方法，以及由該方法得 到的產(chǎn)品。其它聯(lián)合疫苗可以在市場上獲得，包括由SmithKline BeechamBiologicals制造 的Infanrix 系列(range)。這樣的疫苗基于Diptheria毒素、破傷風(fēng)毒素和百日咳博德特 氏菌(B. pertussis)抗原的“核心”組合。該疫苗包含一種百日咳成份(滅活的完整百日咳 博德特氏菌細(xì)胞，或一般包括兩種抗原PT和FHA、通常69kDa的無細(xì)胞百日咳，可選地還有 凝集原2或凝集原3中的一種或兩種)。這樣的疫苗通常稱為DTPw (完整細(xì)胞)或DTPa (無 細(xì)胞)。在本發(fā)明范圍內(nèi)的特定聯(lián)合疫苗包括Diptheria-破傷風(fēng)-百日咳-乙型肝炎(DTP-HB)Diptheria-破傷風(fēng)-乙型肝炎(DT-HB)Hib-乙型肝炎DTP-Hib-乙型肝炎IPV (滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗)-DTP-Hib-乙型肝炎所述百日咳成份合適地是完整細(xì)胞的百日咳疫苗或包含部分或高度純化的抗原 的無細(xì)胞百日咳疫苗。上面的組合可選地包括保護(hù)對抗甲型肝炎的成份。所述甲型肝炎 成份最好經(jīng)過福爾馬林滅活的HM-175。最好如下純化HM-175:用胰蛋白酶處理培養(yǎng)的 HM-175，通過滲透層析從小蛋白酶消化的蛋白中分離完整的病毒，然后用福爾馬林滅活。最 好所述乙型肝炎聯(lián)合疫苗是一種兒科疫苗。本發(fā)明的其它聯(lián)合疫苗公開于GB 9805105. 5 (SmithKlineBeecham Biologicals s. a.)，這樣的聯(lián)合疫苗對用于青少年的疫苗特別有利。優(yōu)選的組合基于乙型肝炎抗原(Hep B)和單純皰疹(HSV)抗原的“核心”組合。在這個“核心”中可以選擇地加入一種或多種得 自下面的抗原埃-巴二氏病毒(EBV)抗原、甲型肝炎抗原(Hep Α)、人乳頭瘤病毒(HPV) 抗原。這些聯(lián)合疫苗可以另外包含水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)、人巨細(xì)胞病毒(HCMV)或弓 形蟲抗原。本發(fā)明的疫苗制劑最好包含能夠引發(fā)對抗人類病原體的免疫反應(yīng)的抗原或抗原 組合物，所述抗原或抗原組合物來自HIV-I (如tat、nef, gpl20或gpl60)、人類皰疹病毒 (如gD或其衍生物或立即早期蛋白如來自HSVl或HSV2的ICP27)、巨細(xì)胞病毒((特別是人 類)(如gB或其衍生物))、輪狀病毒(包括活減毒病毒)、埃-巴二氏病毒(如gp350或其 衍生物)、水痘-帶狀皰疹病毒(如gp I、II和IE63)，或者所述抗原或抗原組合物來自肝炎 病毒如乙型肝炎病毒(例如乙型肝炎表面抗原或其衍生物)、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒 和戊型肝炎病毒，或者所述抗原或抗原組合物來自其它病毒性病原體，如副粘病毒呼吸道合胞病毒(如F蛋白和G蛋白及其衍生物)、副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳頭瘤 病毒(例如HPV6、11、16和18)、黃病毒(如黃熱病毒、登革病毒、蜱傳腦炎病毒、日本腦炎病 毒)或流感病毒，或者所述抗原或抗原組合物來自細(xì)菌病原體，如奈瑟氏菌屬(Neisseria spp.)，包括淋病奈瑟氏菌(N. gonorrhea)和腦膜炎奈瑟氏菌(N. meningitidis)(例如 莢膜多糖及其偶聯(lián)物、運鐵蛋白結(jié)合蛋白、乳鐵蛋白結(jié)合蛋白、PilC、粘附素)；鏈球菌屬 (Streptococcus spp.)，包括肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)(例如莢膜多糖及其偶聯(lián)物、 PsaA, PspA、鏈球菌溶血素、膽堿結(jié)合蛋白)、釀膿鏈球菌(S. pyogenes)(例如M蛋白或 其片段、C5A蛋白酶、脂磷壁質(zhì))、無乳鏈球菌(S.agalactiae)、變異鏈球菌(S. mutans)； 嗜血菌屬(Haemophilus spp.)，包括B型流感嗜血菌(H. influenzae)(例如PRP及其 偶聯(lián)物)、未定型(non typeable)流感嗜血菌(例如0MP26、高分子量粘附素、P5、P6、 脂蛋白D)、杜氏嗜血菌(H. ducreyi)；莫拉氏菌屬(Moraxella spp.)，包括粘膜炎莫 拉氏菌(M. catarrhal is),也稱為卡他布蘭漢氏菌(Branhame 1 lacatarrhal is)(例如 高分子量粘附素和低分子量粘附素及侵染素)；博德特氏菌屬(Bordetella spp.)， 包括百日咳博德特氏菌(B. pertussis)(例如pertactin、百日咳毒素或其衍生物、絲 狀血凝素、腺苷酸環(huán)化酶、菌毛)、副百日咳博德特氏菌(B. parapertussis)和支氣管 炎博德特氏菌(B. bronchiseptica)；分枝桿菌屬(Mycobacterium spp.)，包括結(jié)核 分枝桿菌(M. tuberculosis)(例如ESAT6、85A抗原、85-B抗原或85-C抗原)、牛分枝 桿菌(M.bovis)、麻風(fēng)分枝桿菌(M. 1印rae)、鳥分枝桿菌(M. avium)、副結(jié)核分枝桿菌 (M. paratuberculosis)、耳止柜分枝桿菌(M. smegmatis)；軍團(tuán)菌屬(Legionella spp.),包 括嗜肺軍團(tuán)菌(L. pneumophila)；埃希氏菌屬(Escherichia spp.)，包括腸毒性大腸桿菌 (E. coli)(例如定居因子、熱不穩(wěn)定毒素或其衍生物、熱穩(wěn)定毒素或其衍生物)、腸出血性大 腸桿菌、腸致病性大腸桿菌(例如志賀樣毒素或其衍生物)；弧菌屬(Vibro spp.)，包括霍 亂弧菌(V. cholera)(例如霍亂毒素或其衍生物)；志賀氏菌屬(Shigella spp.)，包括宋內(nèi) 氏志賀氏菌(S. sonnei)、痢疾志賀氏菌(S. dysenteriae)、弗氏志賀氏菌(S. flexnerii)； 耶爾森氏菌屬(Yersinia spp.)，包括小腸結(jié)膜炎耶爾森氏菌(Y. enterocolitica)(例如 Yop蛋白)、鼠疫耶爾森氏菌(Y.pestis)、假結(jié)核耶爾森氏菌(Y. pseudotuberculosis)； 彎曲桿菌屬(Campylobacterspp.)，包括空腸彎曲桿菌(C. jejuni)(例如毒素、粘附素 和侵襲素)和大腸彎曲桿菌(C. coli)；沙門氏菌屬(Salmonella spp.)，包括傷寒沙 門氏菌(S. typhi)、副傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌(S. choleraesuis)、腸炎沙門氏 菌(S. enteritidis)；李斯特氏菌屬(Listeria spp.)，包括單核細(xì)胞增生李斯特氏菌 (L. monocytogenes)；螺旋桿菌屬(Helicobacterspp.)，包括幽門螺旋桿菌(H. pylori)(例 如脲酶、過氧化氫酶、空泡毒素(vacuolating toxin))；假單胞菌屬(Pseudomonas spp.)， 包括銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)；葡萄球菌屬(Staphylococcus spp.)，包括金黃色葡 萄球菌(S. aureus)、表皮葡萄球菌(S. epidermidis)；腸球菌屬(Enterococcus spp.), 包括糞腸球菌(E. faecalis)、屎腸球菌(E. faecium)；梭菌屬(Clostridium spp.),包 括破傷風(fēng)梭菌(Ctetani)HfiJ如破傷風(fēng)毒素及其衍生物)、肉毒梭菌(C. botulinum) (例如肉毒桿菌毒素及其衍生物)、艱難梭菌(C. difficile)(例如梭菌毒素A或梭菌 毒素B及它們的衍生物)；芽孢桿菌屬(Bacillus)，包括炭疽芽孢桿菌(B. anthracis) (例如肉毒桿菌毒素及其衍生物)；棒桿菌屬(Corynebacterium spp.)，包括白喉棒桿菌(C. diphtheriae)(例如白喉毒素及其衍生物)；疏螺旋體屬(Borrelia spp.)，包括布氏 疏螺旋體(B. burgdorferi)(例如 OspA、OspC, DbpA、DbpB)、嘎氏疏螺旋體(B. garinii) (例如 OspA、OspC、DbpA、DbpB)、阿氏疏螺旋體(B. afzelii)(例如 OspA、OspC、DbpA、 DbpB)、B. andersonii (例如 OspA、OspC, DbpA, DbpB)、赫氏蜱疏螺旋體(B.hermsii)；埃 里希氏體屬(Ehriichiaspp.)，包括馬埃里希氏體(E. equi)和人粒細(xì)胞增多埃里希病的 病原體；立克次氏體屬(Rickettsia spp.)，包括立氏立克次氏體(R. Rickettsii)；衣原 體屬(Chlamydia spp.)，包括沙眼衣原體(C. trachomatis)(例如Μ0ΜΡ、肝素結(jié)合蛋白)、 肺炎衣原體(C. pneumoniae)(例如Μ0ΜΡ、肝素結(jié)合蛋白)、鸚鵡熱衣原體(C. psittaci)； 鉤端螺旋體屬(L印tospira spp.)，包括問號鉤端螺旋體(L. interrogans)；密螺旋體 屬(Tr印onema spp.)，包括蒼白密螺旋體(T. pallidum)(例如稀有外膜蛋白)、齒垢密 螺旋體(T. denticola)、豬痢疾密螺旋體(T. hyodysenteriae)；或來自寄生蟲，例如瘧原 蟲屬(Plasmodium spp.)，包括惡性瘧原蟲；弓漿蟲屬(Toxoplasma spp·)，包括鼠弓漿 蟲(T. gondii)(例如 SAG2、SAG3、Tg34)；內(nèi)阿米巴屬(Entamoeba spp.)，包括痢疾內(nèi)變 形蟲(E. histolytica)；巴貝蟲屬(Babesia spp.)，包括田鼠巴貝蟲(B. microti)；錐蟲 屬(Trypanosomaspp·)，包括克魯茲錐蟲(T. cruzi)；賈第鞭毛蟲屬(Giardia spp.)，包 括吸吮賈第蟲(G. Iamblia) ；Leshmania 物種，包括 L. major ；肺囊蟲屬(Pneumocystis spp.)，包括卡氏肺囊蟲(P.carinii)；毛滴蟲屬(Trichomonas spp.)，包括陰道毛滴蟲 (T. vaginalis) ；Schisostoma物種，包括S. mansoni，或得自酵母，例如念珠菌屬(Candida spp.)，包括白色念珠菌(C. albicans)；隱球酵母屬(Cryptococcus spp.)，包括新型隱球 菌酵母(C. neoformans)。在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明的疫苗制劑包含HIV-I抗原gpl20，特別是當(dāng)在CHO細(xì) 胞中表達(dá)時。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的疫苗制劑包含如上面所定義的gD2t。在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，含有要求保護(hù)的佐劑的疫苗包括據(jù)認(rèn)為引起生 殖器疣的HPV病毒(HPV 6或HPV 11及其它病毒)以及引起宮頸癌的HPV病毒(HPV 16、 HPV 18及其它病毒)。尤其優(yōu)選的疫苗形式包含Ll顆?；虿《練ち?，以及包含由以下選 出的一種或多種抗原的融合蛋白HPV 6和HPV 11蛋白E6、E7、L1和L2。最優(yōu)選的融合蛋 白形式是GB 95 15478. 7中公開的L2E7以及GB9717953. 5(W099/10375)中公開的蛋白 D(l/3)-E7。本發(fā)明的疫苗還包括由導(dǎo)致瘧疾的寄生蟲得到的抗原。例如，優(yōu)選的來自 Plasmodia falciparum的抗原包括RTS、S和TRAP。RTS是一種雜種蛋白，包含通過乙型肝 炎表面抗原前S2部分的四個氨基酸連接到乙型肝炎病毒表面(S)抗原的惡性瘧原蟲環(huán)子 孢子蛋白的基本上全部C末端片段。其完整結(jié)構(gòu)公開于要求英國專利申請第9124390. 7號 的優(yōu)先權(quán)的公開號為WO 93/10152的國際專利申請第PCT/EP92/02591號中。當(dāng)在酵母中表 達(dá)時，RTS作為脂蛋白顆粒產(chǎn)生，當(dāng)其與來自HBV的S抗原共表達(dá)時，它產(chǎn)生名為RTS，S的 混合顆粒。公開號為WO 90/01496的國際專利申請第PCT/GB89/00895號中描述了 TRAP抗 原。本發(fā)明的優(yōu)選實施方案是一種瘧疾疫苗，其中所述抗原制備物包含RTS，S和TRAP抗原 的組合。有可能成為多級瘧疾疫苗的成份的候選物的其它瘧原蟲抗原是惡性瘧原蟲MSP1、 AMA1、MSP3、EBA、GLURP, RAPl、RAP2、鉗合蛋白、PfEMPl、Pf332、LSAl、LSA3、STARP, SALSA、 PfEXPl、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfsl6、Pfs48/45、Pfs230 以及它們在瘧原蟲物種中的類似物。所述制劑還可以包含抗腫瘤抗原并可用于治療癌癥的免疫療法 (immunotherapeutic treatment cancers)。例如，發(fā)現(xiàn)所述佐劑制劑對腫瘤排斥抗原 (tumor rejection antigen)有作用，如前列腺癌、乳癌、結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌、腎癌或黑素 瘤癌(melanoma cancer)的腫瘤排斥抗原。典型抗原包括MAGE 1和MAGE 3或其它用于治 療黑素瘤的MAGE抗原、PRAM/E、BAGE或GAGE (Robbins和 Kawakami，1996，Current Opiniohs in Immunology 8,第628-636頁；Van den Eynde^, International Journal of Clinical & Laboratory Research (1997 年提交)；Correale 等(1997)，Journal of the National Cancer Institute 89，第293頁。事實上這些抗原在廣泛的腫瘤類型中表達(dá)，例如黑素 瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌。其它適于與本發(fā)明的佐劑使用的腫瘤特異性抗原包括但不限制 于前列腺特異性抗原(PSA)或Her-2/neu、KSA(GA733)、MUC-I和癌胚抗原(CEA)。已經(jīng)提 出其它抗原作為泛癌治療抗原(pan-cancer therapeutic antigen)，其中包括酪氨酸酶和 Survivin。因此，在本發(fā)明的一方面，提供了包含依照本發(fā)明的一種佐劑組合物以及一種腫 瘤排斥抗原的疫苗。預(yù)計本發(fā)明的組合物將用于配制包含來自疏螺旋體物種的抗原的疫苗。例如，抗 原可以包括核酸、病原體衍生的抗原或抗原制備物、重組產(chǎn)生的蛋白或多肽以及嵌合融合 蛋白。尤其是所述抗原是OspA。所述OspA可以是借助于宿主細(xì)胞(大腸桿菌)的脂質(zhì)化 形式的完整成熟蛋白，名為(Lip0-OspA)，或者是非脂質(zhì)化的衍生物。這樣的非脂質(zhì)化衍生 物包括具有流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白(NSl)的頭81個N末端氨基酸以及完整OspA蛋白的非脂 質(zhì)化NSl-OspA融合蛋白，而另一種非脂質(zhì)化衍生物MDP-OspA是帶有3個額外N末端氨基 酸的非脂質(zhì)化形式OspA。本發(fā)明的疫苗可以用于預(yù)防或治療變態(tài)反應(yīng)。這樣的疫苗將包含變態(tài)反應(yīng)原特異 性抗原(例如Der pi以及花粉相關(guān)抗原)和變態(tài)反應(yīng)原非特異性抗原(例如stanworth 十肽)。在每一疫苗劑量中抗原量是根據(jù)在典型受接種者體內(nèi)引起免疫保護(hù)性反應(yīng)并 且沒有顯著副作用的量而選擇。這樣的量將根據(jù)所使用的是哪一種特定免疫原以及其如 何呈遞而有所不同。一般來說，預(yù)期每劑量將包含1-1000 μ g抗原，優(yōu)選1-500 μ g，優(yōu)選 1-100 μ g，最優(yōu)選1到50 μ g。對于特定疫苗的最佳量可以根據(jù)涉及觀察受實驗者體內(nèi)合適 的免疫反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)研究而確定。在初次接種(initial vaccination)后，受實驗者可以以 足夠間隔接受一次或幾次加強(qiáng)免疫(boosterimmimisation)。為給予人類，一般免疫刺激劑 含量為每劑量1 μ g-1000 μ g，優(yōu)選每劑量10 μ g_500 μ g，更優(yōu)選每劑量20 μ g_200 μ g，更 優(yōu)選每劑量20-100 μ g，最優(yōu)選每劑量10-50 μ g。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的佐劑和疫苗在藥中的應(yīng)用，具體地說是治療患有病原性 感染或癌癥或變態(tài)反應(yīng)或?qū)ι鲜鰻顩r易感的哺乳動物。還提供了本發(fā)明的佐劑及疫苗在生 產(chǎn)病毒感染、細(xì)菌感染、寄生蟲感染、變態(tài)反應(yīng)或癌癥的免疫預(yù)防藥物和免疫治療藥物中的 應(yīng)用。本發(fā)明的制劑可以用于預(yù)防目的以及治療目的。疫苗制備物在，，Vaccine Design-the subunit and adjuvantapproach"Powell, Μ. F.禾口 Newman,Μ· J.編輯；1995, PharmaceuticalBiotechnology (Plenum Press, New York and London, ISBN0-306-44867-X)中一般性描述。
本發(fā)明由下面的實施例舉例說明但不限于下面的實施例。實施例1，材料與方法血清學(xué)使用HBs (Hep 286)作為包被抗原，通過ELISA進(jìn)行抗HBs抗體的定量。每孔加入 50 μ 1抗原和抗體溶液。抗原在PBS中稀釋到1 μ g/ml的最終濃度，并于4°C下吸附到96孔 微量滴定板(Maxisorblmmuno-plate，Nunc. Denmark)的孔過夜。然后將所述板在37°C下用 含牛血清白蛋白和0. TWEEN 20的PBS (飽和緩沖液；100 μ 1/孔)溫育1小時。在 HBs包被的板中加入用飽和緩沖液成倍稀釋的血清(從100倍稀釋度開始)，并在37°C下 溫育1小時30分鐘。所述板用PBS0. 1% TffEEN 20洗四次，每孔加入在飽和緩沖液中稀釋 為1/1000的生物素偶聯(lián)抗小鼠IgGl、IgG2a、IgG2b或Ig(Amersham，UK)，并在37°C下溫育 1小時30分鐘。在沖洗步驟后，加入在飽和緩沖液中稀釋為1/5000的鏈霉抗生物素-生物 素?；^氧化物酶復(fù)合物(Amersham，UK)，并繼續(xù)在37°C下溫育30分鐘。如上洗板，并在 鄰苯二胺(Sigma)O. 04% H2O2 0. 03% 的 0. 1% TffEEN 20，0. 05M 檸檬酸鹽緩沖液 pH 4. 5 中 溫育20分鐘。用2N H2SO4終止反應(yīng)并在490/630nm讀數(shù)。采用SoftmaxPro (使用四參數(shù) 方程)根據(jù)對照計算ELISA滴度并表示為EU/ml。T細(xì)胞擴(kuò)增第二次免疫后兩周，處死小鼠，無菌操作取出脾置于池中。在含有2mM L-谷氨酰 胺，抗生素，5xl(T5 M 2-巰基乙醇以及同系正常小鼠血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(GIBCO) 中制備細(xì)胞懸浮液。脾細(xì)胞在含有不同濃度(10-0. 03 μ g/ml)HBs抗原的圓底96孔板的 200 μ 1中培養(yǎng)到2χ106細(xì)胞/ml的最終濃度。每個測試進(jìn)行四個平行實驗。在5% 0)2下37°0 培養(yǎng) 96 小時后，用 3H-胸苷(Amersham, UK,5Ci/mmol)以 0. 5 μ Ci/孔脈沖輸送(pulse) 18 小時，然后用細(xì)胞收集器收集在Unifilter板(Packard)上。在閃爍計數(shù)器(Topcount， Packard)中測量結(jié)合的放射性。結(jié)果以cpm表示(四個復(fù)孔的平均cpm)或表示為刺激數(shù) (stimulation indice)(帶有抗原的細(xì)胞培養(yǎng)物的平均cpm/沒有抗原的細(xì)胞培養(yǎng)物的平 均 cpm)ο細(xì)胞因子產(chǎn)生第二次免疫后兩周，處死小鼠，無菌操作取出脾置于池中(每組3池)。在含有2mM L-谷氨酰胺，抗生素，5x10_5M 2-巰基乙醇以及5%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(GIBCO) 中制備細(xì)胞懸浮液。脾細(xì)胞在含有不同濃度(10-0. 1 μ g/ml) HBs抗原的平底24孔板的Iml 中培養(yǎng)到5x IO6細(xì)胞/ml的最終濃度。96小時后收集上清液并凍存，直到通過ELISA測 試IFN γ和IL-5的存在。IFN Y 的產(chǎn)生使用Genzyme的試劑，通過ELISA進(jìn)行IFN γ的定量。每孔加入50 μ 1樣品和 抗體溶液。4°C下用50 μ 1在碳酸鹽緩沖液pH 9. 5中稀釋為1. 5 μ g/ml的倉鼠抗小鼠IFN Y包被96孔微量滴定板(Maxisorblmmuno-plate，Nunc，Denmark)過夜。然后將所述板在 37°C下用100μ 1含牛血清白蛋白和0. 1% TffEEN 20的PBS (飽和緩沖液)溫育1小時。 在抗IFN γ包被的板中，加入得自體外刺激的上清液在飽和緩沖液中的兩倍稀釋液(開 始于1/2)，并在37°C下溫育1小時30分鐘。所述板用PBS 0. 1% TWEEN(洗滌緩沖液)洗 四次，每個孔中加入在飽和緩沖液中稀釋到最終濃度0. 5μ g/ml的生物素偶聯(lián)山羊抗小鼠IFN γ，并在37°C下溫育1小時。在洗滌步驟后，加入在飽和緩沖液中稀釋為1/10000的 AMDEX偶聯(lián)物(Amersham)，在37°C下溫育30分鐘。如上洗板，并用50 μ ITMB(Biorad)溫 育10分鐘。用0. 4Ν H2SO4終止反應(yīng)并在450/630nm讀數(shù)。使用標(biāo)準(zhǔn)曲線(小鼠IFN γ標(biāo) 準(zhǔn))通過S0ftmaXPr0(四參數(shù)方程)計算濃度并表示為pg/ml。IL-5 的產(chǎn)生使用Pharmingen的試劑，通過ELISA進(jìn)行IL-5的定量。每孔加入50 μ 1樣品和抗 體溶液。4°C下用50μ1在碳酸鹽緩沖液ρΗ 9. 5中稀釋為1 μ g/ml的大鼠抗小鼠IL-5包 被96孔微量滴定板(Maxisorblmmuno-plate，Nunc，Denmark)過夜。然后將所述板在37°C 下用100μ 1含牛血清白蛋白和0. 1% TWEEN 20的PBS (飽和緩沖液)溫育1小時。在 抗IFN γ包被的板中，加入得自體外刺激的上清液在飽和緩沖液中的兩倍稀釋液(開始于 1/2)，并在37°C下溫育1小時30分鐘。所述板用PBS TffEEN 0. 1% (洗滌緩沖液)洗四次， 每個孔中加入在飽和緩沖液中稀釋到最終濃度1 μ g/ml的生物素偶聯(lián)大鼠抗小鼠IL-5，并 在37°C下溫育1小時。在洗滌步驟后，加入在飽和緩沖液中稀釋為1/10000的AMDEX偶聯(lián) 物(Amersham)，在37°C下溫育30分鐘。如上洗板，并用50 μ ITMB(Biorad)溫育15分鐘。 用0. 4Ν H2SO4終止反應(yīng)并在450/630nm讀數(shù)。使用標(biāo)準(zhǔn)曲線(重組小鼠IL-5標(biāo)準(zhǔn))通過 SoftmaxPro (四參數(shù)方程)計算濃度并表示為pg/ml。實施例2，小鼠中的免疫原性研究為測試MPL在不含抗原的固體顆粒載體上的作用原理(concept)，使用HABMPL疫 苗的不同配制順序在Balb/C小鼠中進(jìn)行免疫原性研究表1，疫苗組方 配制方法描述組1，在先技術(shù)的配制方法?？乖紫任接诮饘冫}上，隨后加入游離3D-MPL，導(dǎo) 致3D-MPL吸附于抗原所吸附的同一金屬鹽顆粒。組2和組3，本發(fā)明的配制方法。3D-MPL吸附于一種金屬鹽顆粒上，抗原吸附于分 離的金屬鹽顆粒，隨后將預(yù)吸附的復(fù)合物混合。免疫計劃用基于HAB的制劑(1/10人類劑量，即HAV 72ELU，HBs 2 μ g, MPL 5 μ g)以4周 間隔皮下免疫各組二次，每組10只小鼠。在第二次免疫后14天，用HBs和HAV體外再刺激 脾細(xì)胞后，分析淋巴組織增生反應(yīng)以及細(xì)胞因子產(chǎn)生(IL5/IFN y)0在第35天從眶后竇 (retroorbital sinus)取血，通過ELISA監(jiān)測對HBs和HAV的抗體反應(yīng)以及同種型分布型 誘導(dǎo)(isotypic profile induced)(僅 HBs)。結(jié)果通過ELISA測定體液反應(yīng)(Ig和同種型)，使用HBs作為包被抗原測量針對HBV的 體液反應(yīng)，使用Behring試劑盒測量針對HAV的體液反應(yīng)。僅分析第二次免疫后14天的 取血。


圖1顯示了在個體血清上測量的抗HBs Ig抗體反應(yīng)并表示為GMT。圖2顯示了由對匯集的血清分析計算出的同種型重新分布(IgGl、IgG2a和 IgG2b)。在組1和新型制劑(組2和組3)之間沒有觀察到在抗體滴度上的差異。此外，新 型制劑(組2和組3)刺激的IgGl和IgG2a/b同種型比例與由在先技術(shù)的制劑(組1)刺 激的IgGl和IgG2a/b同種型比例相似。細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在第二次免疫后14天，在用HBs或HA抗原體外再刺激脾細(xì)胞后，測定細(xì)胞介導(dǎo)的 免疫反應(yīng)(淋巴組織增生和IFN Y/IL-5產(chǎn)生)。對于每組小鼠，處死5只動物并收集脾以 用于體外測試。圖3顯示了在用HBs再刺激的脾細(xì)胞中監(jiān)測到的淋巴組織增生。圖4顯示了在用HBs再刺激的脾細(xì)胞中監(jiān)測到的細(xì)胞因子產(chǎn)生。在各制劑之間未能觀察到淋巴組織增生反應(yīng)的差異。此外，在所有組中觀察到強(qiáng)烈的IFN-Y (+/-1000pg/ml)反應(yīng)，在各組間未觀察到 IL-5產(chǎn)生的差異(低于60pg/ml)。結(jié)論在各HABMPL配制順序之間未觀察到對HBsAg的體液免疫反應(yīng)及細(xì)胞介導(dǎo)的免疫
反應(yīng)的顯著差異。實施例3，豚鼠的HSV接種前面的實施例證實了新型制劑及方法關(guān)于肝炎抗原的功效。本實施例研究經(jīng)典方 法與本發(fā)明的方法相比，用明礬和3D-MPL配制的單純皰疹病毒gD疫苗的免疫原性及保護(hù) 功效。用HSV豚鼠陰道內(nèi)保護(hù)模型比較這兩種疫苗。 實驗方法在第0天和第28天兩次免疫各組，每組12只雌性Hartley豚鼠。在第57天，陰 道內(nèi)用105pfu HSV2MS株(100 μ 1)攻擊動物。攻擊之后，從第4天到第12天每日監(jiān)測動 物初次疾病(primary disease)的臨床征兆。第二次免疫后，在第14天和第28天從眶后 竇取血，并通過ELISA監(jiān)測抗gD抗體反應(yīng)(IgG)。配制方法依照WO 92/16231中描述的技術(shù)產(chǎn)生來自HSV2的gD2t。3D-MPL購自Ribi ImmunoChem Inc. ,Montana, USA0 々1(0!1)3購自 Superfos。在第一次注射前 15 天制備制劑。 所有溫育在室溫及攪拌的條件下完成。
組4基于Al (OH) 3的制劑(250 μ 1/劑量)經(jīng)典途徑在加入MPL(12. 5yg)之前，使 gD2t(5yg)吸附于 125yg Al (OH)3 上 15 分鐘。 三十分鐘后，用10倍濃縮的PBS PH 7.4溶液緩沖所述制劑。15分鐘后，加入500 μ g/ml苯 氧基乙醇作為防腐劑。H2CHAl (OH) 3+Ag_15 分鐘-MPL-30 分鐘-10xPBSpH7. 4-15 分鐘-2 苯氧基組5基于Al (OH)3的制劑(250 μ 1/劑量)新途徑使gD2t (5 μ g)吸附100 μ g Al (OH) 315分鐘，并作為濃縮的單批(monobulk)貯存 起來。在另一方面，將MPL(12.5yg)吸附到25 μ gAl (OH)3上30分鐘，并作為另一濃縮單 批貯存起來。為進(jìn)行最后的配制，將吸附的gD2t稀釋于H2O以及10倍濃縮的PBS pH 7.4。 十五分鐘后，在加入苯氧基乙醇作為防腐劑前，加入吸附的MPL。Al (OH) 3+AgAl (OH) 3+MPLH2O+IOxPBS pH 7. 4+ 加入 gD2t_15 分鐘-加入 MPL-15 分鐘-2 苯氧基樣品定量使用gD 43B318作為包被抗原，通過ELISA進(jìn)行抗gD抗體的定量。每孔加入50 μ 1 抗原和抗體溶液?？乖赑BS中稀釋到1 μ g/ml的最終濃度，并于4°C下吸附到96孔微量 滴定板(Maxisorblmmuno-plate，Nunc. Denmark)的孔過夜。然后將所述板在37°C下用含
牛血清白蛋白和0. 1% TffEEN 20的PBS(飽和緩沖液)溫育1小時。在gD包被的板中 加入血清在飽和緩沖液中的兩倍稀釋液，并在37°C下溫育1小時30分鐘。所述板用PBS 0.1% TffEEN 20洗四次，每孔加入在飽和緩沖液中稀釋為1/10000的生物素偶聯(lián)抗豚鼠 IgG(Amersham,UK)，并在37°C下溫育1小時30分鐘。在沖洗步驟后，加入在飽和緩沖液中 稀釋為1/1000的鏈霉抗生物素-生物素?；^氧化物酶復(fù)合物(AmershamjK)，并繼續(xù)在 37°C下溫育30分鐘。如上洗板，并在鄰苯二胺(Sigma)O. 04% H2O2 0. 03%的0. 1% TffEEN 200. 05M檸檬酸鹽緩沖液pH 4. 5中溫育20分鐘。用2N H2SO4終止反應(yīng)，并在490/630nm讀 數(shù)。由參考通過SoflmaxPro (使用四參數(shù)方程)計算ELISA滴度并表示為EU/ml。統(tǒng)計分析使用UNISTAT對血清學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析適用于單因素方差分析的方法可以簡要描述如下1)對數(shù)據(jù)進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)化。2)對每個群體(組)進(jìn)行Kolmogorov Smirnov檢驗以檢驗其正態(tài)性 (normality)。3)進(jìn)行Hartley和Cochran檢驗以檢驗不同群體(組)間方差齊性。4)選定數(shù)據(jù)的方差分析第二次免疫后14天或第二次免疫后28天的數(shù)據(jù)。結(jié)果血清學(xué)圖5，顯示了在第二次免疫后對各個血清測量的抗gD IgG抗體反應(yīng)。在第二次免疫后14天(17090-18508EU/ml GMT)或第二次免疫后28天 (10227-11965EU/ml GMT)，在兩組制劑間沒有觀察到抗體滴度的顯著差異。由數(shù)據(jù)的對數(shù) 轉(zhuǎn)化后的兩個時間點，分別對兩種疫苗制劑引起的抗gD IgG滴度進(jìn)行單向因素方差分析。在兩種制劑間沒有檢測到統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異(對于第二次免疫后14天和第二次免疫后 28天的數(shù)據(jù)，ρ值分別等于0. 7397和0. 5078)。防護(hù)疾病在攻擊后4到12天，通過比較在已接種和未處理的動物中的幾個參數(shù)，評估對初 次疾病的防護(hù) 有和沒有病變(陰道或外部)動物的百分率。 如下計算每組的初次感染指數(shù)(PI)Σ (計數(shù)最大值X以％表示的發(fā)生率)。 表達(dá)為中值的病變計數(shù)總數(shù)(第4天到第12天)以及具有病變的動物數(shù)目(N)。 在第4天和第12天之間，對每組計算的平均累積數(shù)計算。表2病變參數(shù)的總結(jié)
16 *注射后第4天到第12天病變計數(shù)的總數(shù)(未考慮沒有病變的動物)。病變計數(shù) 無病變(0)，陰道病變(0. 5或1)，外部皮膚水泡(2、4、8或16)。
圖6顯示了 HSV攻擊后的累積損傷(lesion)計數(shù)曲線。高百分率的免疫后動物沒有出現(xiàn)任何病變(66%到83%)或陰道病變。與此相比， 89%的對照組動物顯示有外部病變。在免疫的動物觀察到初次感染指數(shù)的強(qiáng)烈降低(97%到99% )。這伴隨著與未處 理組相比(中值=28)，記錄到接種組的病變程度非常輕(中值=0. 5或1)。如累積計數(shù)曲線顯示，兩個組(4和5)都獲得非常好并且相當(dāng)水平的對初次疾病 的防護(hù)。結(jié)論比較了用于疫苗HSV疫苗制劑的舊方法和新方法。在IgG滴度或在對初次疾病的 防護(hù)上，在兩種方法之間沒有觀察到統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異。實施例4，小鼠的HPV接種就人乳頭瘤病毒E7抗原和3D-MPL引起抗原特異性體液反應(yīng)的能力，比較了它 們的不同配制順序(基于Al (OH)3或AlPO4)。對于在同一載體上混合吸附3D-MPL和蛋白 D1/3-E7的制劑(途徑1)以及其中3D-MPL單獨吸附于不含抗原的載體的制劑(途徑2)， 獲得了相當(dāng)?shù)腎g滴度。依照WO 99/10375的程序制備蛋白D 1/3 E7。所述抗原和MPL制 劑是基于Al (OH) 3的和基于AlPO4的。抗原和3D-MPL順序吸附到同一鋁鹽顆粒上(途徑1)，或在混合前分別吸附(途徑 2)。使用下面制劑免疫各組，每組10只小鼠(描述于材料與方法)Mτ ε(HO) IV 咭糊勒 Za ε/Τ Q^ojj S ng(Τ 揚票)ε(HO) IV 糊勒 IdW k 丄3 ε/Τ a^ojj S ng(C Sfi) IdW 明'OdIV 士糊勒導(dǎo)卷'ε(Η0) IV 士糊勒 ε/Τ Q^ojd S η S'OdIVzac/τ Q^OJJ S ng(T Sfi)'OdIV 糊勒 IdW k 丄3 ε/Τ a^ojj S ng(c )IdW rn ￡(HO) IV ^min^ ^Odivi^^za ε/τ sng箱ε (ho)τν-za ε/ia^ojjIdWZz (ho) IV -za ε/ia^ojj(idw/'odiv) ε (ho)τν-za ε/ia^ojj'odiv-za ε/ia^ojjidw/'odiv-za ε/τ q^ojj(idw/' (ho) iv) /'odiv-za ε/ia^o^dV0^a ε/ia^o^dOOσιO 1~I-I-H -I-HCM -I-HCO -I-H
通過肌肉內(nèi)途徑以21天間隔兩次免疫小鼠。在第35天(第二次免疫后14天) 收集血清并分析E7特異性抗體的存在(見材料與方法)。在第一次注射前5天制備制劑。 所有溫育在室溫攪拌的條件下完成。I.基于Al的制劑(50 μ 1/劑量)經(jīng)典途徑(途徑1)在加入MPL (5 μ g)之前，使 PDl/3E7(5y g)吸附 50 μ g Al(OH)3 或 A1P0430 分鐘。 三十分鐘后，用10倍濃縮的P04，NaCl PH 6. 8溶液緩沖所述制劑。15分鐘后，加入50 μ g/ ml硫柳汞作為防腐劑。H20+Al+Ag-30 分鐘-MPL-30 分鐘 _10xPNpH6. 8-15 分鐘-ThioII.基于Al的制劑(50 μ 1/劑量)新途徑(途徑2)使PDl/3E7(5y g)吸附10 μ g Al (OH) 3或A1P0430分鐘，并作為濃縮的單批貯存起 來。在另一方面，使MPL (5 μ g)吸附20 μ g Al (OH)3或々斤0430分鐘，并作為另一濃縮單批 貯存起來。為進(jìn)行最后的配制，在加入吸附的MPL和剩余Al (20 μ g)之前，將吸附的抗原稀 釋于H2O和10倍濃縮的P04，NaCl pH 6. 8的溶液中。十三(thirteen)分鐘后，加入50yg/ ml硫柳汞作為防腐劑。Al+AgAl+MPLH2O+IOxPN pH6. 8+ 加入 PD1/3E7+ 加入 MPL+A1-30 分鐘-Thio血清學(xué)使用E7 (Bollen)作為包被抗原，通過ELISA進(jìn)行抗E7抗體的定量。每孔加入 50 μ 1抗原和抗體溶液。抗原在碳酸鹽緩沖液ρΗ9. 5中稀釋到3 μ g/ml的最終濃度，并于 4°C下吸附到96孔微量滴定板(Maxisorb Immuno-plate, Nunc. Denmark)的孔過夜。然后將 所述板在37°C下用含牛血清白蛋白和0. 1% TffEEN 20的PBS(飽和緩沖液)溫育1小 時。在E7包被的板中加入血清在飽和緩沖液中的兩倍稀釋液(開始于1/100稀釋液)，并 在37°C下溫育1小時30分鐘。所述板用PBS 0. 1 % TffEEN 20洗3次，在每孔中加入在飽和 緩沖液中稀釋為1/5000的生物素偶聯(lián)抗小鼠(IgGl、IgG2a或IgG2b或)IgGtot (Amersham， UK)，并在37°C下溫育1小時30分鐘。在沖洗步驟后，加入在飽和緩沖液中稀釋為1/5000的 鏈霉抗生物素_生物素酰化過氧化物酶復(fù)合物(AmershanuUK)，并繼續(xù)在37°C下溫育30分 鐘。如上洗板，并用TMB (四甲基聯(lián)苯胺)溫育10分鐘。用4N H2SO4終止反應(yīng)，并在450nm 讀數(shù)。通過SoftmaxPro (使用四參數(shù)方程)計算中點稀釋度。結(jié)果通過ELISA對匯集的血清測量的抗E7Ig滴度以EU/ml表示，如下所示 當(dāng)比較基于Al (OH)3的制劑或基于AlPO4的制劑時，獲得相當(dāng)?shù)牡味?。與Al制劑獲 得的滴度5，000EU/ml相比，當(dāng)把MPL加入Al (OH) 3或AlPO4制劑時，滴度達(dá)到高于10，000EU/ ml。使用兩種配制順序獲得相當(dāng)?shù)牡味?。關(guān)于抗原和MPL誘導(dǎo)抗原特異性抗體產(chǎn)生的能力，比較了配制的各種順序(基于
20Al (OH) 3 或 AlPO4) 所有包含MPL的制劑都誘導(dǎo)比明礬制劑更高水平的E7特異性Ig。使用MPL和 PD1/3-E7混合吸附于同一載體上的制劑(途徑1)和其中MPL單獨吸附于不含抗原的載體 上的制劑(途徑2)，獲得了相當(dāng)?shù)腎g滴度。
圖1顯示了對各個血清測量的抗HBs Ig抗體反應(yīng)并表示為GMT。
圖2顯示了由對匯集血清的分析計算出的同種型重新分布(IgGl、IgG2a和IgG2b)。
圖3顯示了在用HBs再刺激脾細(xì)胞后監(jiān)測到的淋巴組織增生。
圖4顯示了在用HBs再刺激脾細(xì)胞后監(jiān)測到的細(xì)胞因子產(chǎn)量。
圖5顯示了抗HSV gD滴度(見實施例3)。
圖6顯示了平均累積HSV損傷計數(shù)(見實施例3)。
權(quán)利要求
包含吸附于金屬鹽顆粒上的免疫刺激劑的佐劑組合物，其特征在于所述金屬鹽顆粒基本不含其它抗原。
2.權(quán)利要求1要求保護(hù)的佐劑組合物，其中所述金屬鹽顆粒是鋁鹽、鋅鹽、鈣鹽、鈰鹽、 鉻鹽、鐵鹽或鈹鹽。
3.權(quán)利要求1或2要求保護(hù)的佐劑組合物，其中所述金屬鹽是磷酸鹽或氫氧化物。
4.權(quán)利要求1到3中任一項要求保護(hù)的佐劑組合物，其中所述金屬鹽是氫氧化鋁或磷酸鋁。
5.權(quán)利要求1到4中任一項要求保護(hù)的佐劑組合物，其中所述免疫刺激劑是單磷酰脂 質(zhì)A。
6.權(quán)利要求5要求保護(hù)的佐劑組合物，其中所述單磷酰脂質(zhì)A衍生物是3-脫氧?；瘑?磷酰脂質(zhì)A。
7.權(quán)利要求1到4中任一項要求保護(hù)的佐劑組合物，其中所述免疫刺激劑是QS21。
8.權(quán)利要求1到4中任一項要求保護(hù)的佐劑組合物，其中所述免疫刺激劑是包含寡核 苷酸的CpG。
9.生產(chǎn)疫苗組合物的方法，該方法包括將權(quán)利要求1描述的佐劑組合物與抗原混合。
10.權(quán)利要求9要求保護(hù)的生產(chǎn)疫苗組合物的方法，其特征在于所述抗原吸附于金屬 鹽顆粒上。
11.權(quán)利要求9或10中任一項要求保護(hù)的方法，其中所述抗原選自衍生自人免疫缺 損病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、1型單純皰疹病毒、2型單純皰疹病毒、人巨細(xì)胞病毒、登革病 毒、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎或戊型肝炎、呼吸道合胞病毒、人乳頭瘤病毒、流感病毒、 Hib、腦膜炎病毒、沙門氏菌屬、奈瑟氏菌屬、疏螺旋體屬、衣原體屬、博德特氏菌屬、瘧原蟲 屬或弓形蟲屬的抗原、Ig E肽、Der pi、花粉相關(guān)抗原；或腫瘤相關(guān)抗原(TMA)、MAGE、BAGE、 GAGE、MUC-I、Her-2neu、LnRH (GnRH)、CEA、PSA、KSA 或 PRAME。
12.包含兩組主要復(fù)合物的疫苗組合物，第一組復(fù)合物包含(a)吸附于一種金屬鹽顆 粒上的免疫刺激劑，其特征在于所述金屬鹽顆?；静缓乖?；第二組復(fù)合物包含(b)吸 附于一種金屬鹽顆粒上的抗原。
13.包含兩組主要復(fù)合物的疫苗組合物，第一組復(fù)合物包含(a)吸附于一種金屬鹽顆 粒上的免疫刺激劑，其特征在于所述金屬鹽顆粒基本不含抗原；第二組復(fù)合物包含(b)吸 附于一種金屬鹽顆粒上的抗原，特征在于所述金屬鹽顆?；静缓瑔瘟柞Ｖ|(zhì)A或其衍生 物。
14.權(quán)利要求12或13要求保護(hù)的疫苗組合物，其中在所述第一組復(fù)合物和所述第二組 復(fù)合物中存在的金屬鹽是相同的。
15.權(quán)利要求12到14中任一項要求保護(hù)的疫苗組合物，其中所述第二組復(fù)合物包含多 種亞復(fù)合物，每種亞復(fù)合物包含吸附于金屬顆粒上的不同抗原。
16.權(quán)利要求12到15中任一項要求保護(hù)的疫苗組合物，其中所述金屬鹽是鋁鹽、鋅鹽、 鈣鹽、鈰鹽、鉻鹽、鐵鹽或鈹鹽。
17.權(quán)利要求16要求保護(hù)的疫苗組合物，其中所述金屬鹽是磷酸鹽或氫氧化物。
18.權(quán)利要求17要求保護(hù)的疫苗組合物，其中所述金屬鹽是氫氧化鋁或磷酸鋁。
19.權(quán)利要求12到18中任一項要求保護(hù)的疫苗組合物，其中所述免疫刺激劑是3-脫氧?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A。
20.權(quán)利要求12到18中任一項要求保護(hù)的疫苗組合物，其中所述免疫刺激劑是QS21。
21.權(quán)利要求12到18中任一項要求保護(hù)的疫苗組合物，其中所述免疫刺激劑是CpG。
22.權(quán)利要求12到21中任一項要求保護(hù)的疫苗組合物，其中所述抗原選自人免疫 缺損病毒、水痘_帶狀皰疹病毒、I型單純皰疹病毒、2型單純皰疹病毒、人巨細(xì)胞病毒、登 革病毒、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎或戊型肝炎、呼吸道合胞病毒、人乳頭瘤病毒、流感 病毒、Hib、腦膜炎病毒、沙門氏菌屬、奈瑟氏菌屬、疏螺旋體屬、衣原體屬、博德特氏菌屬、瘧 原蟲屬或弓形蟲屬、stanworth十肽、Derpl、花粉相關(guān)抗原；或癌癥相關(guān)抗原、MAGE、BAGE, GAGE、MUC-U Her-2neu, LnRH(GnRH)、CEA, PSA、酪氨酸酶、Survivin、KSA、或 PRAME。
23.權(quán)利要求22要求保護(hù)的疫苗組合物，其中所述抗原是甲型肝炎抗原和乙型肝炎抗 原的組合。
24.權(quán)利要求22要求保護(hù)的疫苗組合物，其中所述瘧原蟲抗原是選自以下的一種或多 種抗原RTS、S和TRAP。
25.權(quán)利要求22要求保護(hù)的疫苗組合物，應(yīng)用于藥物(medicine)。
26.權(quán)利要求22要求保護(hù)的疫苗組合物的用途，用于生產(chǎn)病毒感染、細(xì)菌感染、寄生蟲 感染、變態(tài)反應(yīng)或癌癥的免疫治療性藥物。
27.治療患有病原體感染或癌癥或變態(tài)反應(yīng)或?qū)@類疾病易感的哺乳動物的方法，包 括給予安全有效量的依照權(quán)利要求22的疫苗組合物。
28.包括兩個容器的試劑盒，其中一個容器盛有吸附到金屬鹽上的單磷酰脂質(zhì)A或其 衍生物；第二個容器盛有吸附到金屬鹽上的抗原。
全文摘要
佐劑系統(tǒng)及疫苗。本發(fā)明提供疫苗以及包含免疫刺激劑和金屬鹽的佐劑制劑。所述免疫刺激劑吸附于金屬鹽顆粒上，得到的顆?；静缓乖?。
文檔編號A61P37/04GK101926993SQ20091017316
公開日2010年12月29日 申請日期1999年10月8日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月16日
發(fā)明者N·加康 申請人:史密絲克萊恩比徹姆生物有限公司